Summary
Au cours des dernières années, la formation de cellules germinales en utilisant des méthodes de culture in vitro a été démontrée en utilisant différents types de cellules souches somatiques. Cet article va présenter visuellement la différenciation des cellules souches dérivées de souris nouveau-nés aux cellules ovocyte comme au début.
Abstract
Étude de la formation des cellules germinales et la différenciation a toujours été très difficile en raison du faible nombre de cellules et de leur localisation profonde dans les embryons en développement. La disponibilité d'un «fermé» dans le système de base vitro pourrait s'avérer précieuse pour notre compréhension de la gamétogenèse. La formation d'ovocytes-comme les cellules (LCO) à partir de cellules souches somatiques, isolés à partir de peau de souris nouveau-né, a été démontrée et peut être visualisé dans ce protocole vidéo. Les LCE résultant expriment différents marqueurs compatibles avec les ovocytes comme Oct4, Vasa, BMP15, et SCP3. Toutefois, ils demeurent incapables de se soumettre à la maturation ou la fertilisation en raison d'un défaut de terminer la méiose. Ce protocole fournira un système qui est utile pour l'étude de la formation à un stade précoce et la différenciation des cellules germinales en gamètes matures. Au cours de la différenciation précoce du nombre de cellules exprimant Oct4 (cellules germinales potentielles comme) atteint environ 5%, mais a le formation de LCO reste relativement inefficace. Le protocole est relativement simple si des précautions particulières doivent être prises pour assurer la population de la cellule de départ est en bonne santé et à un passage précoce.
Introduction
Au cours de l'embryogenèse précoce, gamétogénèse se produit à travers une série d'étapes, y compris cellule primordiale de germe (PGC) formation, la migration, et enfin la colonisation des crêtes génitales. Pendant ce temps PGC subissent la prolifération et la différenciation en gamètes de plus en plus matures 1. Le fait que les PGC migrent à partir de la base de l'allantoïde dans l'intestin postérieur de l'embryon et, enfin, le long de la paroi dorsale finalement coloniser les crêtes génitales qui les rend extrêmement difficiles à étudier 2. Malgré les progrès réalisés dans le domaine, les études qui tentent de comprendre la formation PGC et différenciation ont été entravés par leur nombre limité, l'emplacement et la nature migratoire de 3,4.
Ces dernières années, les cellules souches embryonnaires ont été montré pour avoir le potentiel pour former des cellules germinales in vitro 5,6. De même, plusieurs cellules souches somatiques ont également été montrés pour avoir le potentiel pour former des cellules germinales Follen raison de culture in vitro 7-11. Récemment cellules souches isolées à partir de peau de souris nouveau-né ont été différenciées in vitro en cellules germinales et des ovocytes comme un stade précoce 12. Au cours de la différenciation du sous-ensemble des cellules souches exprimant Oct4 augmentée et des structures ressemblant à des complexes cumulus-ovocytes ont été formés. L'ovocyte-comme les cellules (LCE) peuvent être ramassés par les cultures et comparés aux ovocytes naturelles. En utilisant cette méthode de mesure culture LCO 40-45 um sont obtenus qui expriment des marqueurs similaires à ovocytes comme Gdf9b, VASA, et DAZL. À ce jour, les LCO résultant demeurent incapables de mûrir ou être fécondé 12.
Bien que les LCO restent incapables de fonctionner le protocole utilisé pour former ces LCO peut encore avoir une utilité comme un test pour étudier la formation et le développement des cellules germinales de stade plus précoce dans un système in vitro fermé. La publication originale discuter de la formation de LCO de manièrecellules souches matiques utilisés peau de porc foetal comme source de cellules souches 8. Développant cette étude, les cellules PGC-comme formées très tôt au cours de la différenciation induite ont été montrés à être les précurseurs de la LCE et d'exprimer de tels marqueurs PGC comme OCT4, VASA, STELLA, C-KIT, et DAZL 13. Ces données confirment le potentiel de l'utilisation de ce système pour étudier la formation des cellules germinales et la différenciation in vitro. Le protocole utilisé pour former LCE du nouveau-né peau de la souris sera démontré dans cet article de la vidéo. Ce protocole offre un modèle in vitro pour étudier le développement des cellules germinales qui peuvent fournir un moyen d'élucider les facteurs importants pour leur prolifération et la différenciation in.
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Protocol
1. Médias Préparation
- Préparer les médias 2-3 heures à l'avance de l'usage et du lieu avec un bouchon dévissé dans l'incubateur de culture cellulaire où l'expérience aura lieu. Médias utilisés dans le présent protocole:
- Préparer un milieu de cellules souches constitué de DMEM/F12 supplémenté avec 1 x B27, 40 ng / ml de bFGF, et 20 ng / ml d'EGF.
