Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Förbättrad bearbetning och konservering av hippocampus Mouse skivor för en mycket stabil och reproducerbar Inspelning av långsiktig potentiering

Published: June 26, 2013 doi: 10.3791/50483
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neurosciences, Research Institute for Biosciences, University of Mons

Summary

Denna uppsats presenterar en komplett metodik för att förbereda och bevara

Abstract

Långsiktig potentiering (LTP) är en typ av synaptisk plasticitet som kännetecknas av en ökning av synaptisk styrka och tros vara inblandade i minnet kodning. LTP framkallas i CA1 regionen akut hippocampus skivor har utförligt studerats. Men de molekylära mekanismerna bakom underhållsfasen av detta fenomen är fortfarande dåligt kända. Detta kan delvis bero på de olika experimentella betingelser som används av olika laboratorier. I själva verket är underhållsfasen av LTP starkt beroende av externa parametrar såsom syresättning, temperatur och fuktighet. Det är också beroende av interna parametrar såsom orientering av skivning planet och skiva viabilitet efter dissekering.

Optimeringen av alla dessa parametrar möjliggör induktion av en mycket reproducerbar och mycket stabil långsiktig potentiering. Denna metod ger möjlighet att ytterligare utforska de molekylära mekanismer som är inblandade i den stabila ökningeni synaptisk styrka i hippocampus skivor. Det belyser också vikten av experimentella förhållanden i in vitro-undersökning av neurofysiologiska fenomen.

Introduction

Numera finns begränsad förståelse för hur komplexa minnen lagras och hämtas på neuronal krets nivå. Dock är en enande hypotes minne lagringsutrymme och allmänt accepterade: minnen lagras som förändringar i styrkan av synaptiska kopplingar mellan nervceller i det centrala nervsystemet. På egen hand, har forskningen på synaptisk plasticitet gynnades i hög grad från två genombrottupptäckter. (1) I ett banbrytande experiment, Bliss och Lomo 1, med intakta nedsövda kaniner, fann att leveransen av en kort högfrekvent (1 sek, 100 Hz) stimulans till perforanta banan av hippocampus orsakade en långvarig (flera timmar) ökar i de relaterade synapsförbindelser. Denna fascinerande fenomen kallades "långsiktig potentiering" eller LTP av Douglas och Goddard 1975 2. (2) Senare visade det sig att ett liknande fenomen skulle kunna utlösas i hjärnan skivor (0,4 mm) på konstgjord väg hålls vid liv in vitro in vitro genom att leverera en eller flera tetani till en bunt axoner (de så kallade Schaffer säkerheter) under inspelning det resulterande fältet excitatoriska synaptiska potentialen dryftats i de pyramidala nervceller av den så kallade CA1 region. Mekanismerna för LTP induktion har i stor utsträckning visat. I grund och botten, aktiverar en Ca2 + inflöde via NMDA-receptorerna enzymer med två konsekvenser: en fosforylering av AMPA-receptorer (vilket ökar deras effektivitet) och en inkorporering av extra AMPA receptorer i det postsynaptiska membranet 3. Däremot mekanismerna i underhållsfasen av LTP är till stor del okänd, i synnerhet som det är experimentellt mycket svårare att upprätthålla ett segment hälsosamt för många timmar än under 30 till 60 min.

Många studier har ägnats åt förståelsen av LTP mekanismer och intressanta teorier har utarbetats under åren 4-11. Men until nu, har de exakta molekylära mekanismerna bakom den stabila ökningen av synaptisk styrka inte klarlagts. Detta kan delvis bero på svårigheten att reproducera tidigare resultat i olika laboratorier med olika tekniker för framställning och underhåll av hippocampus skivor. I sin metodik papper, betonade Sajikumar et al. 12 vikten av experimentella betingelser för framställning av råtta hippocampus skivor och inspelning av stabil LTP. I denna video presenterar vi alla optimering steg utvecklats i vårt laboratorium under åren för att kunna spela en mycket stabil LTP i mus hippocampus skivor.

Denna optimering har gjorts av protokoll som utvecklats och använts med framgång av andra laboratorier som studerar LTP mekanismer hos möss 13 och råttor 11. Det låter erfarna forskare att framkalla och spela en mycket långvarig LTP i vuxna möss med en hög grad av framgång. Den physiological grundval av den inducerade LTP kontrolleras noggrant och visade 14. I denna metod papper, visar vi att eventuella ändringar av experimentella förhållanden, som temperatur eller syresättning kan ha en djupgående inverkan på LTP underhåll medan dissektion förfarandet kan djupt modifiera skivor retbarhet. Det måste också understrykas att exakt kontroll av alla dessa parametrar krävs en utbildning på flera månader för nybörjare studenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök har utförts i enlighet med National Institutes of Health regler för skötsel och användning av djur i forskning och med godkännande från den lokala etiska kommittén.

Ett. Framställning av artificiell cerebrospinalvätska

Samma medier används för att dissekera, skära och BEGJUTA skivor (1 ml / min) under den viloperiod och elektrofysiologiska inspelningar. Detta media är sammansatt av 124 mM NaCl, 4,4 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1 mM NaH 2 PO 4, 2,5 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO 4 och 10 mM D-glukos.

  1. Väg de olika komponenterna för 2 L av ACSF utom MgSO 4, som redan är i lösning (1 M). Med en vanlig lösning gör det möjligt att vara säker på den exakta koncentrationen av Mg 2 + eftersom MgSO 4 i pulverform är mycket hygroskopiskt. Ca 2 +: Mg2 + förhållande påverkar i hög grad LTP induktion och underhåll14 och därmed deras proportioner måste alltid respekteras.
  2. Placera alla komponenter utom CaCl2 i ett glas mätglas och ta med till 2 L med destillerat H 2 O.
  3. Rör om kraftigt. När allt är upplöst, tillsätt karbogen genom ett akvarium bubblare och slang fäst på tanken (95% O2, 5% CO2). Vänta några minuter och tillsätt kalciumklorid när pH är fastställd till 7,4 genom inverkan av bikarbonat buffert.
  4. Håll 600 ml i en kyld rektangulär glasskål och svalna till 4 ° C med is runt skålen. Detta media kommer att användas för hippocampus dissektion.
  5. Filtrera resterande 1.400 ml och hålla i en E-kolv.

2. Beredning av Elektrofysiologisk Rig och hjärnan skiva inspelningen kammare

Perfusionskretsen är gjord av 2 peristaltiska pumpar, en pumpa färsk vätska från en reservtank och andra pumpning används vätska från than spelar kammare till en lagerplats. Färska vätska sätts till en hemmagjord perfusion system där det är nytt syre och värmas innan de når kammaren gränssnittet inspelningen genom självtryck (Figur 1A). Gränssnittet inspelning kammare ritades av FST (Fine Science Tools, Vancouver, Kanada, Figur 1B). Tissue skivor placeras på vävda netto filter fäst till en flyttbar väl ringen och kan kontinuerligt hålles under gränssnitt förhållanden genom justering av höjden av sug väl nålen. En hemmagjord plaströr blockerad vid sin ände och perforerade i sidled (0,5 mm) är fäst vid sug nålen för att öka nivån stabilitet i kammaren. Skrivhuvudet är monterad över ett vattenbad innehållande en sten gas dispersion som bidrar till att upprätthålla en fuktig miljö genom att låta fuktig luft genom nedböjning hamnar i skrivhuvudet (för att minska bildningen vattendroppen). Bad och medelstora temperatur styrs genom kontinuerligt varierande nivån av likström thgrov en silikongummi-inbäddade värmeelement i vattenbadet. Termistorer i vattenbadet och brunnar inspelning tillåter kammarens temperatur ställas in och exakt övervakas på dessa platser.

Värmesystemet av kammaren avslutas med en global värmesystem reglering av temperaturen av hela riggen. Den programvara som utvecklats av forskare vid University of Edinburgh ( www.etcsystem.com ) övervakar och utjämnar temperaturen hos syresatt luft, hjärnan slice, elektroderna och resterande riggen ger en stabil miljö för långsiktiga inspelningar (Figur 1C) . Den temperatur som används för mus hippocampus skivor är 28 ° C.

  1. Skölj alla perfusionskretsen med destillerat H2O under minst 20 minuter och starta värmesystem.
  2. Starta carbogen bubblande i kretsen. Carbogen anländer i hemgjorda perfusion rör genom fIlter ljus och i vattenbadet under inspelningen kammaren. Flödeshastigheten i vattenbadet styrs av en flödesmätare. Om flödet är för långsam, kan vävnaden bli hypoxisk. Omvänt, om flödeshastigheten är för hög kan gasen vara inte tillräckligt uppvärmd och återfuktad som leder till torkning av vävnaden. Hög gasflödeshastigheten kan också öka risken för besprutning med vatten över vävnaden från vattenbadet nedan leder till osmotisk chock. Detta kan förhindras genom att addera bitar av nylonnät (100 | im) vid utloppet av avböj portar.
  3. Tappa kretsen och fyll upp med filtrerad ACSF.
  4. Sätt ringen som kommer att stödja skiva i varmhållningskammaren. Ett vävt nät filter med masköppningar spänner från 500 till 750 nm är sträckt och fäst ringen med tvådelad harts epoxilim. Den vävda nät filtret är tillverkat av 87% polyamid och 13% elastan (trosa 15 den). Lim måste påföras noggrant för att undvika bildandet av reliefer vid ytan av RINg.
  5. Ta försiktigt bort alla luftbubblor ur kretsen.
  6. Justera nivån för ACSF i inspelningen kammaren med skruven på sug nålen. Hastigheten hos de peristaltiska pumparna justeras till 1 ml / min under inloppspumpen och till 5 ml / min under utloppet pumpen.

Den perfusionssystemet placeras på en styv vibrationsbeständig bord och omges av en Faraday-bur.

Tre. Beredning av Dissection området

Kirurgiska instrument: en skalpell med en # 11 blad, små standard dissekera sax, våren sax, böjd pincett, två Heidemann spatulae och en sked.

Kompletterande material: en giljotin, en underpad, en McIlwain vävnad chopper med ett rakblad, filterpapper, ett glas pasteurpipett med en gummi spene, pipetter 2 plast Pasteur varav en med en bred mynning, en petriskål, en metallisk cylinder av 7 mm i diameter (Figur 2A).

    (Figur 2A).
  1. Lägg ut instrument för användning. Lägg tre lager av filterpapper på vävnaden söndermalningsskivan och ett nytt rakblad rengöras med destillerat vatten och eter (Figur 2B). Den rakblad måste vara vågrät när den vidrör pappret. Blade kraft justeras till hälften av maximal värde och hastighet för att cirka en tredjedel av maximala värde.
  2. Uppmärksamt kontrollera om allt är klart (instrument, temperatur ...) eftersom du inte kommer att ha tid efteråt.
  3. Be någon att spraya dissektion med en Pasteur pipett fylld med kallt ACSF.
  4. Bedöva musen med nembutal IP (100 mg / kg) innan halshuggning. Halotan anestesi kan också användas. Vi har jämfört både metoder och obtained samma resultat. Halshuggning måste utföras under narkos men halsdislokation kan också användas. Men halsdislokation behöver en mycket god praxis att undvika djurens lidande.
  5. Dissekera på underpad så fort som möjligt under kallt ACSF kontinuerlig dusch.

4. Brain Borttagning

  1. Håll fortfarande huvudet med pekfingret och tummen på ena handen på nosen, gör ett snitt med dissekera sax längs mitten på toppen av huvudet börjar vid kanten av giljotin klippa och kör rostrally till pannben .
  2. Skär genom kutana muskeln på vardera sidan av huvudet till fullo exponera skallen plattorna och ta bort musklerna vid den kaudala sidan av huvudet.
  3. Med dissekera sax, klippa temporalis muskeln på varje sida, längs temporalis plattan, skär sedan de främre plattorna i mitten, på tvären. Sedan gör ett litet snitt på pannben, mellan de två PLAtes.
  4. För varje sida, skär i caudal basen av occipital plattorna.
  5. Klipp längs sagittal sutur med våren sax.
  6. Med pincett, ta bort skallen halvor genom att sprida dem bort från varandra.
  7. Med skalpell, skär tvärs strax efter luktbulben och strax innan lillhjärnan sedan störta den extraherade hjärnan i dissekera skålen med kallt ACSF.

Fem. Hippocampus Dissection

  1. När hjärnan immerged i dissekera skålen, åtskiljer de båda halvkloten från varandra med en skalpell införas i mitten.
  2. Den dissektion av hippocampus utförs med spatulae under visuell kontroll genom ett binokulärt operationsmikroskop (X25, Figur 2A). Å ena hjärnhalvan, noggrant sprida strukturer för att se den laterala ventrikeln. Ta hjärnstammen och diencephalon. Detta görs genom att tillämpa spatulae på frontala cortex på ena sidan och på diencephalon påandra sidan. Var noga med att inte röra hippocampus med spatulae och att inte sträcka ut det under vävnad sektionering.
  3. Sever fornix tryck sedan försiktigt hippocampus ur cortex (rulla bort), genom att sätta in en spatel i kammaren.
  4. När hippocampus extraheras, avlägsna överskott cortex vävnad och kvarvarande blodkärl.

6. Kapning av skivorna

  1. Med en bred mun plast Pasteur pipett hippocampus i en sked med sina Alvear yta uppåt (konvexa sidan).
  2. Ta bort överflödig vätska med en vanlig plast Pasteur pipett.
  3. Lyft upp skeden vertikalt nästan vidrör filterpapper hos chopper (Figur 2B) och släppa av hippocampus från skeden, genom att snabbt trycka på filterpapper flyttar sedan tillbaka sked.
  4. Orientera hippocampus och skiva den tvärs 400 nm med helikoptern (se figur 2C för orientering av hippocampus förhållande till rakblad). Agera så snabbt som möjligt.
  5. Ta bort filtret papper med skivade hippocampus och vira den runt den metalliska cylindern att sprida skivorna lite. Sedan, gratis skivor med sprayer av ACSF med en vanlig plast Pasteur pipett och samla dem i en petriskål fylld med kallt ACSF.

7. Inkubation av skivor i gränssnittet

  1. Välj skivor med en vanlig plast Pasteur pipett och snabbt placera dem i inspelningen kammaren. Skivor återhämta sig från dissektion trauma direkt i inspelningen kammaren, i gränssnittet vid 28 ° C.
  2. Skivan kommer sannolikt sjunka. Sänk vätskenivån att nå segment nivå, och sedan höja den så att den flyter.
  3. Vrid skivan i rätt läge samtidigt sänka nivån. Skivor är alltid orienterade på samma sätt för att underlätta inplaceringen av elektroder (2 stimulerande och en elektroderna inspelning) i CA1-regionen.
  4. Stanna närfluiden är i gränssnittet. En "menisk" av media runt skivan indikerar en tillräcklig nivå av media. Nätet filtret måste mättas med media men inte helt under vatten.
  5. Håll kammaren täckt med filterpapper placeras över den perforerade locket.
  6. Låt slice vila i minst 1,5 timmar vid 28 ° C.

8. Inspelning av Synaptic Svar

  1. Inspelningen elektroden: glaskapillärer dras för att få en spets motstånd 2-5 Mohm när den är fylld med ACSF. En liten bit filterpapper placeras runt spetsen på elektroden och ben vax appliceras vid änden för att minska kondensation. Stimulerande elektroder: platinum-iridium bipolära kluster elektroder med en 12,5 um diameter köps från FHC (USA). Med rätt skötsel kan varje elektrod användas minst 30 gånger (Figur 1B).
  2. Placera elektroderna i stratum radiatum av CA1 regionen, fodrad alla elektroderupp (Figur 3A). Elektroder sänks 75-150 | im under ytan av den del med Narishige mikromanipulatorer. De två stimulerande elektroder placeras för att stimulera två olika buntar av Schaffer säkerheter. När elektroderna är nedsänkt på skiva, är filterpapper noggrant placerade runt för att stänga kammaren.
  3. Bifasisk stimulering (0,08 ms pulslängd per halv-våg) utförs vid konstant spänning med en Grass stimulator ansluten till SIU-V isoleringsenheter. Maximal svar kontrolleras genom att öka stimulusintensitet från 2 V till högst 12 V. Field EPSPs förstärks 1000 gånger med en WPI ISO-80 förstärkare och filtreras vid 10 Hz och 10 kHz. Signalen skickas sedan till en dator via ett National Instrument A / D-omvandlaren. Stimulering, datainsamling och analys utförs med hjälp av WinLTP programmet ( www.winltp.com ). Fält-EPSP redovisas till 40% av den erhållna maximala amplitud i ett input-utsätta kurva. För varje skiva är de fEPSP backarna normaliserades mot den genomsnittliga lutningen under 30 min före LTP induktion.
  4. LTP utlöses genom att applicera en enda tåg av stimulering (100 Hz) vid provning styrka på en väg medan den andra banan fungerar som en kontroll.

