Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Betere voorbereiding en Conservering van hippocampus Mouse Slices voor een zeer stabiele en reproduceerbare opname van langlopende Potentiëring

Published: June 26, 2013 doi: 10.3791/50483
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neurosciences, Research Institute for Biosciences, University of Mons

Summary

Dit document presenteert een complete methodiek voor te bereiden en te bewaren

Abstract

Lange termijn potentiëring (LTP) is een vorm van synaptische plasticiteit gekenmerkt door een toename in kracht en synaptische verondersteld betrokken te zijn bij het geheugen codering. LTP opgewekt in het CA1 regio acute hippocampale plakken is uitgebreid bestudeerd. Maar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de onderhoudsfase van dit fenomeen nog steeds slecht begrepen. Dit kan gedeeltelijk te wijten aan de verschillende experimentele omstandigheden die door verschillende laboratoria. Inderdaad, de onderhoudsfase LTP is sterk afhankelijk van externe parameters zoals zuurstof, temperatuur en vochtigheid. Het is ook afhankelijk van interne parameters zoals oriëntatie van het vlak snijden en levensvatbaarheid segment na dissectie.

Het optimaliseren van deze parameters kan de inductie van een reproduceerbare en stabiele zeer lange termijn potentiëring. Deze methode biedt de mogelijkheid om de moleculaire mechanismen betrokken bij de stabiele stijging verder onderzoekenin synaptische sterkte in hippocampale plakken. Het benadrukt ook het belang van experimentele condities in in vitro onderzoek naar neurofysiologische verschijnselen.

Introduction

Tegenwoordig is er weinig begrip van hoe complexe herinneringen worden opgeslagen en opgeroepen bij de neuronale circuit niveau. Echter, een verenigende hypothese geheugenopslag is vrij en breed geaccepteerde: geheugen worden opgeslagen als veranderingen in de sterkte van synaptische verbindingen tussen neuronen in het centrale zenuwstelsel. Op zijn eigen, heeft het onderzoek naar de synaptische plasticiteit ruimschoots geprofiteerd van twee baanbrekende ontdekkingen. (1) In een rudimentaire experiment, Bliss en Lomo 1, met het intact verdoofde konijn, vond dat de levering van een korte hoogfrequente (1 sec, 100 Hz) stimulatie van de perforant pad van de hippocampus veroorzaakte een langdurige (enkele uur) toename in de gerelateerde synaptische verbindingen. Dit fascinerende fenomeen werd genoemd "Long-Term Potentiëring" of LTP door Douglas en Goddard in 1975 2. (2) Later werd vastgesteld dat een soortgelijk verschijnsel kan worden geactiveerd in hersenenplakken (0,4 mm) kunstmatig in leven gehouden in vitro in vitro waargenomen door het leveren van een of meerdere tetani een bundel van axons (de zogenaamde Schaffer collateralen) tijdens het opnemen van het resulterende veld prikkelende synaptische potentieel opgeroepen in de piramidale neuronen van de zogenaamde CA1 regio. De mechanismen van LTP inductie zijn grotendeels geopenbaard. Kortom, een Ca2 + influx door NMDA receptoren activeert enzymen twee gevolgen: a fosforylering van AMPA receptoren (die de efficiëntie verhoogt) en een opname van extra AMPA receptoren in het postsynaptische membraan 3. Daarentegen, de mechanismen van de onderhoudsfase LTP grotendeels onbekend, vooral omdat het experimenteel veel moeilijker om een ​​stukje gezonde vele uren dan gedurende 30 tot 60 minuten behouden.

Veel studies zijn gewijd aan het begrip van mechanismen en LTP interessante theorieën zijn uitgewerkt in de jaren 4-11. Maar until nu, hebben de precieze moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de stabiele toename van synaptische sterkte niet opgehelderd. Dit zou deels te wijten aan de moeilijkheid om eerdere resultaten te reproduceren in verschillende laboratoria met verschillende technieken voor het opstellen en het onderhoud van de hippocampus plakjes. In hun methodologiedocument, Sajikumar et al.. 12 benadrukte het belang van experimentele omstandigheden voor de bereiding van de rat hippocampale plakken en de registratie van stabiele LTP. In deze video presenteren we alle optimalisatiestappen in ons laboratorium ontwikkeld in de jaren kunnen een zeer stabiele LTP opnemen in muis hippocampale plakken.