- Préparer milieu de différenciation des cellules germinales composé de M199 additionné de 0,05 UI de FSH, 0,03 UI LH, 3 mg / ml de BSA, 5 pl / ml ITS, 0,23 mM de pyruvate de sodium, 1 mg / ml Fetuin et 1 ng / ml d'EGF. Un support de base constitué de tous les additifs, mais en omettant la FSH, LH et FEM peut être préparé et conservé à 4 ° C pendant une semaine.
2. Culture cellulaire Préparation souches
- Isoler les cellules souches de nouveau-nés de souris comme décrit précédemment 12. Utiliser les cellules souches au passage 2-4 dans la différenciation des cellules germinales in vitro. L'efficacité de l'Formation OLC est directement liée à la qualité des cellules souches de départ. Il est préférable de commencer la différenciation dès que la population semble propre et sain qui est généralement aux alentours de passage 2. En outre la culture des cellules souches passage passé 2 affecte négativement l'efficacité de la formation OLC (résultats non publiés).
- 48 h avant d'initier la différenciation de sous-culture les cellules souches. Retirez tous les agrégats sphériques suspendus cellulaires et les médias usés provenant de la boîte de culture, à l'aide d'une pipette sérologique, et les placer dans un tube de 15 ml. Il est important de ne recueillir que les agrégats sphériques suspendus de cellules et non les cellules attachées au fond du plat qui sont spontanément de différenciation.
- Pellet les cellules à 500 xg pendant 5 min., Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 500 ul de milieu de cellules souches frais chauffé à 37 ° C. Pipette doucement les agrégats de dissocier partiellement les cellules. Ne pas agressive pipette la cellules que cela va réduire la viabilité cellulaire. Laver les cellules partiellement dissociés dans 9,5 ml de milieu de cellules souches pré-chauffé frais sur une attache 10 cm boîte de culture bas de la cellule.
- Remettre les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur de culture cellulaire pendant 48 heures avant le début de la différenciation.
3. Différenciation OLC
- Avec une pipette sérologique enlever les cellules souches provenant de la boîte de culture et le placer dans un tube de 15 ml, laisser derrière les cellules attachées. Pellet les cellules à 500 xg et remettre en suspension dans 500 pi de PBS stérile. Pipette vigoureuse des cellules en utilisant un large portaient 1.000 pointe ul en amas pas plus grandes que les cellules 10-20. Périodiquement, démonter une petite quantité de cellules, au cours de la dissociation, et vérifiez sous un microscope à lumière blanche pour confirmer cellules agrégées sont en touffes de 10-20 cellules individuelles. Au cours de dissociation va entraîner une diminution de la viabilité cellulaire.
- Ajouter 9,5 ml de PBS aux cellules dissociées et ajouter 15 l de cette suspension cellulaire à un hémocytomètre pour le comptage des cellules. Pellet les cellules à 500 xg pendant 5 min.
- Remettre en suspension les cellules à une concentration de 1.32x10 6 cellules / ml dans le milieu de différenciation.
- Plaque les cellules en ajoutant 500 ul par puits dans un fond plat 24 plat de suspension bien.
- Placer le plat à 24 puits dans un incubateur de culture de cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant 48 heures. Retirer 250 pi de milieu de chaque puits et placer dans un tube de 1,5 ml étiqueté en conséquence. Ajouter 250 pi de milieu de différenciation frais à chaque puits. Centrifugeuse à moyen passé à 500 g pendant 5 min. et jeter le surnageant. Reprendre les cellules sédimentées dans 50 pi de milieu de différenciation frais et revenir à la culture correspondant bien sur la plaque de différenciation.
- Chaque 48 h changer la moitié de la moyenne à 12 jours de différenciation.
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Representative Results
Initialement, les cellules se fixent au fond de la boîte de culture et étalées. À 42-72 h dans la différenciation des cellules en suspension OCT4 positifs petit formulaire et prolifèrent (Figure 1A). Peu de temps après la visualisation de ces cellules la majorité disparaît et les cellules attachées va former des agrégats de colonies denses au fond de la culture. Après quelques jours, ces agrégats se détacher de la surface de culture. Dans certains de ces agrégats une grande cellule peut être observé (figure 1b et 1c). Après la visualisation initiale, les cellules seront ~ 35 um de diamètre. Avec la culture continue des LCE va croître pour atteindre ~ 45 um de diamètre. Ce sont les LCE et peuvent être collectés avec les cellules de soutien ou de trypsine pour obtenir LCE sans autres cellules attachées (figure 1D).
Afin de confirmer que les LCO expriment transcriptions similaires comme ovocytes naturelles les LCO peuvent être prélevés et analysés pour l'expression de marqueurs tels que ZPC, SCP3, CMOS, Oct4, BMP15, et Vasa. Alors que Oct4 et Vasa sont exprimés dans les cellules souches indifférenciées plusieurs marqueurs tels que BMP15 et ZPC sont ovocyte spécifique. BMP15 est un membre de la famille de TGF-β et est impliquée dans l'ovocyte et le développement folliculaire. La structure de la membrane pellucide de l'ovocyte zona spécifique est constitué de plusieurs protéines dont ZP3. L'expression de ces marqueurs spécifiques d'ovocytes peut être utilisé pour confirmer la présence de LCO dans les différenciations. En outre, l'expression de marqueurs spécifiques tels que la méiose SCP3 et Cmos peut identifier les cellules potentiellement méiose dans le système de culture. Dans l'exemple fourni 10 LCE et 10 ovocytes ont été collectés et synthèse de l'ADNc directs effectués (Figure 2). Les échantillons obtenus ont ensuite été testés par PCR semi-quantitative. En comparant l'expression de ces marqueurs à des ovocytes de souris naturels que nous voyonsdifférences dans les niveaux de transcription (Figure 2). De nombreux marqueurs exprimés par les ovocytes seront exprimés par les LCE si la différenciation est réussie.
Figure 1. Morphologies ordinaires au cours de la différenciation induite par des cellules souches dérivées de la peau. a) Au cours de la différenciation des cellules à un stade précoce positifs pour OCT4 (vert) peut être détectée dans la culture. Noyaux sont contre-colorées avec Hoechst (bleu). B) Comme différenciation progresse certains agrégats cellulaires seront vus avec OCT4 (vert) des cellules positives entourés par OCT4 cellules négatives. Coloration nucléaire avec Hoechst est également représenté (bleu). C) A l'image de la lumière blanche d'une structure en forme de follicule après détachement à partir de la surface de culture. D) Pendant différentiation grandes OCT4 cellules positives (vert) ovocyte similaires peuvent être vus soit entouré par des cellules ou individuellement au sein de la culture. barres d'échelle: A = 20 pm, b = 100 pm, c = 40 um, d = 10 um.
Figure 2. niveau de la transcription dans les LCE, par rapport à des ovocytes, des marqueurs d'ovocytes communs. résultats de la PCR en temps réel représentatifs montrant le niveau de transcription des marqueurs d'ovocytes communs dans LCO. Cette comparaison est issu de 10 cellules ovocyte comme étant comparés à 10 ovocytes nouveau-nés de souris.
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Discussion
À ce jour LCE fonctionnelles n'ont pas été développé en utilisant un tout essai in vitro. Récemment, une étude réalisée par Hayashi et al. Était capable de produire une descendance de PGC-comme les cellules formées in vitro et in vivo transféré pour le développement 14. A partir de cellules souches embryonnaires ou des cellules pluripotentes induites, ils ont pu former PGC comme des cellules qui, une fois récupérée à la suite transplantation in vivo ont pu être mûri, fécondé, et utilisé pour générer descendance 14. Cela démontre que les cellules souches provenant de diverses sources ont la possibilité, dans de bonnes conditions, pour former des ovocytes fonctionnels.
Certains aspects du système de culture sont essentiels pour le fonctionnement. La souche de souris utilisées pour isoler les cellules souches est très important. Ce protocole a été développé et utilisé avec des souris B6 du laboratoire Jackson (Stock # 008214). Ces souris portent un transgène Oct4-EGFP permettant visualization de cellules exprimant la protéine par l'intermédiaire de Oct4 EGFP. Lorsque le protocole a été tentée en utilisant des cellules souches de souris CD1 le rendement est beaucoup plus faible et la formation OLC était moins fiable. Actuellement, l'efficacité de la formation OLC reste faible, même en utilisant des souris B6. Les cellules souches utilisées doivent être au passage 2-4 avant de lancer la différenciation des cellules germinales que l'efficacité de la formation de cellules germinales est beaucoup plus faible lors de l'utilisation des cellules de passage ultérieur. La source de divers réactifs s'est également avéré être important.
L'analyse des différents transcrits d'ARNm dans les LCO peut s'avérer utile dans l'optimisation du système de culture. En utilisant la PCR semi-quantitative permet la comparaison de plusieurs niveaux d'expression des marqueurs entre LCO et des ovocytes (Figure 2). Les résultats montrent que les LCO expriment moins ZPC que les ovocytes, ce qui peut expliquer la nature fragile et plus mince membrane pellucide membrane de LCO. L'expression du marqueur de la méiose
Le protocole décrit ici fournit une méthode contrôlée in vitro pour étudier la formation des cellules germinales et de différenciation. Actuellement, les cellules PGC-like générés sont incapables de former LCE fonctionnelles lorsqu'il est maintenu in vitro. Quand agrégées avec des cellules somatiques de l'ovaire nouveau-nés et transplanté in vivo les cellules PGC-like sont capables de former des follicules secondaires à un stade précoce. Toutefois, lorsque les LCE sont récupérés, ils sont encore incapables d'être mûri et fécondé 12 de manière fiable. L'utilité de cet essai est d'étudier les cellules germinales pré-méiotiques dérivées de cellules souches somatiques.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
PWD est soutenu par une bourse des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) et une subvention des IRSC pour Gerald M. Kidder à l'Université Western. L'auteur tient également à remercier Julang Li de l'Université de Guelph pour aider à l'élaboration du protocole présenté ici.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
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