9. Rengöring av Setup

  1. Skölj hela kretsen med en 3% lösning av väteperoxid (H 2 O 2) i minst 10 minuter, låt rinna av. Kretsen kommer sköljas noga med destillerat vatten innan något experiment. Användningen av H 2 O 2 är inte absolut behövs som andra labb använder bara destillerat vatten för rengöring, men vi har märkt att nedfallet av mörka rester i rörsystemet vid användning av enbart vatten.
  2. Byt vatten i vattenbadet under inspelningen kammaren.
  3. Bath de stimulerande elektroderna tips i alkohol för 5 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna metod har använts för att analysera egenskaperna hos långvariga långtidspotentiering induceras i akut hippocampus skivor från vuxna C57BL/6J-möss (JANVIER SAS, Frankrike) 14. Överraskande, har förbättringen av de experimentella förhållandena ledde till ett nytt sätt att se på LTP. Vi visade att långvarig ökning av synaptisk styrka inte kräver syntes av nya proteiner.

Här visar vi att LTP induktion beror på skivor livskraft och upphetsning. När dissektion av hippocampus var för långsam eller för skadlig, skivor retbarhet ökat och polysynaptiska svar kunde observeras efter LTP induktion (Figur 3B). I detta fall var LTP induktion mycket mindre effektiv och potentiering var inte upprätthålls.

Vi vill understryka det faktum att även i skivor till synes friska, tekniska förutsättningar har ett stort inflytande på hur länge LTP framkallas av en endatåg av stimulering. I tidigare publikationer, visade vår grupp som en kortvarig LTP kan omvandlas till en långvarig en genom att modifiera återhämtning villkoren för skivan 15. Under år av daglig praxis, konstaterade vi att successiva förbättringar i vår teknik har lett till en gradvis ökning av varaktigheten av LTP framkallas av ett enda tåg i vanliga förhållanden. Det framgick inspelningar gjorda under 2005 en kortvarig LTP gå tillbaka till baslinjen inom 3 h (figur 3C, fyllda cirklar). Ändringar i dissektion förfarandet minskar vävnad stretching har gjort det möjligt att få en LTP lidit under 6 h 16 (figur 3C, fyllda kvadrater). Och slutligen, har förbättringar i gränssnittet syresättning och temperaturkontroll, i kombination med elektroden standardisering ledde till en LTP stabil i mer än 8 h (figur 3C, ofyllda cirklar). Skillnaden mellan de tre grupperna är signifikant (en-way ANOVA, F (2,20) = 49,5, P <0,001).

Vidare inducerade varje ändring av temperatur eller syresättning en ökning eller en minskning av synaptiska svar (Figur 4). Kontrollen av dessa parametrar kontrollerades genom att alltid använda två stimulerande elektroder. LTP framkallades på en bunt av Schaffer säkerheter medan en annan bunt användes som en intern kontroll av synaptisk styrka stabilitet.

Figur 1
Figur 1. Elektrofysiologisk rigg och hjärnan skiva inspelningen kammaren. (A) perfusionskretsen med hemgjorda gravitation perfusionssystem alimented av en peristaltisk pump, isolerade enheter stimulering (två per elektrod), kirurgisk mikroskop och inspelningen kammaren. (B) Gränssnitt inspelning kammare med stimulerande ochregistreringselektroderna. Filterpapper har tagits bort från locket för att se ringen stöder slice. (C) Styrenhet med 2 stimulatorer, oscilloskop, A / D-omvandlare, temperaturkontroll programvara och WinLTP programvara.

Figur 2
Figur 2. Verktyg och material som används för hippocampus skivning. (A) Dissection maträtt som innehåller kylda ACSF och kirurgisk mikroskop. Skalpell monterad med en # 11 blad, små standard dissekera sax, våren sax, böjd pincett, två Heidemann spatulae, sked, pipetter 2 plast Pasteur varav med en bred mun, petriskål, metallisk cylinder med 7 mm diameter och ringen som stöder segmentet i inspelningen kammaren. (B) McIlwain vävnad chopper. (C) Ritning och fotografera of vänster hippocampus i läge för kapning. Orienteringen av rakbladet indikeras av den streckade röda linjen. Skala av riktmedel:. 1 mm Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3
Figur 3. Induktion av LTP i hippocampus skivor. (A) Skiss på de två oberoende synaptiska inmatningar S1 och S2 till samma neuronala populationen. I varje skiva, var två stimulerande elektroder (S1 och S2) på plats. S1 väg användes för att inducera LTP, medan S2 banan fungerade som en kontrollgrupp. (B) Exempel fEPSP spår från enskilda experiment i en fullt frisk skiva (vänster) och i en skiva presentera en hög retbarhet (höger). De spelades in just BEF malm LTP induktion (röda spår) och en timme efter LTP induktion (blå spår). När skivorna inte är helt friska (till höger), är polysynaptiska reaktioner observeras och fEPSP lutning potentiering reduceras. (C) Jämförelse av tidsförlopp i fEPSP sluttningen efter LTP framkallas av ett enda tåg av högfrekvent stimulering (100 Hz, 1 sek) inspelad under 2005, 2010 och 2011 i vårt laboratorium. Första experimenten registrerades under 2005 (fyllda cirklar, n = 11). Efterföljande inspelningar (Villers, et al. 2010) dragit nytta av ett förbättrat dissektion förfarande (fyllda kvadrater, n = 6). Aktuella resultat uppstår från optimering av gränssnittet syresättning och temperatur kontroll tillsammans med elektrod standardisering (öppna cirklar, n = 6). Klicka här för att visa en större bild .

/ Files/ftp_upload/50483/50483fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50483/50483fig4.jpg "/>
Figur 4. Variation av fEPSP lutning som en funktion av temperatur och syre flödeshastighet. (A) Ökning syreflödeshastighet i vattenbad under inspelningen kammaren 0,15-0,25 l / min (blå kurva) inducerar en minskning i fEPSP lutning på 20% (rosa kurva). (B) Ökning av temperaturen från 28 till 29 ° C (grön kurva) inducerar en mer än 50% ökning fEPSP lutning (rosa kurva). Klicka här för att visa en större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har utvecklats i vårt laboratorium ett protokoll till följd av kombinationen av metoder som utvecklats och används av andra laboratorier som har en stor kompetens inom LTP inspelningar 11,17. Detta protokoll är anpassad till vuxen mus hippocampus och kan användas i djur i alla åldrar och någon bakgrund genotyp. Det gör också en analys av LTP i transgena möss utvecklar neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom 18,19.

Utnyttjande av detta protokoll för råtta hippocampus skivor kan kräva vissa anpassningar. Till exempel, de flesta av de studier som utförts på råttor använder en temperatur av 32 ° C i stället för 28 ° C. Mathis et al. 20 föreslås en annan metod för framställning av hippocampus skivor från åldrande möss eller råttor.

Material och metoder

C57BL/6J-möss kommer från JANVIER SAS (Frankrike), men samma resultat erhålles med C57BL/6J-möss från Charl es River Frankrike.

Hippocampus är snabbt isoleras medan vävnaden är nedsänkt i kallt ACSF att minska cellskador. Detta medger en minskning av excitotoxicitet men är känd för att inducera proliferation synaps 21,22 som kan dölja ytterligare strukturell synaptisk plasticitet.

Sedan använder vi en vävnad chopper för skivning istället för vibratome. En vävnad chopper är särskilt väl anpassad till sektionering av små bitar av vävnad som mus hippocampus. På vävnad chopper, är hippocampus alltid riktad på samma sätt enligt förfarandet av Alger et al. 23. De placerade strimmor på alvear ytan, synlig med sned belysning, parallellt med rakblad. Denna metod ger hippocampus skivor av ryggstycket snitt med en vinkel av 15 ° från den tvärgående axeln (se figur 2C). Därefter segment manipuleras med ett minimum av direkt kontakt.

ove_content "är> Skivor bibehålls i gränssnittet vid 28 ° C direkt efter dissekering. har denna metod visat sig minska polysynaptic aktivitet och epileptogenicity i mus och råtta skivor 24.

Externa parametrar kontrolleras noggrant för att få reproducerbara resultat. Bipolär cluster stimulerande elektroder (FTC) används istället för hemmagjorda elektroder för att öka reproducerbarheten i induktion, ser att amplituden av LTP induktion beror egentligen på elektroderna kvalitet.

ETC-system från University of Edinburgh 11 upprätthåller en konstant och jämn temperatur i hela den experimentella riggen och carbogen konsumtionen stabiliseras med en flödesmätare. Interface nivå styrs visuellt med hjälp av ett binokulärt operationsmikroskop och upprätthålls mycket stabil med en peristaltisk pump utsugningssystem.

Resultat

Detta protokoll allaöden induktion av en mycket stabil LTP som förblir beroende av yttre förhållanden som temperatur och syresättning. Vi har tidigare visat att LTP induceras i dessa förhållanden var beroende av NMDA-receptorer, α-CaMKII autofosforyleringen och PI3-kinas aktivering som är de klassiska molekylära banorna som är involverade i LTP 14. Däremot kunde vi inte återge beroendet av underhållet fasen av LTP på ny proteinsyntes. Förmågan hos protein-syntes hämmare, och av anisomycin i synnerhet, för att förhindra utvecklingen av den sena fasen av L-LTP när de appliceras runt induktion har upprepade gånger rapporterat 4,25. Detta har lett till den gängse hypotesen att stabilisera synaptisk plasticitet längre än ca 2-3 tim krävs det utlösande av LTP-induktiv stimulans av övergående syntes av nya proteiner 26. Emellertid har nya experiment tydde att det var mer komplicerat 27 -32. LTP induceras i våra experimentella betingelser bibehölls även i närvaro av inhibitorer proteinsyntesen vilket tyder på att andra mekanismer än nya proteiner syntes skulle kunna delta i varaktiga fasen av LTP.

Ändå in vitro experiment alltid väcker frågan om den fysiologiska betydelsen av den observerade fenomenet. Skivning inducerar förändringar i fosforyleringstillståndet av proteiner involverade i verksamheten är beroende former av synaptisk plasticitet 33 och ändring i det metaboliska tillståndet hos vävnaden 34. Hastigheten av proteinsyntes reducerats till 10 till 15% av den som observerades in vivo 35 och balans mellan mRNA och proteiner störs 36. Av alla dessa skäl måste vi vara försiktiga i tolkningen av resultaten.

Per definition LTP är en snabbt inducerad långvarig (dagar, veckor) förstärkning av en excitatoriska synaps, vilket troligenspelar en viktig roll i långtidsminnet. LTP, in vivo, kan pågå i flera veckor och liknande förändringar i synaptisk styrka inträffar under inlärning 37,38. Dessutom, det mesta är när långsiktig LTP förhindras genom mutationer, är långtidsminnet försämras 39.

Mer problematiskt är parallellen mellan korttidsminnet och kortvarig långsiktig potentiering. Det första problemet är att varaktigheten av varje fenomen är okänd. Korttidsminne har studerats 1 timme till 1 dag efter att lära förfarande medan kortsiktiga LTP är tänkt att pågå under kortare tid än 5 tim. Den andra frågan är om korttidsminnet (eller kortvarig LTP) är bara ett steg framåt långtidsminne (eller långvarig LTP) eller en separat enhet med distinkta molekylära mekanismer 40. För det tredje vet vi inte om kortsiktiga LTP framkallas av en svag stimulans som når orsaka långvariga LTP eller om det induceras av samma stimulus men enppears bara när mekanismerna bakom långvarig LTP misslyckas.

Den långvariga stabiliteten i LTP under våra experimentella betingelser kan ses som en kortsiktig LTP motsvarande korttidsminne varar mellan 10 tim och 24 tim. I denna form av synaptisk plasticitet, proteinsyntes, som är mycket reducerad i skivor, inte behövs och LTP kan induceras genom en enda tåg av stimulering. Denna långvariga ökningen av synaptisk styrka kan bero på en stabil ökning i antalet AMPA-receptorer i postsynaptiska membranet utan ryggrad ombyggnad.

Enligt denna hypotes skulle proteinsyntes behövas för ryggraden utvidgningen och strukturella modifieringar av synapser leder till långtidsminnet under flera veckor. I detta fall skulle den decremental fasen av LTP endast observeras 24 h efter induktion. Tyvärr, tills nu, kan akut skivor endast upprätthållas vid liv under cirka 16 timmar.

et al. 41 har visat att det i dessa möss, är kortsiktiga LTP in vivo och korttidsminnet försämras medan långvarig synaptisk plasticitet och minne bevaras.

Skillnader mellan olika studier utförda i olika laboratorier kan bero på varaktigheten av kortvarig LTP beroende på variation i den enzymatiska aktiviteten, i det metaboliska tillståndet av skivorna eller i graden av proteinnedbrytning 42. Proteinsyntes kan ses som en tillåtande påfyllning process med flytta av enzymer som har använts av inlärningsprocessen, eller av andra konstitutiva cellelement 43.

Dessa resultat visar på vikten av experimentella förhållanden på LTP stabilitet. En stabil LTP oberoende av proteinsyntes kan bidra till att studera betydelsen av långvariga post-traducnella modifieringar av synaptiska proteiner och mekanismerna bakom stabil ökning av antalet AMPA-receptorer i postsynaptiska membran trots receptorer omsättningen.

Denna video visar ett detaljerat protokoll som förhoppningsvis ska bidra till att uppnå reproducerbara resultat i olika laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi tackar Bernard Foucart för tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av den belgiska fonden för vetenskaplig forskning (FRS-FNRS) och av drottning Elisabeth fond för medicinsk forskning. Agnès Villers är Research Fellow vid den belgiska fonden för vetenskaplig forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
NaCl Sigma - Aldrich S7653
NaHCO3 Sigma - Aldrich S8875
KCl Sigma - Aldrich P9333
D-glucose Sigma - Aldrich G7528
NaH2PO4 Sigma - Aldrich S9638
MgSO4 1M Sigma - Aldrich 63126
CaCl2 Sigma - Aldrich C4901
Carbogen Air Liquide (Belgium)
Capillaries WPI, Inc. (UK) TW150-4
Stimulating Electrodes FHC (USA) CE2B30
Surgical tools FST (Germany)
Filter paper 84 g/m2 Sartorius FT-3-105-110
Mesh Lycra 15 den
Glue UHU plus endfest300
Instrument
Amplifier WPI, Inc. (UK) ISO-80
Interface recording chamber FST (Germany)
Peristaltic pumps Gilson (USA) Minipuls 3
Temperature controller University of Edinburgh www.etcsystem.com
Tissue Chopper Mcllwain
Stimulators Grass (USA) S88X + SIU-V
Program analysis WinLTP www.winltp.com
Micromanipulators Narishige MM-3 and MMO-220A
Surgical microscope Leica Microsystem
A/D converter National Instruments NIPCI-6229 M-series

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
  2. Douglas, R. M., Goddard, G. V. Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus. Brain Res. 86, 205-215 (1975).
  3. Squire, L., Kandel, E. Memory: From mind to molecules. , WH Freeman & Company. New York, New York, USA. (1999).
  4. Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).
  5. Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).
  6. Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).
  7. Migues, P. V., Hardt, O., et al. PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking. Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).
  8. Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).
  9. Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones. J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).
  10. Fonseca, R. Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture. Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).
  11. Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
  12. Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).
  13. Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation. J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).
  14. Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development. PLoS One. 7 (7), e40823 (2012).
  15. Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions. Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).
  16. Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture. Neuroreport. 21, 210-215 (2010).
  17. Nguyen, P. V., Kandel, E. R. Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus. Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).
  18. Dewachter, I., Ris, L., et al. Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1. Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).
  19. Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice. Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).
  20. Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330 (2011).
  21. Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
  22. Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
  23. Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., et al. Appendix: Brain slice methods. Brain Slices. Dingledine, R. , Plenum. New York. 381-437 (1984).
  24. Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons. Brain Res. 775, 134-143 (1997).
  25. Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).
  26. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  27. Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation. Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).
  28. Rudy, J. W. Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis. Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).
  29. Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin. J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).
  30. Volianskis, A., Jensen, M. S. Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus. J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).
  31. Ris, L., Villers, A., Godaux, E. Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation. Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).
  32. Abbas, A. -K., Dozmorov, M., et al. Persistent LTP without triggered protein synthesis. Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).
  33. Ho, O. H., Delgado, J. Y., O'Dell, T. J. Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro. J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).
  34. Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation. J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).
  35. Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain. Brain Res. 99, 303-318 (1975).
  36. Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression. J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).
  37. Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice. J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).
  38. Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. Learning induces long-term potentiation in the hippocampus. Science. 313, 1093-1097 (2006).
  39. Grant, S. G. N., Silva, A. J. Targeting learning. TINS. 17 (2), 71-75 (1994).
  40. Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. Separate mechanisms for short- and long-term memory. Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).
  41. Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome. Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).
  42. Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. Brain Slice Protein Degradation and Development. J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).
  43. Izquierdo, I. Long-term potentiation and the mechanisms of memory. Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).

Tags

Neurovetenskap neurobiologi anatomi fysiologi medicinsk teknik Kirurgi minnesstörningar inlärning minne neurovetenskap neurofysiologi hippocampus långsiktig potentiering möss akut skivor synaptisk plasticitet, Elektrofysiologi djurmodell
Förbättrad bearbetning och konservering av hippocampus Mouse skivor för en mycket stabil och reproducerbar Inspelning av långsiktig potentiering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Villers, A., Ris, L. Improved… More

Villers, A., Ris, L. Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation. J. Vis. Exp. (76), e50483, doi:10.3791/50483 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter