Summary
Este trabalho apresenta uma metodologia completa para se preparar e preservar
Abstract
A potenciação de longa duração (LTP), um tipo de plasticidade sináptica, caracterizada por um aumento na força sináptica e acredita estar envolvida na codificação da memória. LTP provocada na região CA1 do hipocampo fatias agudas tem sido extensivamente estudada. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a fase de manutenção deste fenômeno ainda são pouco compreendidos. Isto pode ser em parte devido às várias condições experimentais utilizadas por laboratórios diferentes. Com efeito, a fase de manutenção da LTP é fortemente dependente de parâmetros externos como a oxigenação, temperatura e humidade. É também dependente dos parâmetros internos como orientação do plano de corte e de viabilidade após a dissecação fatia.
A optimização de todos estes parâmetros permite a indução de potenciação de uma muito reprodutível e muito estável a longo prazo. Esta metodologia oferece a possibilidade de explorar os mecanismos moleculares envolvidos no aumento estávelna força sináptica em fatias de hipocampo. Ele também destaca a importância das condições experimentais na investigação in vitro de fenômenos neurofisiológicos.
Introduction
Hoje em dia, há uma compreensão limitada de como as memórias complexas são armazenados e recuperados no nível do circuito neuronal. No entanto, uma hipótese unificadora de armazenamento de memória disponível e largamente aceites: memórias são armazenadas como variações na força das conexões sinápticas entre neurónios no sistema nervoso central. Por si só, a pesquisa sobre a plasticidade sináptica foi amplamente beneficiado com duas descobertas revolucionárias. (1) Num experimento seminal, Bliss e Lomo 1, utilizando o coelho anestesiado intacto, descobriram que a entrega de uma breve alta frequência (1 s, 100 Hz), a estimulação do caminho perfurante do hipocampo causada uma longa duração (vários horas) aumento das conexões sinápticas relacionadas. Este fenômeno fascinante foi chamado de "potencialização de longo prazo", ou PLP por Douglas e Goddard, em 1975 2. (2) Mais tarde, verificou-se que um fenómeno semelhante poderá ser desencadeada em fatias de cérebro (0,4 mm), mantido artificialmente vivo, in vitro in vitro, fornecendo um ou vários tetani a um feixe de axónios (os chamados colaterais de Schaffer) durante a gravação do campo resultante sináptica excitatória potencial evocado nos neurónios piramidais da região CA1 chamada. Os mecanismos de indução da LTP têm sido amplamente revelados. Basicamente, um influxo de Ca2 + através dos receptores NMDA activa enzimas com duas consequências: a fosforilação de receptores AMPA (o que aumenta a sua eficiência) e uma incorporação de receptores de AMPA extra na membrana pós-sináptica 3. Por outro lado, os mecanismos da fase de manutenção da LTP são em grande parte desconhecida, nomeadamente porque é experimentalmente muito mais difícil manter uma fatia saudável durante muitas horas de 30 a 60 min.
Muitos estudos têm sido dedicados à compreensão dos mecanismos de LTP e teorias interessantes foram elaborados ao longo dos anos 4-11. Mas unaté agora, os mecanismos moleculares exactos subjacentes ao aumento estável na força sináptica não foram elucidados. Isto pode ser parcialmente devido à dificuldade para reproduzir os resultados obtidos em laboratórios diferentes, utilizando diferentes técnicas para a preparação e para a manutenção de fatias do hipocampo. Em seu papel metodologia, Sajikumar et al. 12 ressaltou a importância das condições experimentais para a preparação de fatias de hipocampo de ratos e ao registo das LTP estável. Neste vídeo, apresentamos todas as etapas de otimização desenvolvidos em nosso laboratório ao longo dos anos para poder gravar um LTP muito estável em fatias de hipocampo de ratos.
Essa otimização foi feita a partir de protocolos desenvolvidos e utilizados com sucesso por outros laboratórios que estudam mecanismos de LTP em camundongos e ratos 13 11. Ele permite que os investigadores experientes para induzir e gravar uma LTP duradoura por muito tempo em ratos adultos com uma alta taxa de sucesso. O pbase hysiological da LTP induzida foi cuidadosamente verificada e demonstrada 14. Neste trabalho a metodologia, vamos mostrar que qualquer modificação das condições experimentais, como a temperatura ou a oxigenação pode ter um impacto profundo sobre a manutenção LTP enquanto o procedimento de dissecção pode modificar profundamente fatias excitabilidade. Também deve ser enfatizado que o controle preciso de todos estes parâmetros requer um treinamento de vários meses para os alunos novatos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o National Institutes of regulamentos de saúde para o cuidado e uso de animais em pesquisa e com o consentimento do comitê de ética local.
