Summary
في السنوات الأخيرة وقد تجلى تشكيل الخلايا الجرثومية باستخدام أساليب الثقافة في المختبر باستخدام عدة أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية الجسدية. هذه المادة سوف يقدم بصريا التفريق بين الأطفال حديثي الولادة الماوس الخلايا الجذعية المشتقة إلى أوائل الخلايا الشبيهة البويضة.
Abstract
دراسة تشكيل خلية جرثومية والتمايز تقليديا صعبة للغاية نظرا لانخفاض أعداد الخلايا ومواقعها عميقة داخل الأجنة النامية. توفر "مغلقة" في النظام القائم على المختبر يمكن أن لا تقدر بثمن لفهمنا لعملية تكوين الأمشاج. وقد تجلى تشكيل البويضة تشبه الخلايا (OLCs) من الخلايا الجذعية الجسدية، معزولة عن الجلد الماوس حديثي الولادة، ويمكن تصور في هذا البروتوكول الفيديو. وOLCs الناتجة عن مختلف علامات متسقة مع البويضات مثل Oct4، فاسا، Bmp15، وScp3. ومع ذلك، فإنها لا تزال غير قادر على الخضوع لنضوج أو الإخصاب بسبب الفشل في إتمام الانقسام الاختزالي. سوف يشكل هذا البروتوكول توفير نظام يمكن أن يكون مفيدا لدراسة تشكيل مرحلة مبكرة وتمايز الخلايا الجرثومية إلى أكثر الأمشاج نضجا. أثناء تمايز في وقت مبكر من عدد من الخلايا معربا عن Oct4 (الخلايا الجرثومية مثل المحتملة) تصل ~ 5٪، ولكن في الوقت الراهن جمعةormation الوقود النووي من OLCs لا يزال غير فعال نسبيا. البروتوكول هو نسبيا على التوالي إلى الأمام على الرغم من رعاية خاصة ينبغي اتخاذها لضمان السكان خلية البداية هو صحي وعلى ممر في وقت مبكر.
Introduction
خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر، وتحدث عملية تكوين الأمشاج من خلال سلسلة من المراحل بما في ذلك الخلايا الجرثومية البدائية (المؤتمر الشعبي) تشكيل، والهجرة، وأخيرا الاستعمار من التلال الغدد التناسلية. خلال هذا الوقت الخضوع بغتش الانتشار والتمايز في الأمشاج بصورة متزايدة أكثر نضجا 1. حقيقة أن بغتش ترحيل من قاعدة السقاء في المعى المؤخر الجنين وأخيرا على طول الجدار الظهري استعمار في نهاية المطاف التلال الغدد التناسلية يجعل من الصعب للغاية لدراسة 2. على الرغم من التقدم في هذا المجال، وقد أعاق دراسات تحاول فهم تشكيل المؤتمر الشعبي والتمايز بواسطة عددهم محدود، والموقع، وطبيعة المهاجرة 3،4.
في السنوات الأخيرة وقد ثبت الخلايا الجذعية الجنينية لديها القدرة على تشكيل الخلايا الجرثومية في المختبر 5،6. وبالمثل، كما تم عرض العديد من الخلايا الجذعية الجسدية لديها القدرة على تشكيل الخلايا الجرثومية الفلبسبب زراعة في المختبر 7-11. تنبع مؤخرا الخلايا المعزولة من الجلد الماوس الجدد كانت متباينة في المختبر إلى خلايا تشبه الجرثومية والبويضات مرحلة مبكرة 12. أثناء تمايز مجموعة فرعية من الخلايا الجذعية معربا عن Oct4 زيادة وشكلت هياكل تشبه المجمعات قزع-البويضة. البويضة تشبه الخلايا (OLCs) يمكن التقاطها من الثقافات ومقارنة البويضات الطبيعية. باستخدام هذه الثقافة OLCs طريقة قياس 40-45 ميكرون ويتم الحصول على التي تعبر عن علامات مشابهة لالبويضات مثل Gdf9b، فاسا، وDAZL. حتى الآن على OLCs الناتجة تظل غير قادر حتى تنضج أو يتم إخصابها 12.
على الرغم من أن OLCs تزال عاجزة عن العمل البروتوكول المستخدم لتشكيل هذه OLCs قد لا تزال لديها فائدة باعتبارها مقايسة لدراسة تشكيل وتطوير في وقت سابق من الخلايا الجرثومية مرحلة ضمن مغلقة في نظام المختبر. المنشور الأصلي مناقشة تشكيل OLCs من ذلكالخلايا الجذعية ماتيك استخدام الجلد الخنزيري الجنين كمصدر الخلايا الجذعية 8. التوسع في هذه الدراسة عرضت الخلايا PGC مثل شكلت في وقت مبكر خلال التمايز الناجم عن أن تكون السلائف إلى OLCs وصريحة مثل علامات PGC كما OCT4، فاسا، ستيلا، C-KIT، وDAZL 13. تدعم هذه البيانات إمكانية الاستفادة من هذا النظام لدراسة تشكيل خلية جرثومية والتمايز في المختبر. سيظهر بروتوكول يستخدم لتشكيل OLCs من الجلد الماوس حديثي الولادة في هذه المقالة الفيديو. هذا البروتوكول يوفر في نموذج المختبر لدراسة تطور الخلايا الجرثومية التي يمكن أن توفر وسيلة لتوضيح العوامل الهامة لانتشارها وتمايز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. وسائل الإعلام إعداد
- إعداد وسائل الاعلام 2-3 ساعة في وقت مبكر من استخدام ومكان مع قبعة خففت في ثقافة الخلية الحاضنة حيث التجربة ستجرى. وسائل الإعلام المستخدمة في هذا البروتوكول:
- إعداد تنبع المتوسطة الخلية تتكون من DMEM/F12 تستكمل مع 1 × B27، 40 نانوغرام / مل bFGF و 20 نانوغرام / مل EGF.
- إعداد الجرثومية خلية متوسطة التمايز تتكون من M199 تستكمل مع 0.05 IU FSH، LH 0.03 IU، 3 ملغ / مل BSA، 5 ميكرولتر / مل ITS، 0.23 ملي البيروفات الصوديوم، 1 ملغ / مل فتوين، و1 نانوغرام / مل EGF. وسيط قاعدة تتألف من جميع الإضافات لكن إهمال FSH، LH وصندوق تعديل العولمة الأوروبي يمكن إعداد وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
2. تنبع تحضير خلية ثقافة
- عزل الخلايا الجذعية من الجراء الوليد الماوس كما هو موضح سابقا 12. استخدام الخلايا الجذعية في مرور 2-4 في المختبر الجرثومية تمايز الخلايا. كفاءةويرتبط تشكيل مكتب المستشار القانوني مباشرة لنوعية الخلايا الجذعية البداية. فمن الأفضل لبدء التمايز في أقرب وقت يبدو السكان نظيفة وصحية والتي هي عموما في جميع أنحاء مرور 2. مزيد من زراعة الخلايا الجذعية الماضي 2 مرور يؤثر سلبا على كفاءة تشكيل مكتب المستشار القانوني (نتائج غير منشورة).
- 48 ساعة قبل بدء التمايز ثقافة فرعية الخلايا الجذعية. إزالة كافة المجاميع علقت كروية الخليوي وسائل الإعلام أمضى من الطبق الثقافة، وذلك باستخدام ماصة المصلية، ومكان في أنبوب مل 15. من المهم أن جمع فقط المجاميع كروية مع وقف التنفيذ من الخلايا وليس الخلايا تعلق على الجزء السفلي من الطبق التي يتم التفريق بشكل عفوي.
- بيليه الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق.، تجاهل طاف، و resuspend في 500 ميكرولتر من وسائل الاعلام الخلايا الجذعية الطازجة تحسنت إلى 37 درجة مئوية. ماصة بلطف المجاميع أن تنأى جزئيا الخلايا. لا ماصة بقوة الخليةوسوف ق لأن هذا يقلل بقاء الخلية. غسل الخلايا فصلها جزئيا إلى 9.5 مل من الطازجة قبل حرارة متوسطة الخلايا الجذعية على التعلق 10 سم طبق خلية ثقافة منخفضة.
- عودة الخلايا إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 خلية ثقافة حاضنة لمدة 48 ساعة قبل بدء التمايز.
3. التمايز مكتب المستشار القانوني
- باستخدام ماصة المصلية إزالة الخلايا الجذعية من الطبق الثقافة ومكان في أنبوب مل 15، تترك وراءها أي خلايا المرفقة. بيليه الخلايا في 500 x ج و resuspend في 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني العقيمة. ماصة قوية الخلايا باستخدام مجموعة واسعة تحمل 1،000 غيض ميكرولتر في كتل يست أكبر من 10-20 الخلايا. دوري إزالة كمية صغيرة من الخلايا، خلال التفكك، وتحقق تحت المجهر الضوء الأبيض لتأكيد الخلايا مجمعة في كتل من 10-20 الخلايا الفردية. أكثر من التفكك سيؤدي إلى انخفاض بقاء الخلية.
- إضافة 9.5 مل PBS لفصل الخلايا وإضافة 15 ميكرولتر من هذا التعليق الخلية إلى عدادة الكريات لفرز الخلايا. بيليه الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
- اعادة تعليق الخلايا في تركيز 1.32X10 6 خلية / مل في متوسطة التمايز.
- لوحة الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر لكل بئر في أسفل شقة 24 طبق التعليق أيضا.
- وضع الطبق جيدا 24 إلى ثقافة الخلية الحاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمدة 48 ساعة. إزالة 250 ميكرولتر المتوسطة من كل بئر ومكان في المقابل وصفت أنبوب 1.5 مل. إضافة 250 ميكرولتر المتوسطة تمايز جديدة إلى كل بئر. أجهزة الطرد المركزي في المتوسط قضى في 500 x ج لمدة 5 دقائق. وتجاهل طاف. Resuspend أي الخلايا مكعبات في 50 ميكرولتر المتوسطة تمايز الطازجة والعودة إلى ثقافة المناظرة جيدا على لوحة التمايز.
- كل 48 ساعة تغيير نصف المتوسط ما يصل إلى يوم 12 من التمايز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في البداية الخلايا نعلق على طبق أسفل الثقافة وانتشرت. في 42-72 ساعة في التمايز تشكيل علقت OCT4 الخلايا إيجابية الصغيرة وتتكاثر (الشكل 1A). بعد فترة وجيزة من التصور من هذه الخلايا الأغلبية سوف تختفي والخلايا المرفقة ستشكل المجاميع مستعمرة كثيفة على الجزء السفلي الثقافة. بعد بضعة أيام هذه المجاميع وفصل من سطح الثقافة. في بعض هذه المجاميع ويمكن ملاحظة خلية كبيرة (الشكل 1B و 1C). على التصور الأولي للخلايا سيكون ~ 35 ميكرون في القطر. مع استمرار الثقافة وOLCs سوف تنمو لتصل إلى ~ 45 ميكرون في القطر. هذه هي OLCs ويمكن جمعها مع خلايا الدعم أو trypsinized للحصول على OLCs دون الخلايا الأخرى المرفقة (1D الشكل).
من أجل التأكد من أن OLCs التعبير عن محاضر مماثلة كما البويضات الطبيعية OLCs يمكن جمعها واختبارها للالتعبير عن هذه العلامات كما ZPC، Scp3، المكمل، Oct4، Bmp15، وفازا. في حين يتم التعبير عن Oct4 وفازا في الخلايا الجذعية غير المتمايزة عدة علامات مثل Bmp15 وZPC هي البويضة محددة. BMP15 هو عضو في الأسرة TGF-β وتشارك في بويضة والتنمية الجريبي. يتم إجراء محدد المنطقة الشفافة هيكل غشاء البويضة تتكون من عدة بروتينات بما في ذلك ZP3. التعبير عن هذه علامات محددة البويضة يمكن استخدامها لتأكيد وجود OLCs في التفرقة. وعلاوة على ذلك، يمكن التعبير عن علامات محددة الانتصافي مثل Scp3 والمكمل تحديد الخلايا يحتمل الانتصافي داخل منظومة الثقافة. في المثال قدمت 10 OLCs وجمعت 10 البويضات والتوليف [كدنا] مباشرة يؤديها (الشكل 2). تم اختبار العينات الناتجة ثم باستخدام PCR نصف الكمية. مقارنة التعبير عن هذه العلامات إلى البويضات الماوس الطبيعية نرىالاختلافات في مستويات النصوص (الشكل 2). سيتم أعرب العديد من علامات التي أعربت عنها البويضات بواسطة OLCs إذا كان تمايز ناجحة.
الشكل 1. الأشكال التضاريسية شيوعا خلال التمايز الناجم عن الخلايا الجذعية المشتقة من الجلد. أ) خلال مرحلة مبكرة الخلايا تمايز إيجابية لOCT4 (الأخضر) يمكن اكتشافه في الثقافة. هي ملطخة النوى مواجهة مع هويشت (الأزرق). ب) كما تقدم التمايز سيتبين بعض المجاميع الخلية مع OCT4 (الأخضر) الخلايا إيجابية تحيط بها OCT4 الخلايا سلبية. ويصور تلطيخ النووية مع هويشت أيضا (الازرق). ج) صورة الضوء الأبيض من بنية تشبه جريب بعد مفرزة من سطح الثقافة. د) خلال فرقويمكن رؤية erentiation كبير OCT4 الايجابية (الخضراء) الخلايا مثل البويضة إما تحيط بها خلايا منفردة أو في إطار الثقافة. أشرطة النطاق: A = 20 ميكرون، B = 100 ميكرون، ج = 40 ميكرون، د = 10 ميكرون.
الشكل 2. مستوى النص في OLCs، مقارنة مع البويضات، من علامات البويضة المشتركة. الممثل الوقت الحقيقي PCR النتائج التي تظهر مستوى نص علامات البويضة شيوعا في OLCs. هذه المقارنة الناتجة عن 10 خلايا تشبه البويضة يجري مقارنة ب 10 البويضات الماوس حديثي الولادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
حتى الآن OLCs وظيفية لم يتم تطويرها باستخدام تماما في المختبر فحص. مؤخرا دراسة من قبل هاياشي وآخرون. كان قادرا على إنتاج نسل من PGC تشبه الخلايا شكلت في المختبر ونقل في الجسم الحي لمزيد من التطوير 14. بدءا من خلايا ES أو الخلايا المحفزة التي يسببها أنهم كانوا قادرين على تشكيل المؤتمر الشعبي مثل الخلايا التي، عندما تعافى بعد زرع في الجسم الحي وكانت قادرة على أن تكون نضجت، المخصبة، واستخدامها لتوليد نسل 14. هذا يدل على أن الخلايا الجذعية من مصادر مختلفة لديها القدرة، وفقا للشروط الصحيحة، لتشكيل البويضات وظيفية.
جوانب معينة من نظام الثقافة هي الحاسمة لأنه يعمل. سلالة من الفئران تستخدم لعزل الخلايا الجذعية من المهم جدا. وقد تم تطوير هذا البروتوكول واستخدامها مع الفئران B6 من مختبر جاكسون (الأسهم # 008214). هذه الفئران تحمل التحوير Oct4-EGFP السماح تجاهualization من الخلايا معربا عن Oct4 عن طريق البروتين EGFP. عندما بروتوكول جرت محاولة استخدام الخلايا الجذعية من CD1 الفئران كفاءة أقل بكثير وكان تشكيل مكتب المستشار القانوني أقل موثوقية. حاليا كفاءة تشكيل مكتب المستشار القانوني لا يزال منخفضا حتى عند استخدام B6 الفئران. الخلايا الجذعية المستخدمة ينبغي أن تكون في مرور 2-4 قبل الشروع في تمايز الخلايا الجرثومية كما كفاءة تشكيل الخلية الجرثومية هو أقل من ذلك بكثير عند استخدام الخلايا مرور وقت لاحق. مصدر مختلف الكواشف وقد ثبت أيضا أن من المهم.
تحليل مختلف النصوص مرنا في OLCs قد تكون مفيدة في تحسين نظام الثقافة. باستخدام PCR شبه كمي يسمح للمقارنة بين عدة مستويات التعبير بين علامات OLCs والبويضات (الشكل 2). وتظهر النتائج أن OLCs التعبير عن أقل ZPC من البويضات، وهو ما قد يفسر طبيعة هشة وأرق المنطقة الشفافة غشاء من OLCs. التعبير عن علامة الانقسام الاختزالي
بروتوكول الموصوفة هنا يوفر التحكم في المختبر طريقة لدراسة تشكيل خلية جرثومية والتمايز. حاليا الخلايا PGC مثل المتولدة غير قادرين على تشكيل OLCs وظيفية عندما حافظت في المختبر. عند تجميعها مع الأطفال حديثي الولادة الخلايا الجسدية المبيض وزرعها في الجسم الحي الخلايا PGC مثل قادرون على تشكيل بصيلات مرحلة مبكرة الثانوية. ولكن عندما يتم استرداد OLCs أنها لا تزال غير قادرة على أن نضجت بشكل موثوق والمخصبة 12. الأداة المساعدة في هذا الاختبار يأتي من دراسة الخلايا الجرثومية قبل الانتصافي المشتقة من الخلايا الجذعية الجسدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يتم دعم الأشخاص ذوي الإعاقة من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة الزمالة (CIHR) ومنحة CIHR لجيرالد M. كيدر في جامعة وسترن. ويود الكاتب أيضا أن نعترف Julang لى فى جامعة جويلف للمساعدة في تطوير بروتوكول المعروضة هنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
- van den Hurk, R., Zhao, J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).
- Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration. Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).
- Lawson, K. A., Hage, W. J. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).
- Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation. Development. 110, 521-528 (1990).
- Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science. 300, 1251-1256 (2003).
- Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).
- Wang, L., Cao, J., et al. Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells. Cell Biosci. 2, 27 (2012).
- Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin. Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).
- Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line. Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).
- Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells. DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).
- Song, S. H., Kumar, B. M., et al. Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells. Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).
- Dyce, P. W., Liu, J., et al. In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin. PLoS One. 6, e20339 (2011).
- Linher, K., Dyce, P., Li, J. Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells. PLoS One. 4, e8263 (2009).
- Hayashi, K., Ogushi, S., et al. Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice. Science. , (2012).
