Summary
I de senere år har dannelsen av bakterieceller ved hjelp av in vitro-kultur metoder har blitt demonstrert ved hjelp av flere forskjellige typer av somatiske stamceller. Denne artikkelen vil visuelt presentere differensiering av nyfødte mus avledet stamceller til tidlig eggcelle-lignende celler.
Abstract
Studerer bakterie celle formasjon og differensiering har tradisjonelt vært svært vanskelig på grunn av lave celle tall og deres plassering dypt i utviklingsland embryoer. Tilgjengeligheten av en "lukket" in vitro-basert system kan være uvurderlig for vår forståelse av gametogenesis. Dannelsen av oocytten-lignende celler (OLCs) fra somatiske stamceller, isolert fra nyfødt mus hud, er påvist og kan visualiseres i denne videoen protokollen. De resulterende OLCs uttrykke ulike markører i samsvar med ubefruktede egg som Oct4, Vasa, Bmp15, og Scp3. Men de forblir ute av stand til å gjennomgå modning eller befruktning på grunn av en manglende evne til å fullføre meiose. Denne protokollen vil gi et system som er nyttig for å studere den tidlige fasen dannelse og differensiering av kjønnsceller i mer modne kjønnsceller. Under begynnelsen av differensiering av antall celler som uttrykker Oct4 (potensielle bakterie-lignende celler) når ~ 5%, men for tiden den formasjon av OLCs fortsatt relativt ineffektiv. Protokollen er relativt rett frem om forsiktighet bør tas for å sikre start cellepopulasjonen er sunt og på et tidlig passasje.
Introduction
Under tidlig embryogenesen oppstår gametogenesis gjennom en rekke stadier, inkludert opprinnelige bakterie celle (PGC) dannelse, migrasjon, og til slutt kolonisering av de gonadefunksjonen rygger. I løpet av denne tiden PGC'er gjennomgå spredning og differensiering inn i stadig mer modne kjønnsceller en. Det faktum at PGC'er migrere fra bunnen av allantois inn i embryo hindgut og til slutt langs dorsal veggen til slutt kolonisere de gonadefunksjonen rygger gjør dem svært vanskelig å studere to. Til tross for fremskritt i feltet har studier som forsøker å forstå PGC dannelse og differensiering blitt forhindret av sin begrensede antall, plassering og trekkende art 3,4.
I de senere år embryonale stamceller har vist seg å ha potensiale til å danne kimceller in vitro 5,6. Tilsvarende har flere somatiske stamceller også blitt vist å ha potensiale til å danne kimceller Follgrunn in vitro dyrkning 7-11. Nylig stamceller isolert fra nyfødt mus huden ble differensiert in vitro i bakterie-lignende celler og tidlig stadium oocytter 12. Under differensiering undergruppe av stamceller uttrykker Oct4 økt og strukturer som ligner cumulus-oocytten komplekser ble dannet. Eggcelle-lignende celler (OLCs) kan plukkes fra de kulturer og i forhold til naturlige eggceller. Ved hjelp av denne kulturen metoden OLCs måler 40-45 mikrometer er innhentet som uttrykker lignende markører til ubefruktede egg som Gdf9b, Vasa, og DAZL. Til dags dato den resulterende OLCs forbli ute av stand til å modne eller bli befruktet 12.
Selv om OLCs forbli ute av stand til å fungere protokollen som brukes for å danne disse OLCs fremdeles kan ha anvendelse som et assay for å studere dannelsen og utviklingen av tidligere stadium kimceller i en lukket in vitro-system. Originalens diskutere dannelsen av OLCs fra såmatic stamceller brukes fetal svin hud som en stamcelle kilde åtte. Utvider på at studien PGC-lignende celler dannet tidlig under indusert differensiering ble vist å være forløpere til OLCs og uttrykke slike PGC markører som OCT4, Vasa, STELLA, C-KIT, og DAZL 13. Disse data støtter potensialet av å utnytte dette system for å studere bakterie celle differensiering og dannelse in vitro. Protokollen benyttes til å danne OLCs fra nyfødt mus huden vil bli demonstrert i denne videoen artikkelen. Denne protokollen gir en in vitro modell for å studere bakterie celle utvikling som kan gi et middel for å belyse faktorer viktig for deres spredning og differensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Media Forberedelse
- Forbered media 2-3 hr i forkant av bruk og sted med en løsnet cap i cellekultur inkubator hvor forsøket vil ta sted. Medier som brukes i dagens protokollen:
- Forbered stamcelle medium bestående av DMEM/F12 supplert med 1 B27 x, 40 ng / ml bFGF, og 20 ng / ml EGF.
- Forbered bakterie celledifferensiering medium bestående av M199 supplert med 0,05 IU FSH, 0,03 IU LH, 3 mg / ml BSA, 5 pl / ml SIN, 0.23 mM natrium-pyruvat, 1 mg / ml Fetuin, og 1 ng / ml EGF. Et basismedium bestående av alle additiver men idet FSH, LH og EGF kan bli fremstilt og lagret ved 4 ° C i opp til en uke.
2. Stem Cell Culture Forberedelse
- Isolere stamceller fra nyfødte mus unger som tidligere beskrevet 12. Utnytte stamceller ved passering 2-4 for in vitro bakterie celle differensiering. EffektivitetenOLC formasjon er direkte relatert til kvaliteten av utgangsforbindelsene stamceller. Det er best å starte differensieringen så snart befolkningen synes rent og sunt som generelt er på rundt passasjen 2.. Videre dyrking av stamceller siste passering 2 påvirker negativt OLC dannelsen effektivitet (upubliserte resultater).
- 48 timer før start differensiering sub-kultur stamcellene. Fjern alle suspenderte sfæriske celleaggregater og brukt media fra kulturen fatet, ved hjelp av en serologisk pipette, og plasseres i en 15 ml tube. Det er viktig for kun å samle de suspenderte kuleformede aggregater av celler og ikke de cellene som var festet til bunnen av fatet som er spontant differensierende.
- Pellet cellene ved 500 xg i 5 min., Kast supernatanten og resuspender i 500 mL av friske stamceller media varmet til 37 ° C. Forsiktig pipette aggregatene som delvis tar avstand cellene. Ikke aggressivt pipette cellens da dette vil redusere celle levedyktighet. Vask delvis dissosiert celler i 9,5 ml av frisk forvarmet stamcelle medium på en lav vedlegg 10 cm cellekultur parabolen.
- Returner cellene til en 37 ° C, 5% CO 2 cellekultur inkubator i 48 timer før start av differensiering.
3. OLC Differensiering
- Ved hjelp av en serologisk pipette fjerne stamceller fra kultur tallerken og plasser i en 15 ml tube, la bak eventuelle tilkoblede celler. Pellet cellene ved 500 xg og resuspender i 500 mL sterilt PBS. Sprek pipette cellene ved hjelp av en bred fødte 1000 ul tips til klumper ikke større enn 10-20 celler. Med jevne fjerne en liten mengde av celler, under dissosiasjon, og sjekke under et hvitt lysmikroskop for å bekrefte aggregerte celler er i klumper av 10-20 individuelle celler. Over dissosiasjon vil resultere i redusert cellelevedyktighet.
- Legg 9,5 ml PBS til de dissosierte cellene og tilsett 15 ul av denne cellesuspensjon til et hemocytometer for celle-telling. Pelletere cellene ved 500 xg i 5 min.
- Resuspendere cellene ved en konsentrasjon på 1.32X10 6 celler / ml i medium differensiering.
- Plate cellene ved å legge til 500 mL per brønn inn i en flat bunn 24 godt suspensjon parabolen.
- Plasser 24 vel fatet i en cellekultur inkubator ved 37 ° C i 5% CO2 i 48 timer. Fjern 250 ul medium fra hver brønn og plasseres i et tilsvarende merket 1,5 ml rør. Tilsett 250 ul friskt medium differensiering til hver brønn. Sentrifuger brukte mediet ved 500 xg i 5 min. og kast supernatanten. Resuspender eventuelle pelleterte celler i 50 ul friskt medium differensiering og returnere til den tilsvarende kulturbrønn på differensieringen plate.
- Hver 48 timers endre halve medium opp til dag 12 av differensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utgangspunktet cellene fester seg til kultur tallerken bunnen og spre seg. På 42-72 timer i differensiering små suspendert Oct4 positive cellene danner og sprer (figur 1A). Kort tid etter at visualisering av disse cellene flertallet vil forsvinne og de tilknyttede celler vil danne tette kolonier aggregatene på kulturen bunnen. Etter noen dager disse aggregatene vil løsne fra kulturen overflate. I noen av disse aggregatene en stor celle kan observeres (fig. 1b og 1c). Ved førstegangs visualisering cellene vil være ~ 35 pm i diameter. Med fortsatt kulturen de OLCs vil vokse til nå ~ 45 mikrometer i diameter. Disse er de OLCs og kan samles med støtte eller celler trypsinisert for å oppnå OLCs uten andre celler festet (fig. 1d).
For å bekrefte at OLCs uttrykke lignende transkripsjoner som naturlige oocytter de OLCs kan samles inn og testes foruttrykk for slike markører som ZPC, Scp3, CMOS, Oct4, Bmp15, og Vasa. Mens Oct4 og Vasa er uttrykt i udifferensierte stamceller flere markører som Bmp15 og ZPC er eggcelle bestemt. BMP15 er medlem av TGF-β familie og er involvert i eggcelle og follikkelutvikling. Eggcelle bestemt zona pellucida membran strukturen er bygd opp av flere proteiner, inkludert ZP3. Uttrykket av disse oocytten spesifikke markører kan brukes til å bekrefte tilstedeværelse av OLCs i differensiering. Videre kan uttrykket for meiotisk spesifikke markører som Scp3 og CMOS identifisere potensielt meiotisk celler i kultur-system. I eksemplet gitt 10 OLCs og 10 oocytter ble samlet og direkte cDNA syntese utføres (figur 2). De resulterende prøver ble deretter testet ved hjelp av semi-kvantitativ PCR. Sammenligne uttrykket av disse markørene til naturlige mus oocytter vi serforskjeller i nivåene av transkripter (figur 2). Mange markører uttrykt av ubefruktede egg vil bli uttrykt ved OLCs hvis differensiering var vellykket.
Figur 1. Vanlige morfologi under indusert differensiering av hud avledet stamceller. a) I løpet av tidlig stadium differensiering cellene positive for OCT4 (grønn) kan påvises i kulturen. Kjernene er mot farget med Hoechst (blå). B) Som differensiering utvikler noen celleaggregater vil bli sett med OCT4 (grønn) positive celler omgitt av Oct4 negative celler. Nukleær farging med Hoechst er også avbildet (blå). C) En hvit lys-bilde av en follikkel-lignende struktur etter løsgjøring fra kulturmediet overflate. D) Under differentiation store Oct4 positive (grønn) eggcelle-lignende celler kan sees enten omgitt av celler eller enkeltvis innenfor kultur. Skala barer A = 20 pm, b = 100 mikrometer, c = 40 pm, d = 10 mikrometer.
Figur 2. Karakterutskrift nivå i OLCs, sammenlignet med ubefruktede egg, av vanlige oocytten markører. Representative sanntid PCR resultater som viser karakterutskriften nivå av felles oocytten markører i OLCs. Denne sammenligningen er et resultat av 10 eggcelle-lignende celler blir sammenlignet med 10 nyfødte mus eggceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hittil funksjonelle OLCs ikke har blitt utviklet ved hjelp av en helt in vitro-analysen. Nylig en studie av Hayashi et al. Var i stand til å produsere avkom fra PGC-lignende celler dannet in vitro og overført in vivo for videreutvikling 14. Fra og med ES-celler eller indusert pluripotente celler de var i stand til å danne PGC som celler som, når den kom seg igjen etter in vivo transplantasjon var i stand til å bli modnet, gjødslet, og brukes til å generere avkom 14.. Dette viser at stamceller fra forskjellige kilder har potensial, under riktige betingelser, for å danne funksjonelle oocytter.
Visse aspekter av kulturen system er kritiske til det fungerer. Den stamme av mus anvendes for å isolere stamceller er meget viktig. Denne protokollen ble utviklet og brukt med B6 mus fra Jackson Lab (Stock # 008214). Disse musene bære en Oct4-EGFP transgene slik visualization av celler som uttrykker Oct4 via EGFP protein. Når protokollen ble forsøkt å bruke stamceller fra CD1 mus effektiviteten var mye lavere og OLC formasjonen var mindre pålitelig. Foreløpig effektiviteten av OLC dannelse fortsatt lav selv ved bruk av B6 mus. Stamcellene benyttes bør være passasje 2-4 før start bakterie celle differensiering som effektiviteten av bakterie celle formasjonen er mye lavere når du bruker senere passasje celler. Kilden for forskjellige reagenser også har vist seg å være viktig.
Analysen av forskjellige mRNA transkripter i OLCs kan vise seg nyttig for å optimalisere kultursystem. Ved hjelp av semi-kvantitativ PCR tillater sammenligning med flere markører ekspresjonsnivåer mellom OLCs og oocytter (figur 2). Resultatene viser at OLCs uttrykke mindre ZPC enn ubefruktede egg, noe som kan forklare den skjøre natur og tynnere zona pellucida membran av OLCs. Uttrykket av meiose markør
Protokollen er beskrevet her gir en kontrollert in vitro metode for å studere bakterie celle formasjon og differensiering. For tiden PGC-lignende celler som genereres er i stand til å danne funksjonelle OLCs når opprettholdt in vitro. Når aggregert med nyfødte eggstokkene somatiske celler og transplantert in vivo de PGC-lignende celler er i stand til å danne tidlig stadium sekundære follikler. Men når OLCs er gjenopprettet de fortsatt ikke kan bli pålitelig modnet og gjødslet 12. Verktøyet i denne undersøkelse kommer fra å studere pre-meiotisk kimceller avledet fra somatiske stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
PWD er støttet av en kanadiske Institutes of Health Research Fellowship (CIHR) og en CIHR stipend til Gerald M. Kidder ved Western University. Forfatteren ønsker også å erkjenne Julang Li ved University of Guelph for hjelp med utviklingen av protokollen som presenteres her.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
- van den Hurk, R., Zhao, J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).
- Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration. Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).
- Lawson, K. A., Hage, W. J. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).
- Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation. Development. 110, 521-528 (1990).
- Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science. 300, 1251-1256 (2003).
- Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).
- Wang, L., Cao, J., et al. Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells. Cell Biosci. 2, 27 (2012).
- Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin. Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).
- Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line. Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).
- Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells. DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).
- Song, S. H., Kumar, B. M., et al. Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells. Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).
- Dyce, P. W., Liu, J., et al. In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin. PLoS One. 6, e20339 (2011).
- Linher, K., Dyce, P., Li, J. Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells. PLoS One. 4, e8263 (2009).
- Hayashi, K., Ogushi, S., et al. Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice. Science. , (2012).