1. Preparação de Artificial líquido cefalorraquidiano
Os mesmos meios de comunicação é utilizado para dissecar, cortar e perfundir fatias (1 ml / min) durante o período de repouso e as gravações eletrofisiológicas. Este meio é composto por NaCl 124 mM, KCl 4,4 mM, NaHCO 3 26, 1 mM de NaH 2 PO 4, 2,5 mM CaCl2, 1,3 mM de MgSO4 e 10 mM de D-glucose.
- Pesar os componentes diferentes para 2 L de MgSO4 ACSF excepto que já se encontra em solução (1 M). Usando uma solução padrão permite ter a certeza da exata concentração de Mg 2 + porque MgSO4 em pó é altamente higroscópico. Ca 2 + e Mg 2 + rácio influencia grandemente a indução e manutenção da LTP14 e, assim, as proporções devem ser sempre respeitados.
- Coloque todos os componentes, exceto CaCl2 num cilindro de vidro graduado e trazer a 2 L com H2O destilada
- Mexa vigorosamente. Quando tudo está dissolvido, adiciona carbogénio através de um borbulhador de aquário e tubo ligado ao tanque (95% O2, 5% de CO 2). Espere alguns minutos e adicionar cloreto de cálcio, quando o pH é fixado em 7,4 por acção de tampão de bicarbonato.
- Manter a 600 ml num prato de vidro rectangular refrigerado e arrefecer a 4 ° C com gelo em volta do prato. Este meio será utilizada para dissecação do hipocampo.
- Filtre os restantes 1.400 ml e manter-se em um erlenmeyer.
2. Preparação do Rig eletrofisiológica ea Slice câmara de gravação Cérebro
O circuito de perfusão é feita de duas bombas peristálticas, um bombeamento de fluidos frescos de um tanque de reserva e outro de bombeamento de fluido usado de tele gravar câmara a um bin. Fluido fresco é adicionada a um sistema de perfusão caseira, onde é re-oxigenada e aquecida antes de atingir a câmara de registo de interface, por gravidade (Figura 1A). A câmara de gravação interface foi projetada pelo FST (Belas Tools Ciência, em Vancouver, Canadá, Figura 1B). Fatias de tecido são colocados em rede tecida filtro ligado a um anel bem removível e pode ser mantida continuamente sob condições de interface, ajustando a altura da agulha de aspiração bem. Um tubo de plástico caseira bloqueado na sua extremidade e perfuradas lateralmente (0.5 mm) é fixada à agulha de sucção para aumentar a estabilidade do nível da câmara. A cabeça de gravação é montada sobre um banho de água contendo uma pedra de dispersão de gás que ajuda a manter um ambiente húmido passando o ar húmido através de portas de deflexão da cabeça de gravação (para diminuir a formação de gotículas de água). Banho e temperatura do meio é controlado por variação contínua do nível de corrente DC tháspero um silicone de borracha incorporado elemento de aquecimento em banho-maria. Termistores em banho de água e poços de gravação permitir que a temperatura da câmara para ser fixado e precisamente controlada nestes locais.
O sistema de aquecimento da câmara é completado por um sistema de aquecimento global, controlando a temperatura de toda a plataforma. O software desenvolvido por pesquisadores da University of Edinburgh ( www.etcsystem.com ) monitora e equilibra a temperatura do ar oxigenado, a fatia do cérebro, os eletrodos eo equipamento restante proporcionando um ambiente estável para gravações de longa duração (Figura 1C) . A temperatura utilizada para fatias de hipocampo de ratos é de 28 ° C.
- Lavar todo o circuito de perfusão com H 2 O destilada por um período mínimo de 20 min e iniciar os sistemas de aquecimento.
- Iniciar o borbulhamento carbogénio no circuito. Carbogen chega nas home-made tubos de perfusão através de fvelas ILTER e no banho de água abaixo da câmara de gravação. O caudal do banho de água é controlada por um medidor de fluxo. Se o caudal for demasiado lento, o tecido pode tornar-se hipóxico. Por outro lado, se o caudal for demasiado elevado, o gás pode não ser suficientemente aquecido e hidratada levando a secagem do tecido. Taxa de fluxo de gás de alta poderia também aumentar a possibilidade de a pulverização de água sobre o tecido a partir do banho de água abaixo levando ao choque osmótico. Isto pode ser evitado pela adição de pedaços de rede de nylon (100 um) na saída das portas de deflexão.
- Escorra o circuito e encher com ACSF filtrada.
- Coloque o anel que irá apoiar a fatia na câmara de retenção. Um filtro de rede tecida com aberturas de malha de 500 a 750 um é esticado e ligado ao anel com resina de duas partes de cola epóxi. O filtro de rede de tecido é feito de 87% de poliamida e 13% elastano (calça 15 den). Cola deve ser aplicado com cuidado para evitar a formação de relevos na superfície da ring.
- Remova cuidadosamente todas as bolhas de ar do circuito.
- Ajustar o nível de ACSF na câmara de registo com o parafuso da agulha de aspiração. A velocidade das bombas peristálticas é ajustado para 1 ml / min para a entrada da bomba e a 5 ml / min, para a saída da bomba.
O sistema de perfusão é colocado sobre uma mesa de vibração rígida resistente e rodeado por uma gaiola de Faraday.
3. Preparação da área de dissecção
Instrumentos cirúrgicos: um bisturi com lâmina n º 11, tesoura pequena padrão de dissecação, tesouras, pinças de mola curvas, duas Heidemann espátulas e uma colher.
Material suplementar: uma guilhotina, um resguardo, um triturador de tecido Mcllwain, com uma lâmina de barbear, papel de filtro, uma pipeta de Pasteur de vidro com uma tetina de borracha, duas pipetas de Pasteur de plástico uma das quais com uma boca larga, uma placa de Petri, um cilindro metálico 7 mm de diâmetro (Figura 2A).
- Lay out instrumentos em ordem de uso. Adicionar três camadas de papel de filtro na placa de triturador de tecido e uma lâmina nova lavados com água destilada e com éter (Figura 2B). A lâmina deve ser horizontal quando toca o papel. Força da lâmina é ajustada a metade do valor da velocidade máxima e a cerca de um terço do valor máximo.
- Atentamente verificar se tudo está pronto (instrumentos, temperatura ...), porque você não vai ter tempo depois.
- Peça a alguém para pulverizar a dissecção com uma pipeta Pasteur preenchido com ACSF frio.
- Anestesiar o rato com IP Nembutal (100 mg / kg) antes de decapitação. Anestesia halotano também podem ser usadas. Comparamos os dois métodos e obtainada mesmos resultados. Decapitação deve ser realizada sob anestesia mas deslocamento cervical também podem ser utilizados. No entanto deslocamento cervical precisa de uma boa prática para evitar o sofrimento do animal.
- Dissecar no resguardo tão rapidamente quanto possível, sob frio ACSF contínuo banho.
4. Remoção cérebro
- Enquanto ainda segurando a cabeça com o dedo indicador eo polegar de uma das mãos sobre a boca, fazer uma incisão com a tesoura de dissecção ao longo do meio do topo da cabeça começando na borda do corte guilhotina e funcionando rostralmente até o osso frontal .
- Cortar o músculo cutâneo em cada lado da cabeça para expor totalmente as placas do crânio e remover os músculos na parte lateral da cabeça do caudal.
- Com as tesouras de dissecação, cortados do músculo temporal de cada lado, ao longo da placa temporal, depois cortar as placas frontais no meio, transversalmente. Em seguida, fazer um pequeno corte no osso occipital, entre os dois plates.
- Para cada um dos lados, cortadas na base caudal das placas occipitais.
- Corte ao longo da sutura sagital com uma tesoura de mola.
- Com uma pinça, retire as metades do crânio, espalhando-los longe um do outro.
- Com o bisturi, cortar transversalmente logo após o bulbo olfatório e pouco antes do cerebelo, em seguida, mergulhar o cérebro extraído no prato de dissecação com ACSF frio.
5. Dissecção do hipocampo
- Uma vez que o cérebro está imersa no prato de dissecação, separar os dois hemisférios do outro com um bisturi inserido no meio.
- A dissecção do hipocampo é realizada com espátulas sob controle visual por meio de um microscópio cirúrgico binocular (X25, Figura 2A). Em um hemisfério, cuidadosamente espalhar as estruturas para ver o ventrículo lateral. Remover o tronco cerebral e diencéfalo. Isto é feito pela aplicação da espátulas no córtex frontal de um lado e do diencéfalo naoutro lado. Tome cuidado para não tocar no hipocampo com o espátulas e não esticá-lo durante o corte do tecido.