Deze optimalisatie is gemaakt van protocollen ontwikkeld en met succes gebruikt door andere laboratoria die LTP mechanismen bestuderen in muizen en ratten 13 11. Hiermee ervaren onderzoekers voor inductie en nemen een zeer langdurige LTP in volwassen muizen met een hoge mate van succes. De physiological basis van de geïnduceerde LTP werd zorgvuldig gecontroleerd en aangetoond 14. In deze methodiek papier, tonen wij aan dat alle wijzigingen van de experimentele omstandigheden, zoals temperatuur of oxygenatie een diepgaande invloed op LTP onderhoud kan hebben terwijl de dissectie procedure kan diep wijzigen plakjes prikkelbaarheid. Het moet worden benadrukt dat de precieze controle van al deze parameters vereist een opleiding van enkele maanden voor beginnende studenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health regelgeving voor de verzorging en het gebruik van dieren in onderzoek en met instemming van de lokale ethische commissie uitgevoerd.

1. Bereiding van kunstmatige cerebro-spinale vloeistof

Dezelfde media gebruikt te ontleden, knippen en plakken perfuseren (1 ml / min) gedurende de rustperiode en de elektrofysiologische opnames. Dit medium bestaat uit 124 mM NaCl, 4,4 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1 mM NaH 2PO 4, 2,5 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4 en 10 mM D-glucose.

  1. Weeg de verschillende componenten voor 2 L van ACSF behalve MgSO4 die reeds in oplossing (1M). Met behulp van een standaard oplossing maakt het mogelijk om zeker te zijn van de precieze concentratie van Mg 2 + omdat MgSO4 in poedervorm is sterk hygroscopisch. Ca2 +: Mg2 + verhouding grote invloed LTP inductie en onderhoud14 en zo hun verhoudingen moeten altijd worden gerespecteerd.
  2. Doe alle onderdelen behalve CaCl2 in een glazen maatcilinder en breng aan 2 L met gedestilleerd H 2 O.
  3. Roer krachtig. Als alles is opgelost, voeg carbogen door een aquarium borrelaar en slangen aangesloten op de tank (95% O 2, 5% CO 2). Wacht enkele minuten en voeg calciumchloride bij pH is vastgesteld op 7,4 door de inwerking van bicarbonaatbuffer.
  4. Houd 600 ml in een gekoelde rechthoekige glazen schaal en afkoelen tot 4 ° C met ijs rond het gerecht. Dit medium wordt gebruikt voor dissectie hippocampus.
  5. Filter de resterende 1400 ml en bewaar in een erlenmeyer.

2. Voorbereiding van de elektrofysiologische Rig en de Brain Slice Recording Kamer

De perfusiecircuit is gemaakt van 2 peristaltische pompen, pompen vers vloeistof uit een reservetank en de andere pompende gebruikte vloeistof uit thij opneemt kamer naar een bak. Verse vloeistof wordt toegevoegd aan een home-made perfusie systeem waar het wordt opnieuw zuurstofrijk en opgewarmd voordat de interface opname kamer door de zwaartekracht (Figuur 1A). De interface opname kamer is ontworpen door FST (Fine Science Tools, Vancouver, Canada, Figuur 1B). Weefselcoupes worden gebracht geweven net filter bevestigd aan een verwijderbare goed ring filters kunnen onder omstandigheden-interface worden gehandhaafd door de hoogte van de pompput naald. A home-made plastic buis geblokkeerd op het einde en lateraal geperforeerd (0,5 mm) is bevestigd aan de zuig naald niveau stabiliteit in de kamer. De opname kop is boven een waterbad met een gas dispersie steen die zorgt voor het behoud van een vochtige omgeving door het passeren van vochtige lucht door doorbuiging havens in de schrijfkop (om water druppelvorming verlagen) gemonteerd. Bad en middelgrote temperatuur worden geregeld door continu variëren van de hoogte van gelijkstroom thruwe een siliconenrubber-ingebed verwarmingselement in het waterbad. Thermistors in het waterbad en opname putten kan de kamertemperatuur in te stellen en nauwkeurig gecontroleerd op deze sites.

Het verwarmingssysteem van de kamer wordt afgesloten met een globale verwarming regelen van de temperatuur van de hele rig. De software is ontwikkeld door onderzoekers aan de Universiteit van Edinburgh ( www.etcsystem.com ) bewaakt en egaliseert de temperatuur van de zuurstofrijke lucht, de hersenen slice, de elektroden en de overige tuig die een stabiele omgeving voor langdurige opnames (figuur 1C) . De gebruikte temperatuur voor muizen hippocampale plakken is 28 ° C.

  1. Spoel alle perfusie circuit met gedestilleerd H2O minimaal 20 minuten en start de verwarmingssystemen.
  2. Start de carbogen borrelen in het circuit. Carbogen komt in de zelfgemaakte perfunderen buizen door fIlter kaarsen en in het waterbad onder de opname kamer. De stroomsnelheid in het waterbad wordt gecontroleerd door een stromingsmeter. Als het debiet te traag is, kan weefsel hypoxie geworden. Omgekeerd, indien de stroomsnelheid te hoog is, kan het gas niet voldoende verwarmd en bevochtigd leidt tot uitdroging van het weefsel. Hoge gasstroom kan ook de kans op water sproeien over het weefsel uit het waterbad hieronder leidt tot osmotische shock. Dit kan worden voorkomen door toevoeging van stukjes nylon mesh (100 urn) en de uitlaat van de afbuiging poorten.
  3. Tap het circuit en vullen met gefilterd ACSF.
  4. Zet de ring die het schijfje zullen ondersteunen bij het houden van ruimte. Een geweven net filter met maaswijdte variërend 500-750 urn wordt uitgerekt en bevestigd aan de ring twee-componenten epoxy hars lijm. De geweven netto filter is gemaakt van 87% polyamide en 13% elastaan ​​(panty 15 den). Lijm moet zorgvuldig worden toegepast om de vorming van reliëfs voorkomen aan het oppervlak van de ring.
  5. Verwijder alle luchtbellen zorgvuldig uit het circuit.
  6. Pas het niveau van ACSF in de opname kamer met de schroef van de zuigkracht naald. De snelheid van de peristaltische pomp wordt ingesteld op 1 ml / min voor de pomp inlaat en 5 ml / min voor de uitlaat pomp.

De perfusie-systeem wordt op een stijve bestand tegen trillingen tafel geplaatst en wordt omgeven door een kooi van Faraday.

3. Voorbereiding van de Dissection Area

Chirurgische instrumenten: een scalpel met een # 11 mes, kleine standaard ontleden schaar, de lente schaar, gebogen pincet, twee Heidemann spatulae en een lepel.

Aanvullend materiaal: een guillotine, een onderlegger, een McIlwain weefsel chopper met een scheermesje, filterpapier, een glas Pasteur pipet met een rubberen speen, 2 plastic pasteurpipetten waarvan een met een brede mond, een petrischaaltje, een metalen cilinder van 7 mm diameter (figuur 2A).

    (Figuur 2A).
  1. Lay out instrumenten in volgorde van gebruik. Voeg drie lagen filterpapier op het weefsel chopper plaat en een nieuwe scheermesje gereinigd met gedestilleerd water en ether (figuur 2B). Het scheermesje moet horizontaal zijn als het het papier raakt. Mesdruk wordt aangepast aan de helft van de maximale waarde en snelheid ongeveer een derde van de maximale waarde.
  2. Aandachtig kijken of alles klaar is (instrumenten, temperatuur ...) omdat je tijd niet achteraf hebben.
  3. Vraag iemand om de ontleding te spuiten met een Pasteur pipet gevuld met koud ACSF.
  4. Verdoven de muis met Nembutal IP (100 mg / kg) voor onthoofding. Halothaan anesthesie worden gebruikt. We hebben beide methoden en obta vergelekenined dezelfde resultaten. Onthoofding moet onder verdoving uitgevoerd maar cervicale dislocatie kan ook worden gebruikt. Cervicale dislocatie heeft echter een zeer goede gewoonte om dierenleed te voorkomen.
  5. Ontleden de onderlegger zo snel mogelijk onder koude ACSF continue douche.

4. Brain Verwijdering

  1. Terwijl nog steeds de kop met de wijsvinger en de duim van een hand op de snuit, een insnijding met ontleden schaar langs het midden van de bovenkant van de kop vanaf de rand van de guillotine gesneden en actief rostraal aan de frontale bot .
  2. Knip de huid spier aan weerszijden van de kop van de schedelplaten volledig zichtbaar en verwijder de spieren aan de caudale kant van de weg.
  3. Met het ontleden schaar, knip de temporalis spier aan elke kant, langs de temporalis plaat, knip dan de frontale platen in het midden, dwars. Maak dan een kleine snee in de occipitale bot, tussen de twee plates.
  4. Voor elke zijde, gesneden aan de caudale basis van de occipitale platen.
  5. Knip langs de pijlnaad met veer schaar.
  6. Met een pincet, verwijder de schedel helften door het verspreiden van hen weg van elkaar.
  7. Met de scalpel, dwars gesneden net na de reukbol en net voordat het cerebellum dompelen vervolgens de uitgepakte hersenen in het ontleden schotel met koud ACSF.

5. Hippocampus Dissection

  1. Zodra de hersenen wordt ondergedompeld in het ontleden schotel, scheiden de twee hersenhelften van elkaar met een scalpel gestoken in het midden.
  2. De dissectie van de hippocampus wordt uitgevoerd met spatulae onder visuele controle door een binoculair chirurgische microscoop (X25, figuur 2A). Aan de ene hemisfeer, voorzichtig uit de structuren aan de laterale ventrikel zien. Verwijder de hersenstam en diencephalon. Dit gebeurt door toepassing van de spatulae de frontale cortex aan de ene kant en het diencephalon op deandere zijde. Zorg ervoor dat de hippocampus niet aan met de spatulae en niet uitrekken tijdens weefsel snijden.
  3. Sever de fornix en duw voorzichtig de hippocampus van de cortex (wegrollen), door het invoegen van een spatel in het ventrikel.
  4. Wanneer de hippocampus wordt gewonnen, verwijder overtollig cortex weefsel en resterende bloedvaten.