- Sever do fornix então empurre o hipocampo fora do córtex (rolar), através da inserção de uma espátula no ventrículo.
- Quando o hipocampo é extraído, remover o excesso de tecido cortical e restantes vasos sanguíneos.
6. Corte das fatias
- Com um plástico de boca larga pipeta Pasteur, transferir o hipocampo em uma colher com seus Alvear para cima da superfície (lado convexo).
- Remover o excesso de fluido com uma pipeta de Pasteur de plástico normal.
- Dica a colher verticalmente quase tocando o papel de filtro do helicóptero (Figura 2B) e cair fora do hipocampo da colher, tocando rapidamente o papel de filtro, em seguida, voltar a colher.
- Orientar o hipocampo e corta transversalmente a 400 m com o helicóptero (ver Figura 2C para orientação do hipocampopus em relação à lâmina de barbear). Aja tão rapidamente quanto possível.
- Retire o papel de filtro com o hipocampo fatias e envolvê-la em torno do cilindro metálico para espalhar as fatias um pouco. Então, sem as fatias com sprays de ACSF usando um padrão de plástico pipeta Pasteur e coletá-los em uma placa de Petri cheia de ACSF frio.
7. Incubação de fatias em interface
- Seleccione fatias com uma pipeta de Pasteur de plástico padrão e colocá-los rapidamente na câmara de gravação. Fatias recuperar do trauma dissecção directamente na câmara de gravação, em relação a 28 ° C.
- A fatia será mais provável pia. Diminuir o nível de fluido para atingir o nível fatia, e, em seguida, aumentá-lo para fazê-lo flutuar.
- Vire a fatia na posição correta, baixando o nível. As fatias são sempre orientada da mesma forma a facilitar o posicionamento dos eléctrodos (2 estimulante e um eléctrodos de registo), na região CA1.
- Pare quandoo fluido está na interface. Um "menisco" dos meios de comunicação em torno da fatia é indicativo de um nível suficiente de meios de comunicação. O filtro de rede deve ser saturado com a mídia, mas não completamente submerso.
- Manter a câmara coberta com papel de filtro colocado sobre a tampa perfurada.
- Deixe o resto fatia de pelo menos 1,5 horas a 28 ° C.
8. Gravação de respostas sinápticas
- Gravação de eletrodo: capilares de vidro são puxados para obter uma resistência de ponta de 2-5 mohms quando preenchidos com ACSF. Um pequeno pedaço de papel de filtro é colocado em torno da ponta do eléctrodo e cera óssea é aplicada na extremidade para reduzir a condensação. Eletrodos estimulantes: eletrodos bipolares de cluster de platina-irídio, com um diâmetro de 12,5 m são comprados de FHC (EUA). Com os devidos cuidados, cada eletrodo pode ser usado pelo menos 30 vezes (Figura 1B).
- Posicione os eletrodos na radiatum estrato da região CA1, todos os eletrodos alinhadoscima (Figura 3A). Os eléctrodos são reduzidos 75-150 mM sob a superfície da fatia com micromanipuladores Narishige. Os dois eletrodos estimulantes são colocadas para estimular a dois pacotes distintos de Schaffer garantias. Quando os eletrodos são rebaixados para a fatia, papéis de filtro são cuidadosamente colocados ao redor para fechar a câmara.
- Estimulação bifásica (0,08 ms de duração de pulso por meio de ondas) é realizada em tensão constante com um estimulador de grama ligado a unidades de isolamento SIU-V. Resposta máxima é verificada, aumentando a intensidade do estímulo de 2 V a 12 V. máximo EPSP de campo são amplificados 1000 vezes com um WPI ISO-amplificador 80 e filtrada em 10 Hz e 10 kHz. O sinal é então enviada para um PC através de uma National Instrument conversor A / D. Estimulação, aquisição e análise de dados são realizadas utilizando o programa WinLTP ( www.winltp.com ). EPSP de campo são registados a 40% da amplitude máxima obtida numa entrada Saídacolocar curva. Para cada fatia, as encostas fEPSP são normalizados contra a inclinação média do min 30 precedendo indução da LTP.
- A LTP é desencadeada pela aplicação de um único trem de estimulação (100 Hz) para testar a força de uma via enquanto o segundo percurso serve como controlo.