6. Het snijden van de Slices

  1. Met een brede mond plastic Pasteur pipet de hippocampus in een lepel met zijn alvear oppervlak naar boven (bolle zijde).
  2. Verwijder overtollig vocht met een standaard plastic Pasteur pipet.
  3. Tip de lepel verticaal bijna aanraken van het filterpapier van de chopper (Figuur 2B) en drop off van de hippocampus van de lepel, door snel het aanraken van het filterpapier verplaats dan de lepel terug.
  4. Oriënteer de hippocampus en snijd het dwars op 400 pm met de helikopter (zie figuur 2C voor oriëntatie van de hippocampus ten opzichte van het scheermesje). Zo snel mogelijk te handelen.
  5. Verwijder het filter papier met de plakjes hippocampus en wikkel het rond de metalen cilinder op de plakjes een beetje spreiden. Vervolgens, gratis de plakjes met sprays van ACSF met behulp van een standaard plastic Pasteur pipet en verzamel ze in een petrischaal gevuld met koud ACSF.

7. Incubatie van Slices in Interface

  1. Selecteer plakjes met een standaard plastic Pasteur pipet en snel plaats ze in de opname kamer. Segmenten herstellen van de dissectie trauma direct in de opname kamer, in de interface bij 28 ° C.
  2. Het schijfje zal waarschijnlijk wastafel. Verlaag het vloeistofniveau aan de slice niveau te bereiken, en vervolgens te verhogen om het te laten zweven.
  3. Draai het segment in de juiste positie terwijl het verlagen van het niveau. Plakjes altijd georiënteerd op dezelfde manier aan de positionering van de elektroden (2 stimuleren en een registrerende elektroden) in het CA1 gebied vergemakkelijken.
  4. Stop wanneerhet fluïdum in de interface. A "meniscus" van media over de slice is indicatief voor een voldoende media. De netto-filter moet worden verzadigd met media, maar niet volledig ondergedompeld.
  5. Houd de kamer bedekt met filtreerpapier geplaatst over het geperforeerde deksel.
  6. Laat de plak rust ten minste 1,5 uur bij 28 ° C.

8. Registratie van Synaptic Responses

  1. Opnemen elektrode: glas haarvaten worden getrokken om een ​​tip weerstand van 2-5 MQ verkrijgen wanneer gevuld met ACSF. Een klein stukje filtreerpapier geplaatst rond de punt van de elektrode en botwas wordt uitgeoefend op het uiteinde dat condens. Stimulatie-elektroden: platina-iridium bipolaire cluster elektroden met een 12,5 micrometer diameter worden gekocht van FHC (USA). Met de juiste zorg, kan elke elektrode minstens 30 keer (Figuur 1B) worden gebruikt.
  2. Plaats de elektroden in het stratum radiatum van CA1 regio, de elektroden gevoerdup (Figuur 3A). Elektroden neergelaten 75-150 urn onder het oppervlak van het segment met Narishige micromanipulators. De twee stimulatie-elektroden worden geplaatst op twee verschillende bundels van Schaffer collateralen stimuleren. Wanneer de elektroden worden neergelaten op het schijfje, zijn papieren filters zorgvuldig geplaatst rondom aan de kamer te sluiten.
  3. Bifasische stimulatie (0,08 msec pulsduur per halve golf) wordt uitgevoerd bij constante spanning met een Grass stimulator aangesloten op SIU-V isolatie-eenheden. Maximale respons wordt gecontroleerd door het verhogen stimulusintensiteit van 2 V tot maximaal 12 V. Field EPSPs worden versterkt 1000 keer met een WPI ISO-80 versterker en gefilterd bij 10 Hz en 10 kHz. Het signaal wordt vervolgens naar een computer die via een National Instrument A / D converter. Stimulatie, data-acquisitie en-analyse worden uitgevoerd met behulp van het WinLTP programma ( www.winltp.com ). Field EPSPS worden tegen 40% van de maximale amplitude verkregen in een input-outzet curve. Voor elk segment worden de fEPSP hellingen genormaliseerd ten opzichte van de gemiddelde helling over de 30 minuten voorafgaand aan LTP inductie.
  4. LTP wordt geactiveerd door een enkele trein van stimulatie (100 Hz) en proef sterkte van een pathway terwijl de tweede route dient als controle.

9. Reinigen van de Setup

  1. Spoel alle circuit met een 3% oplossing van waterstofperoxide (H 2 O 2) ten minste 10 minuten, laat ze uitlekken. Het circuit zal zorgvuldig worden gespoeld met gedistilleerd water voordat u begint met een experiment. Het gebruik van H 2 O 2 is niet absoluut noodzakelijk als andere laboratoria alleen met gedestilleerd water voor het reinigen, maar we de afzetting van donkere resten in de slang systeem hebben gemerkt bij het ​​gebruik van alleen water.
  2. Vervang het water in het waterbad onder de opname kamer.
  3. Bad de stimulatie-elektroden tips in alcohol gedurende 5 minuten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deze methode werd gebruikt om de eigenschappen van langdurige lange termijn potentiëring geïnduceerd acute hippocampale plakken van volwassen C57BL/6J-muizen (JANVIER SAS, Frankrijk) 14 geanalyseerd. Verrassend genoeg heeft de verbetering van de experimentele omstandigheden leidden tot een nieuwe manier van kijken naar LTP. We toonden aan dat langdurige verhoging van de synaptische sterkte de synthese van nieuwe eiwitten niet nodig was.

Hier laten we zien dat LTP inductie afhankelijk plakjes levensvatbaarheid en prikkelbaarheid. Wanneer dissectie van de hippocampus was te langzaam of te schadelijk, plakjes prikkelbaarheid verhoogd en polysynaptic reacties kunnen worden waargenomen na LTP inductie (Figuur 3B). In dit geval LTP inductie was veel minder effectief en versterking niet gehandhaafd.

We willen dat, zelfs in plakken ogenschijnlijk gezonde, technische omstandigheden hebben een grote invloed op de duur van de LTP geïnduceerd door een enkele benadrukkentrein stimulatie. In eerdere publicaties onze groep toonde dat een kortdurende LTP kan worden omgezet in een langdurige een voor het modificeren van de herstelomstandigheden van het segment 15. Dan jaar dagelijkse praktijk waargenomen dat opeenvolgende verbeteringen in onze techniek hebben geleid tot een progressieve toename van de duur van de LTP geïnduceerd door een trein in standaardomstandigheden. Inderdaad, opnames gemaakt in 2005 toonde een kortdurende LTP terug te gaan naar de uitgangswaarde binnen 3 uur (figuur 3C, gevulde cirkels). Wijzigingen in de dissectie procedure verminderen weefsel rekken hebben het mogelijk gemaakt om een LTP volgehouden gedurende 6 uur 16 (figuur 3C, gevulde vierkantjes) te verkrijgen. Tenslotte verbeteringen in de interface oxygenatie en temperatuurregeling in combinatie met standaardisatie elektrode hebben geleid tot een LTP stabiel meer dan 8 uur (figuur 3C, open cirkels). Het verschil tussen de drie groepen significant (one-way ANOVA, F (2,20) = 49,5, p <0,001).

Bovendien, elke wijziging van de temperatuur of oxygenatie veroorzaakte een toename of een afname van de synaptische respons (Figuur 4). De controle van deze parameters werd gecontroleerd door altijd twee stimulatie-elektroden. LTP is induceerde een bundel van Schaffer collateralen terwijl andere bundel werd gebruikt als een interne controle van synaptische stabiliteit sterkte.

Figuur 1
Figuur 1. Elektrofysiologische rig en de hersenen slice opname kamer. (A) Perfusie circuit met zelfgemaakte zwaartekracht perfusiesysteem alimented door een peristaltische pomp, geïsoleerde stimulatie eenheden (twee per elektrode), chirurgische microscoop en opname kamer. (B) Interface opname kamer met het stimuleren enregistrerende elektroden. Filterpapier zijn verwijderd uit het deksel van de ring het segment ondersteunende bekijken. (C) Besturingseenheid met 2 stimulatoren, oscilloscoop, A / D omzetter, temperatuurcontrole software en WinLTP software.

Figuur 2
Figuur 2. Gereedschap en materiaal dat wordt gebruikt voor de hippocampus snijden. (A) Dissection schaaltje met gekoelde ACSF en chirurgische microscoop. Scalpel gemonteerd met een # 11 mes, kleine standaard ontleden schaar, de lente schaar, gebogen pincet, twee Heidemann spatulae, lepel, 2 plastic pasteurpipetten waarvan een met een brede mond, petrischaal, metalen cilinder van 7 mm diameter en ring, die steunt het schijfje in de opname kamer. (B) McIlwain weefsel chopper. (C) Tekenen en fotograferen of de linker hippocampus in positie voor snijden. De oriëntatie van het scheermes wordt aangegeven door de rode stippellijn. Omvang van het dradenkruis:. 1 mm Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3
Figuur 3. Inductie van LTP in hippocampale plakken. (A) Schema van de twee onafhankelijke ingangen synaptische S1 en S2 op dezelfde neuronale populatie. In elk segment werden twee stimulatie-elektroden (S1 en S2) opgezet. S1 traject werd gebruikt om LTP induceren, terwijl S2 weg fungeerde als controle. (B) Monster fEPSP sporen van afzonderlijke experimenten in een perfect gezonde slice (links) en een plak ze een hoge mate van prikkelbaarheid (rechts). Ze zijn opgenomen gewoon bef erts de LTP inductie (rode sporen) en een uur na LTP inductie (blauwe sporen). Wanneer schijfjes zijn niet perfect gezond (rechts), polysynaptic reacties worden waargenomen en fEPSP helling potentiëring wordt verminderd. (C) vergelijking van het tijdsverloop van de fEPSP helling na LTP geïnduceerd door een enkele trein van hoogfrequente stimulatie (100 Hz, 1 sec) in 2005, 2010 en 2011 in ons laboratorium. Eerste experimenten werden in 2005 (gevulde cirkels, n = 11). Latere opnamen (Villers, et al.. 2010) geprofiteerd van een verbeterde dissectie procedure (gevulde vierkanten, n = 6). Voor deze resultaten niet door optimalisering interface zuurstof en temperatuur met normalisatie elektrode (open cirkels, n = 6). hier grotere afbeelding te bekijken .

/ Files/ftp_upload/50483/50483fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50483/50483fig4.jpg "/>
Figuur 4. Variatie van fEPSP helling als functie van de temperatuur en zuurstof stroomsnelheid. (A) Het verhogen van zuurstof debiet in een waterbad onder de opname kamer 0,15-0,25 L / min (blauwe curve) induceert een daling fEPSP helling van 20% (roze curve). (B) Het verhogen van de temperatuur van 28-29 ° C (groene curve) induceert een stijging van meer dan 50% in fEPSP helling (roze curve). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We hebben in ons laboratorium ontwikkelde een protocol van gecombineerde methoden ontwikkeld en gebruikt door andere laboratoria hebben van een grote deskundigheid op LTP opnamen 11,17. Dit protocol is aangepast om volwassen muis hippocampus en kan worden gebruikt bij dieren van elke leeftijd en elk achtergrond genotype. Ook kan de analyse van LTP in transgene muizen ontwikkelen van neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer 18,19.

Gebruik van dit protocol voor rat hippocampale plakken noodzakelijk kunnen maken enkele aanpassingen. Bijvoorbeeld, de meeste van de studies in ratten maken gebruik van een temperatuur van 32 ° C in plaats van 28 ° C. Mathis et al.. 20 voorgesteld een werkwijze voor de bereiding van hippocampale plakken door veroudering muizen of ratten.

Materiaal en methoden

C57BL/6J-muizen uit JANVIER SAS (Frankrijk), maar dezelfde resultaten worden verkregen met C57BL/6J-muizen van Charl es rivier de France.

De hippocampus wordt snel geïsoleerd, terwijl het weefsel wordt ondergedompeld in koud ACSF om celbeschadiging te verminderen. Dit maakt een vermindering excitotoxiciteit maar bekend synaps proliferatie 21,22 die verdere structurele synaptische plasticiteit kan maskeren induceren.

Dan gebruiken we een tissue chopper voor het snijden in plaats van vibratome. Een weefsel chopper is bijzonder goed aangepast aan het snijden van kleine stukjes weefsel zoals muis hippocampus. Op het weefsel bijl, de hippocampus altijd georiënteerd op dezelfde wijze volgens de procedure van Alger et al.. 23. Ze plaatsten de strepen op het Alvear oppervlak, zichtbaar met schuine verlichting, parallel aan het scheermesje. Deze methode hippocampale plakken van het dorsale gedeelte knippen met een hoek van 15 ° van de dwarsas (zie figuur 2C). Vervolgens worden segmenten gemanipuleerd met een minimum van direct contact.

ove_content "> Segmenten worden gehandhaafd interface op 28 ° C direct na dissectie. Deze methode is aangetoond polysynaptic activiteit epileptogenicity in muis en rat plakjes 24 te verminderen.

Externe parameters worden zorgvuldig gecontroleerd om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Bipolaire cluster stimulatie-elektroden (FTC) zijn in plaats van zelfgemaakte elektroden gebruikt om reproduceerbaarheid te verhogen in inductie, zien dat de amplitude van LTP inductie echt afhankelijk van de elektroden kwaliteit.

ETC systeem van de Universiteit van Edinburgh 11 zorgt voor een constante en gelijkmatige temperatuur in de gehele experimentele rig en carbogen verbruik wordt gestabiliseerd met een debietmeter. Interfaceniveau wordt visueel gecontroleerd met behulp van een binoculaire operatiemicroscoop en onderhouden zeer stabiel met een peristaltische pomp afzuigsysteem.

Resultaten

Dit protocol alleows de inductie van stabiele LTP die afhankelijk van externe omstandigheden zoals temperatuur en zuurstof blijft. We hebben eerder aangetoond dat LTP geïnduceerd in deze omstandigheden was afhankelijk NMDA receptoren, α-CaMKII autofosforylering en PI3-kinase-activering die de klassieke moleculaire wegen betrokken bij LTP 14. Daarentegen, waren we niet in staat om de afhankelijkheid van de onderhoudsfase van LTP op nieuwe eiwitsynthese reproduceren. Het vermogen van proteïne-synthese remmers, anisomycin en met name om de ontwikkeling van de late fase van L-LTP wanneer ze rond de inductie toegepast herhaaldelijk gemeld 4,25. Dit heeft geleid tot het algemeen aangenomen hypothese dat stabiliserende synaptische plasticiteit langer dan ongeveer 2-3 uur vereist de activering van de LTP-inductieve stimulus van voorbijgaande synthese van nieuwe eiwitten 26. Echter, recente experimenten gesuggereerd dat waren de dingen ingewikkelder 27 -32. LTP geïnduceerd in onze experimentele omstandigheden was zelfs in aanwezigheid van eiwitsynthese suggereert dat andere mechanismen dan nieuwe eiwitsynthese kunnen worden bij de blijvende fase van LTP gehandhaafd.

Niettemin, in vitro experimenten roept altijd de vraag van de fysiologische relevantie van de waargenomen verschijnsel. Slicing induceert wijzigingen in de fosforylering toestand van eiwitten die betrokken zijn bij de activiteit-afhankelijke vormen van synaptische plasticiteit 33 en wijziging in de metabole toestand van het weefsel 34. De snelheid van de eiwitsynthese wordt verminderd tot 10 tot 15% van die waargenomen in vivo 35 en balans tussen mRNA en eiwitten verstoord 36. Om al deze redenen, moeten we voorzichtig zijn bij de interpretatie van de resultaten.

Per definitie LTP is een snel geïnduceerde langdurige (dagen, weken) versterking van een prikkelende synaps, die waarschijnlijkspeelt een belangrijke rol in de lange-termijn geheugen. LTP, in vivo, kan duren enkele weken en soortgelijke veranderingen in de synaptische sterkte optreden tijdens het leren van 37,38. Bovendien zijn de meeste van de tijd, wordt bij langdurige LTP voorkomen door mutaties, wordt lange termijn geheugen aangetast 39.

Meer problematisch is de parallel tussen de korte-termijn geheugen en kortdurende lange termijn potentiëring. Het eerste probleem is dat de duur van elke fenomeen is onbekend. Kortetermijngeheugen is onderzocht 1 uur tot 1 dag na inlezen dat korte LTP wordt verondersteld minder dan 5 uur duren. De tweede vraag is of op korte termijn geheugen (of kortdurende LTP) is slechts een stap voorwaarts lange-termijn geheugen (of langdurige LTP) of een aparte entiteit met verschillende moleculaire mechanismen 40. Ten derde, we weten niet of korte termijn LTP wordt geïnduceerd door een zwakke stimulus die kort van het veroorzaken van langdurige LTP valt of als het wordt veroorzaakt door dezelfde prikkel, maar eenppears alleen wanneer onderliggende mechanismen van langdurige LTP mislukken.

De langdurige stabiliteit van LTP onder onze experimentele omstandigheden zou kunnen worden gezien als een korte termijn LTP equivalent aan korte-termijn geheugen blijvend tussen 10 uur en 24 uur. In deze vorm van synaptische plasticiteit, wordt eiwitsynthese, die sterk verminderd in schijven, niet noodzakelijk en LTP geïnduceerd kan worden door een trein van stimulatie. Deze langdurende toename synaptische sterkte zouden kunnen worden door een stabiele toename van het aantal AMPA-receptoren in het postsynaptische membraan zonder spine remodellering.

Volgens deze hypothese zou eiwitsynthese nodig zijn voor de rug uitbreiding en structurele modificatie van de synapsen leiden tot lange-termijn geheugen van meerdere weken. In dit geval zou de afnemende fase van LTP alleen waargenomen 24 uur na inductie. Helaas, tot nu, acute segmenten kunnen alleen levend gehouden gedurende ongeveer 16 uur.

et al.. 41 hebben aangetoond dat, in deze muizen, op korte termijn LTP in vivo en korte-termijn geheugen wordt aangetast dat het op lange termijn synaptische plasticiteit en geheugen worden bewaard.

Verschillen tussen de verschillende onderzoeken verschillende laboratoria te wijten zijn aan de duur van kortdurende LTP gevolg van variatie in de enzymatische activiteit, in de metabole toestand van de schijfjes of de snelheid van eiwitafbraak 42. Eiwitsynthese kan worden gezien als een tolerante replenishment proces waarbij verplaatsen van enzymen die zijn gebruikt door het leerproces, of andere constitutieve celelementen 43.