9. A limpeza do Setup
- Lavar todo o circuito, com uma solução a 3% de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) durante pelo menos 10 min, depois drenar. O circuito terá de ser cuidadosamente lavado com água destilada antes de começar cada experiência. O uso de H 2 O 2, não é absolutamente necessário que outros laboratórios utilizam apenas água destilada para a limpeza, mas notamos a deposição de resíduos escuras no sistema tubagem quando se utiliza apenas água.
- Substituir a água em banho-maria sob a câmara de gravação.
- Banheira as dicas eletrodos estimulantes no álcool por 5 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Esta metodologia foi utilizada para analisar as propriedades de potenciação de longa duração a longo prazo induzida em fatias de hipocampo agudas a partir de ratos adultos (C57Bl/6J JANVIER SAS, França) 14. Surpreendentemente, a melhoria das condições experimentais levou a uma nova forma de olhar para a LTP. Nós mostramos que o aumento de longa duração em sináptica não exigem a síntese de novas proteínas.
Aqui, vamos mostrar que a indução de LTP depende fatias de viabilidade e excitabilidade. Quando a dissecção do hipocampo era muito lenta ou muito nocivos, fatias excitabilidade aumentada e respostas polisinápticas pôde ser observado após a indução de LTP (Figura 3B). Neste caso, a indução de LTP foi muito menos eficaz e potenciação não foi mantida.
Nós gostaríamos de realçar o facto de que, mesmo em condições de fatias aparentemente saudáveis, técnicas têm uma grande influência sobre a duração da LTP induzido por uma únicatrem de estimulação. Em publicações anteriores, o nosso grupo mostraram que um PLP de curta duração pode ser transformado em um de uma longa duração, modificando as condições de recuperação da fatia 15. Nos anos de prática diária, observou-se que os melhoramentos sucessivos na nossa técnica conduziram a um aumento progressivo da duração da LTP induzida por uma única cadeia em condições normalizadas. Na verdade, as gravações feitas em 2005 mostraram uma LTP curta duração voltando aos valores basais em 3 horas (Figura 3C, círculos preenchidos). As modificações no processo de esvaziamento reduzir o tecido estica tornaram possível a obtenção de uma LTP mantida durante 6 h 16 (Figura 3C, quadrados a cheio). E, finalmente, a melhoria da oxigenação e da interface de controlo da temperatura, em combinação com o eléctrodo de normalização ter levado a um LTP estável durante mais de 8 horas (Figura 3C, círculos abertos). A diferença entre os três grupos é significativa (só way ANOVA, F (2,20) = 49,5, P <0,001).
Além disso, qualquer modificação da temperatura ou a oxigenação induziu um aumento ou a uma diminuição da resposta sináptica (Figura 4). O controlo destes parâmetros foi verificada sempre usando dois eletrodos estimulantes. LTP foi induzido em um feixe de Schaffer colaterais enquanto outro conjunto foi usado como um controlo interno de estabilidade sináptica.
Figura 1. Rig eletrofisiológico e cérebro câmara de gravação fatia. (A) circuito de perfusão com home-made sistema de perfusão gravidade alimented por uma bomba peristáltica, as unidades de estímulo isolado (dois por eletrodo), microscópio cirúrgico e câmara de gravação. (B) câmara de gravação Interface com a estimular eeletrodos de registro. Papéis de filtro ter sido removido da tampa para ver o anel de suporte da fatia. (C) A unidade de controlo 2 com estimuladores e osciloscópios, um conversor A / D, o software de controlo de temperatura e software WinLTP.
Figura 2. Ferramentas e materiais utilizados para o corte hipocampo. (A) Dissecção prato contendo ACSF refrigerado e microscópio cirúrgico. Bisturi montado com um # 11 lâmina, tesoura pequena padrão de dissecação, tesouras, pinças de mola curvas, duas Heidemann espátulas, colheres, dois plástico pipetas Pasteur um dos quais com uma boca larga, placa de Petri, cilindro metálico mm de diâmetro e anel 7, que suporta a fatia na câmara de gravação. (B) McIlwain tissue chopper. (C) Desenho e fotografar of o hipocampo esquerdo na posição para o corte. A orientação da lâmina de barbear é indicado pela linha a tracejado vermelho. Escala do retículo:. 1 milímetro Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 3. A indução de LTP em cortes de hipocampo. (A) Esboço mostrando as duas entradas independentes sinápticas S1 e S2 para a mesma população de neurónios. Em cada fatia, dois eletrodos de estimulação (S1 e S2) foram postas em prática. Via S1 foi utilizado para induzir a LTP, enquanto via S2 actuou como controlo. (B) a partir de vestígios fEPSP Amostra experiências individuais numa fatia perfeitamente saudáveis (à esquerda) e uma fatia apresentando um elevado nível de excitabilidade (direita). Eles foram registrados apenas bef minério a indução da LTP (traços vermelhos) e uma hora após a indução da LTP (vestígios azul). Quando as fatias não são perfeitamente saudáveis (à direita), as respostas polissinápticos são observados e fEPSP potenciação inclinação é reduzida. (C) Comparação dos cursos de tempo do declive fEPSP após LTP induzida por um único trem de estimulação de alta frequência (100 Hz, 1 sec) registrados em 2005, 2010 e 2011 em nosso laboratório. Os primeiros experimentos foram registrados em 2005 (círculos preenchidos, n = 11). Gravações posteriores (Villers, et al. 2.010) beneficiou de um procedimento de dissecção melhorado (quadrados preenchidos, n = 6). Os resultados atuais surgem de otimização da oxigenação interface e controle de temperatura, juntamente com a normalização do eletrodo (círculos abertos, n = 6). Clique aqui para ver a figura maior .
/ Files/ftp_upload/50483/50483fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50483/50483fig4.jpg "/>
Figura 4. Variação da inclinação fEPSP como uma função da temperatura e da taxa de fluxo de oxigénio. (A) Aumentar a taxa de fluxo de oxigénio no banho de água abaixo da câmara de gravação 0,15-0,25 L / min (curva azul) induz uma diminuição da inclinação fEPSP de 20% (curva de rosa). (B) Aumentando a temperatura 28-29 ° C (curva verde) induz um aumento de mais de 50% em fEPSP inclinação (curva rosa). Clique aqui para ver a figura maior .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Temos desenvolvido no nosso laboratório um protocolo que resulta da combinação de métodos desenvolvidos e utilizados por outros laboratórios têm uma grande experiência na LTP gravações 11,17. Este protocolo é adaptado para hipocampo do rato adulto e pode ser usado em animais de qualquer idade e qualquer genótipo de fundo. Ele também permite a análise da LTP em camundongos transgênicos desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer 18,19.
A utilização desse protocolo para fatias de hipocampo de ratos pode exigir algumas adaptações. Por exemplo, a maior parte dos estudos efectuados em ratos usar uma temperatura de 32 ° C em vez de 28 ° C. Mathis et al. 20 proposto um outro método para a preparação de fatias de hipocampo de ratinhos ou ratos idosos.
Material e métodos
Provenientes de camundongos C57BL/6J JANVIER SAS (França), mas mesmos resultados são obtidos a partir de ratinhos C57BL/6J com Charl es Rio França.
O hipocampo é rapidamente isolado enquanto o tecido é submergido em ACSF frio para reduzir os danos celulares. Isto permite uma redução da excitotoxicidade, mas é capaz de induzir a proliferação de sinapse 21,22 que podem mascarar maior plasticidade sináptica estrutural.
Então nós usamos um helicóptero tecido para cortar, em vez de vibratome. Um helicóptero tecido é particularmente bem adaptado para a secção de pequenos pedaços de tecido, como hipocampo mouse. No triturador de tecido, o hipocampo é sempre orientada da mesma maneira de acordo com o procedimento de Alger et al. 23. Colocaram as estrias na superfície alvear, visíveis com iluminação oblíqua, em paralelo com a lâmina de barbear. Este método fornece as fatias de hipocampo do corte a parte dorsal com um ângulo de 15 ° em relação ao eixo transversal (ver figura 2C). Posteriormente, as fatias são manipulados com um mínimo de contato direto.
ove_content "> Slices são mantidos em relação a 28 ° C logo após dissecação. Este método tem sido mostrado para reduzir a atividade polysynaptic e epileptogênese rato e rato fatias 24.Parâmetros externos são cuidadosamente controladas para obter resultados reprodutíveis. Eléctrodos estimulantes bipolares de fragmentação (FTC), são usados em vez de caseiras eléctrodos, a fim de aumentar a reprodutibilidade na indução, uma vez que a amplitude da indução de LTP realmente depende da qualidade eléctrodos.
Sistema ETC, da Universidade de Edimburgo 11 mantém uma temperatura constante e uniforme dentro de todo o equipamento experimental e consumo carbogen está estabilizada com um medidor de fluxo. Nível da interface é controlada visualmente com a ajuda de um microscópio cirúrgico binocular e é mantido muito estável, com um sistema de aspiração de bomba peristáltica.
Resultados
Este protocolo todosabe a indução de uma LTP muito estável que permanece dependente de condições externas tais como a temperatura e oxigenação. Temos anteriormente demonstrado que a LTP induzido nestas condições era dependente de receptores NMDA, α-CaMKII autofosforilação e a activação de PI3-quinase, que são as vias moleculares envolvidas no LTP clássicos 14. Em contraste, não fomos capazes de reproduzir a dependência da fase de manutenção da LTP em síntese de novas proteínas. A capacidade de inibidores da síntese de proteínas, e de anisomicina em particular, para impedir o desenvolvimento da fase tardia de L-LTP, quando foram aplicados em torno da indução tem sido repetidamente relatado 4,25. Isto levou à hipótese de que a estabilização geralmente realizada plasticidade sináptica por mais do que cerca de 2-3 horas necessária a activação pelo estímulo LTP-indutiva de uma síntese de novas proteínas transitória 26. No entanto, as experiências recentes sugeriram que as coisas eram mais complicadas 27 -32. LTP induzida nas nossas condições experimentais foi mantido mesmo na presença de inibidores de síntese de proteínas, sugerindo que outros mecanismos que nova síntese de proteínas pode ser envolvido na fase de duração da LTP.
No entanto, em experimentos in vitro sempre levanta a questão da relevância fisiológica do fenômeno observado. Corte induz modificações no estado de fosforilação de proteínas envolvidas em formas de atividade dependentes de plasticidade sináptica 33 e alteração do estado metabólico do tecido 34. A taxa de síntese de proteínas é reduzida de 10 a 15% do que a observada in vivo 35 e equilíbrio entre ARNm e proteínas é perturbado 36. Por todas estas razões, devemos ser cautelosos na interpretação dos resultados.
Por definição, a LTP é uma longa duração (dias, semanas) Realce de um rapidamente induzidas sinapse excitatória, o que provavelmentedesempenha um papel importante na memória de longo prazo. LTP, in vivo, pode durar várias semanas e mudanças semelhantes na força sináptica ocorre durante o aprendizado 37,38. Além disso, a maior parte do tempo, quando a LTP a longo prazo é prevenida por mutações, a memória a longo prazo é prejudicada 39.
Mais problemática é a paralelo entre a memória de curto prazo e de potenciação de curta duração a longo prazo. O primeiro problema é que a duração de cada fenómeno é desconhecido. Memória de curto prazo tem sido estudado de 1 hora a 1 dia após o procedimento de aprendizagem enquanto LTP curto prazo deve durar menos de 5 horas. A segunda pergunta é se a memória de curto prazo (ou curta duração LTP) é apenas um passo em frente memória de longo prazo (ou LTP duradoura) ou uma entidade separada com mecanismos moleculares distintos 40. Em terceiro lugar, não se sabe se a curto prazo LTP é induzida por um estímulo fraco que está aquém de causar LTP de longa duração, ou se é induzida pelo mesmo estímulo, mas umappears apenas quando os mecanismos subjacentes a LTP duradoura falhar.
A estabilidade de longa duração da LTP sob as nossas condições experimentais, pode ser visto como uma LTP curto prazo equivalente a memória de curto prazo duradoura entre 10 e 24 horas. Nesta forma de plasticidade sináptica, a síntese de proteínas, o qual é altamente reduzido em fatias, não é necessário e LTP pode ser induzida por um único trem de estimulação. Este aumento de longa duração em sináptica poderia ser devido a um aumento estável no número de receptores de AMPA na membrana pós-sináptica, sem remodelação espinha.
De acordo com esta hipótese, a síntese de proteínas pode ser necessário para o alargamento da coluna e as modificações estruturais das sinapses que conduzem a memória de longo prazo de várias semanas. Neste caso, a fase de decre PLP só podiam ser observados 24 horas após a indução. Infelizmente, até agora, fatias aguda só pode ser mantido vivo durante cerca de 16 horas.
et al. 41 demonstraram que, nestes murganhos, a LTP a curto prazo e in vivo na memória de curto prazo são prejudicadas enquanto plasticidade sináptica a longo prazo e da memória são preservados.
As discrepâncias entre os diferentes estudos realizados em diferentes laboratórios pode ser devido à duração da LTP de curta duração devido à variação da actividade enzimática, no estado metabólico das fatias ou na taxa de degradação da proteína de 42. A síntese da proteína poderia ser visto como um processo de reposição permissiva envolvendo reposição de enzimas que têm sido utilizados no processo de aprendizagem, ou de outros elementos constitutivos celulares 43.
Estes resultados destacam a importância das condições experimentais na estabilidade LTP. Um PLP estável independente da síntese de proteínas pode contribuir para estudar o papel de longa duração pós-traducModificações adicionais de proteínas sinápticas e os mecanismos subjacentes aumento estável no número de receptores de AMPA na membrana pós-sináptica, apesar do volume de receptores.
Este vídeo mostra um protocolo detalhado que deve esperamos ajudar a obter resultados reprodutíveis em diferentes laboratórios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos Bernard Foucart para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Belga para a Investigação Científica (FRS-FNRS) e pelo Fundo Rainha Elisabeth de Pesquisa Médica. Agnès Villers é pesquisador do Fundo Belga para a Investigação Científica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| NaCl | Sigma - Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma - Aldrich | S8875 | |
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333 | |
| D-glucose | Sigma - Aldrich | G7528 | |
| NaH2PO4 | Sigma - Aldrich | S9638 | |
| MgSO4 1M | Sigma - Aldrich | 63126 | |
| CaCl2 | Sigma - Aldrich | C4901 | |
| Carbogen | Air Liquide (Belgium) | ||
| Capillaries | WPI, Inc. (UK) | TW150-4 | |
| Stimulating Electrodes | FHC (USA) | CE2B30 | |
| Surgical tools | FST (Germany) | ||
| Filter paper 84 g/m2 | Sartorius | FT-3-105-110 | |
| Mesh | Lycra | 15 den | |
| Glue | UHU | plus endfest300 | |
| Instrument | |||
| Amplifier | WPI, Inc. (UK) | ISO-80 | |
| Interface recording chamber | FST (Germany) | ||
| Peristaltic pumps | Gilson (USA) | Minipuls 3 | |
| Temperature controller | University of Edinburgh | www.etcsystem.com | |
| Tissue Chopper | Mcllwain | ||
| Stimulators | Grass (USA) | S88X + SIU-V | |
| Program analysis | WinLTP | www.winltp.com | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 and MMO-220A | |
| Surgical microscope | Leica Microsystem | ||
| A/D converter | National Instruments | NIPCI-6229 M-series | |
References
- Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
- Douglas, R. M., Goddard, G. V. Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus. Brain Res. 86, 205-215 (1975).
- Squire, L., Kandel, E. Memory: From mind to molecules. , WH Freeman & Company. New York, New York, USA. (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).
- Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).
- Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).
- Migues, P. V., Hardt, O., et al. PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking. Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).
- Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).
- Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones. J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).
- Fonseca, R. Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture. Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).
- Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).
- Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation. J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development. PLoS One. 7 (7), e40823 (2012).
- Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions. Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).
- Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture. Neuroreport. 21, 210-215 (2010).
- Nguyen, P. V., Kandel, E. R. Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus. Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).
- Dewachter, I., Ris, L., et al. Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1. Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).
- Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice. Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330 (2011).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., et al. Appendix: Brain slice methods. Brain Slices. Dingledine, R. , Plenum. New York. 381-437 (1984).
- Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons. Brain Res. 775, 134-143 (1997).
- Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation. Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).
- Rudy, J. W. Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis. Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).
- Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin. J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).
- Volianskis, A., Jensen, M. S. Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus. J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).
- Ris, L., Villers, A., Godaux, E. Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation. Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).
- Abbas, A. -K., Dozmorov, M., et al. Persistent LTP without triggered protein synthesis. Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).
- Ho, O. H., Delgado, J. Y., O'Dell, T. J. Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro. J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).
- Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation. J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain. Brain Res. 99, 303-318 (1975).
- Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression. J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).
- Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice. J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).
- Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. Learning induces long-term potentiation in the hippocampus. Science. 313, 1093-1097 (2006).
- Grant, S. G. N., Silva, A. J.
- Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. Separate mechanisms for short- and long-term memory. Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).
- Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome. Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).
- Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A.
- Izquierdo, I. Long-term potentiation and the mechanisms of memory. Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).