Deze resultaten benadrukken het belang van experimentele omstandigheden op LTP stabiliteit. Een stabiele LTP onafhankelijk van eiwitsynthese kan helpen om de rol van langdurige post-Traduc studietionele modificaties van synaptische eiwitten en mechanismen stabiele stijging van het aantal AMPA-receptoren in de post-synaptische membraan ondanks omzet receptoren.

Deze video toont een gedetailleerd protocol die hopelijk zal helpen om reproduceerbare resultaten te verkrijgen in verschillende laboratoria.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Wij danken Bernard Foucart voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Belgische Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FRS-FNRS) en door de Koningin Elisabeth Fonds voor Medisch Onderzoek. Agnès Villers is Research Fellow aan het Belgische Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
NaCl Sigma - Aldrich S7653
NaHCO3 Sigma - Aldrich S8875
KCl Sigma - Aldrich P9333
D-glucose Sigma - Aldrich G7528
NaH2PO4 Sigma - Aldrich S9638
MgSO4 1M Sigma - Aldrich 63126
CaCl2 Sigma - Aldrich C4901
Carbogen Air Liquide (Belgium)
Capillaries WPI, Inc. (UK) TW150-4
Stimulating Electrodes FHC (USA) CE2B30
Surgical tools FST (Germany)
Filter paper 84 g/m2 Sartorius FT-3-105-110
Mesh Lycra 15 den
Glue UHU plus endfest300
Instrument
Amplifier WPI, Inc. (UK) ISO-80
Interface recording chamber FST (Germany)
Peristaltic pumps Gilson (USA) Minipuls 3
Temperature controller University of Edinburgh www.etcsystem.com
Tissue Chopper Mcllwain
Stimulators Grass (USA) S88X + SIU-V
Program analysis WinLTP www.winltp.com
Micromanipulators Narishige MM-3 and MMO-220A
Surgical microscope Leica Microsystem
A/D converter National Instruments NIPCI-6229 M-series

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
  2. Douglas, R. M., Goddard, G. V. Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus. Brain Res. 86, 205-215 (1975).
  3. Squire, L., Kandel, E. Memory: From mind to molecules. , WH Freeman & Company. New York, New York, USA. (1999).
  4. Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).
  5. Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).
  6. Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).
  7. Migues, P. V., Hardt, O., et al. PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking. Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).
  8. Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).
  9. Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones. J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).
  10. Fonseca, R. Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture. Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).
  11. Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
  12. Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).
  13. Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation. J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).
  14. Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development. PLoS One. 7 (7), e40823 (2012).
  15. Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions. Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).
  16. Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture. Neuroreport. 21, 210-215 (2010).
  17. Nguyen, P. V., Kandel, E. R. Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus. Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).
  18. Dewachter, I., Ris, L., et al. Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1. Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).
  19. Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice. Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).
  20. Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330 (2011).
  21. Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
  22. Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
  23. Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., et al. Appendix: Brain slice methods. Brain Slices. Dingledine, R. , Plenum. New York. 381-437 (1984).
  24. Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons. Brain Res. 775, 134-143 (1997).
  25. Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).
  26. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  27. Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation. Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).
  28. Rudy, J. W. Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis. Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).
  29. Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin. J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).
  30. Volianskis, A., Jensen, M. S. Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus. J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).
  31. Ris, L., Villers, A., Godaux, E. Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation. Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).
  32. Abbas, A. -K., Dozmorov, M., et al. Persistent LTP without triggered protein synthesis. Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).
  33. Ho, O. H., Delgado, J. Y., O'Dell, T. J. Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro. J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).
  34. Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation. J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).
  35. Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain. Brain Res. 99, 303-318 (1975).
  36. Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression. J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).
  37. Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice. J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).
  38. Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. Learning induces long-term potentiation in the hippocampus. Science. 313, 1093-1097 (2006).
  39. Grant, S. G. N., Silva, A. J. Targeting learning. TINS. 17 (2), 71-75 (1994).
  40. Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. Separate mechanisms for short- and long-term memory. Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).
  41. Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome. Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).
  42. Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. Brain Slice Protein Degradation and Development. J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).
  43. Izquierdo, I. Long-term potentiation and the mechanisms of memory. Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).

Tags

Neurowetenschappen Neurobiologie Anatomie Fysiologie Biomedische Technologie Chirurgie Memory Disorders leren geheugen Neurowetenschappen Neurofysiologie hippocampus langdurige potentiëring muizen acute plakjes synaptische plasticiteit, Elektrofysiologie diermodel
Betere voorbereiding en Conservering van hippocampus Mouse Slices voor een zeer stabiele en reproduceerbare opname van langlopende Potentiëring
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Villers, A., Ris, L. Improved… More

Villers, A., Ris, L. Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation. J. Vis. Exp. (76), e50483, doi:10.3791/50483 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter