Summary
Nos últimos anos, a formação de células germinativas, utilizando métodos de cultura in vitro tem sido demonstrada utilizando vários tipos diferentes de células estaminais somáticas. Este artigo irá apresentar visualmente a diferenciação de células-tronco derivadas de células de rato recém-nascidos oócito-como iniciais.
Abstract
Estudar a formação de células germinativas e diferenciação tem sido tradicionalmente muito difícil devido ao número de células de baixa e sua localização no fundo de embriões em desenvolvimento. A disponibilidade de uma "fechada" no sistema baseado em vitro pode se mostrar valiosa para a nossa compreensão de gametogênese. A formação de ovócitos-como células (OLCS) a partir de células-tronco somáticas, isoladas a partir da pele do rato recém-nascido, tem sido demonstrada e pode ser visualizado neste protocolo vídeo. Os OLCS resultantes expressam diversos marcadores consistentes com oócitos como Oct4 Vasa, BMP15, e Scp3. No entanto, continuam a ser incapazes de sofrer maturação ou fertilização, devido a uma falha de completar a meiose. Este protocolo irá proporcionar um sistema que seja útil para estudar a formação de fase precoce e de diferenciação das células germinativas em gametas mais maduros. Durante a diferenciação precoce, o número de células que expressam Oct4 (potenciais células germinativas e similares) atinge a 5%, no entanto o momento de formação de OLCS permanece relativamente ineficiente. O protocolo é relativamente simples que devem ser tomados cuidados especiais para assegurar a população de células de partida é saudável e em uma passagem antecipada.
Introduction
Durante a embriogénese precoce, gametogénese ocorre através de uma série de fases, incluindo células germinativas primordiais (PGC), a formação, a migração, e, finalmente, a colonização das cristas das gónadas. Durante este tempo, PGCs sofrer proliferação e diferenciação em cada vez mais maduras gametas 1. O facto de PGCs migrar a partir da base do alantóide no intestino posterior do embrião e, finalmente, ao longo da parede dorsal, eventualmente colonizar as cristas das gónadas que os torna extremamente difíceis de estudar 2. Apesar dos avanços na área, estudos que tentam compreender a formação e diferenciação PGC foram impedidos pelo seu número limitado, localização e natureza migratória 3,4.
Nos últimos anos, as células estaminais embrionárias demonstraram ter o potencial para formar células germinativas, in vitro 5,6. Da mesma forma, várias células estaminais somáticas também demonstraram ter o potencial para formar células germinativas exerdevido cultivo in vitro 7-11. Recentemente células-tronco isoladas a partir da pele do rato recém-nascido foram diferenciadas in vitro em células de germes como e ovócitos em estágio inicial 12. Durante a diferenciação do subconjunto das células estaminais que expressam Oct4 aumentada e estruturas que se assemelham complexos cumulus-oócitos foram formados. Os ovócitos do tipo células (OLCS) podem ser colhidos a partir das culturas e comparados com oócitos naturais. Usando este método de medição cultura OLCS 40-45 mM são obtidos que os marcadores semelhantes expresso para oócitos como Gdf9b, VASA e DAZL. Até à data, os OLCS resultantes permanecem incapaz de ser fertilizado ou amadurecer 12.
Embora os OLCS permanecem incapazes de funcionar o protocolo utilizado para formar estas OLCS ainda pode ter utilidade como um ensaio para o estudo da formação e desenvolvimento de células germinativas fase anterior num sistema in vitro fechado. A publicação original discutir a formação de OLCS de tãoAs células estaminais matic utilizada pele de porco fetal como fonte de células-tronco 8. Expandindo que o estudo das células, como PGC-formados cedo durante a diferenciação induzida mostraram ser os precursores da OLCS e expressar tais marcadores PGC como OCT4, VASA, STELLA, C-KIT, e DAZL 13. Estes dados apoiam a possibilidade de se utilizar este sistema para estudar a formação de células de gérmen e diferenciação in vitro. O protocolo utilizado para formar OLCS pele de rato recém-nascido será demonstrado neste artigo de vídeo. Este protocolo apresenta um modelo in vitro para estudar o desenvolvimento de células germinativas, que podem fornecer um meio para elucidar factores importantes para a sua proliferação e diferenciação.
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Protocol
1. Preparação de Mídia
- Prepare a mídia de 2-3 horas antes do uso e lugar com uma tampa solta na cultura de células incubadora onde o experimento será ocorrendo. Meios utilizados no presente protocolo:
- Prepare a haste meio celular que consiste em DMEM/F12 suplementado com 1 x B27, 40 ng / ml de bFGF, e 20 ng / ml de EGF.
- Prepara meio de diferenciação das células germinativas que consiste em M199 suplementado com 0,05 UI de FSH, LH 0,03 UI, 3 mg / ml de BSA, 5 ul / ml ITS, 0,23 mM de piruvato de sódio, 1 mg / ml de fetuina e 1 ng / ml de EGF. Um meio de base consistindo de todos os aditivos, mas omitindo a FSH, LH e EGF podem ser preparadas e armazenadas a 4 ° C durante até uma semana.
2. Preparação de células-tronco Cultura
- Isolar células-tronco de filhotes recém-nascidos de rato, como descrito anteriormente 12. Utilizar células-tronco no trecho 2-4 na diferenciação de células germinativas in vitro. A eficiênciaFormação OLC está directamente relacionada com a qualidade das células estaminais iniciais. É melhor iniciar a diferenciação assim como a população aparece limpo e saudável, que é geralmente de cerca de passagem 2. Além disso a cultura de células-tronco passado passagem 2 afeta negativamente a eficiência de formação OLC (resultados não publicados).
- 48 h antes do início da diferenciação sub-cultura das células estaminais. Remova todos os agregados suspensos esféricas celulares e mídia passou da placa de cultura, com uma pipeta sorológica, e coloque em um tubo de 15 ml. É importante recolher apenas os agregados esféricos em suspensão de células e as células não ligadas à parte inferior da cápsula que são espontaneamente diferenciador.
- Agregar as células a 500 xg durante 5 min., Rejeitar o sobrenadante e ressuspender em 500 ul de meio de células estaminais fresco aquecido a 37 ° C. Pipeta suavemente os agregados para se dissociam parcialmente as células. Não pipetar agressivamente o celulars como isso vai reduzir a viabilidade das células. Lave as células parcialmente dissociadas em 9,5 ml de meio de células-tronco pré-aquecido fresco em um anexo de 10 centímetros prato baixa cultura de células.
- Retorno as células a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora de cultura de células durante 48 horas antes do início da diferenciação.
3. Diferenciação OLC
- Usando uma pipeta sorológica remover as células-tronco a partir da placa de cultura e colocar em um tubo de 15 ml, deixar para trás as células anexados. Agregar as células a 500 xg e ressuspender em 500 ul de PBS estéril. Pipeta vigorosa as células usando uma ampla suportou 1.000 ponta mL em pedaços não maiores que 10-20 células. Periodicamente, remover uma pequena quantidade de células, durante a dissociação, e vá sob um microscópio de luz branca para confirmar as células estão em agregados aglomerados de 10-20 células individuais. Mais de dissociação irá resultar na redução da viabilidade das células.
- Adicionar 9,5 ml de PBS às células dissociadas e adicionar 15 ul desta suspensão de células com um hemocitómetro para contagem das células. Agregar as células a 500 xg durante 5 min.
- Re-suspender as células a uma concentração de 1.32X10 6 células / ml em meio de diferenciação.
- Placa as células por adição de 500 ul por cavidade em um fundo plano de 24 poços prato suspensão.
- Colocar o bem prato 24 numa incubadora de cultura de células a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 48 horas. Remover 250 mL meio de cada poço e colocar em um tubo ml correspondentemente rotulado 1.5. Adicionar 250 ul de meio de diferenciação fresco a cada poço. Centrifuga-se o meio consumido a 500 xg durante 5 min. e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células peletizadas em 50 ul de meio de diferenciação fresco e retornar para a cultura correspondente poço na placa de diferenciação.
- Cada 48 horas mudar metade do médio até ao dia 12 de diferenciação.
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Representative Results
Inicialmente as células anexar à cultura prato fundo e se espalhar. Às 42-72 horas em diferenciação suspensos oct4 células positivas pequenas formam e proliferam (Figura 1A). Pouco depois da visualização destas células a maioria vão desaparecer e as células ligadas irá formar agregados de colónias densas na parte inferior da cultura. Após alguns dias, estes agregados irá separar da superfície da cultura. Em alguns destes agregados de uma grande célula pode ser observado (Figura 1B e 1C). Após a visualização inicial, as células serão de ~ 35 um de diâmetro. Com a cultura continuada das OLCS vai crescer para alcançar ~ 45 um de diâmetro. Estes são os OLCS e podem ser coletadas com células de apoio ou tripsinizados obter OLCS sem outras células aderidas (Figura 1d).
A fim de confirmar que os OLCS expressam transcritos semelhantes como os oócitos naturais OLCS podem ser recolhidas e testadas para aexpressão de marcadores, como ZPC, Scp3, CMOS, Oct4, BMP15 e Vasa. Enquanto Oct4 e Vasa são expressos nas células estaminais indiferenciadas vários marcadores, como BMP15 e PCZs são oócito específico. BMP15 é um membro da família TGF-β e está envolvida no oócito e desenvolvimento folicular. A estrutura da membrana do oócito específico zona pelúcida é composta de várias proteínas incluindo ZP3. A expressão destes marcadores específicos de oócitos pode ser utilizado para confirmar a presença de OLCS nas diferenciações. Além disso, a expressão de marcadores específicos tais como Scp3 meióticas e CMOS pode identificar células potencialmente meióticos dentro do sistema de cultura. No exemplo fornecido OLCS 10 e 10 oócitos foram recolhidas e síntese de cDNA directa realizado (Figura 2). As amostras resultantes foram, então, testados por PCR semi-quantitativa. Comparando a expressão destes marcadores aos tapetes oócitos naturais vemosas diferenças entre os níveis de transcritos (Figura 2). Muitos marcadores expressos pelos oócitos é expressa pela OLCS se a diferenciação foi bem sucedida.
Figura 1. Morfologias comuns durante a diferenciação induzida de células estaminais derivadas da pele. a) Durante a fase inicial de diferenciação de células positivas para OCT4 (verde) podem ser detectados na cultura. Núcleos contador são corados com Hoechst (azul). B) A diferenciação avança alguns agregados de células será visto com OCT4 (verde) células positivas Oct4 rodeadas por células negativas. A coloração nuclear com Hoechst também é descrito (azul). C) uma imagem de luz branca de um folículo de estrutura seguinte, como descolamento da superfície da cultura. D) Durante diferentiation grandes oct4 células oócito-como positivas (verde) pode ser visto ou cercado por pilhas ou individualmente dentro da cultura. Barras de escala: a = 20 um, b = 100 mm, c = 40 um, d = 10 um.
Figura 2. Nível de transcrição em OLCS, em comparação com os oócitos, oócitos de marcadores comuns. Tempo real resultados representativos da PCR mostrando o nível de transcrição de marcadores de ovócitos comuns em OLCS. Esta comparação é resultante de 10 células oócito-como sendo comparado a 10 oócitos de camundongos neonatos.
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Discussion
Até à data OLCS funcionais não têm sido completamente desenvolvida usando um ensaio in vitro. Recentemente, um estudo realizado por Hayashi et al. Foi capaz de produzir descendência de PGC-como células formadas in vitro e in vivo, transferido para o desenvolvimento adicional 14. Começando com células-tronco embrionárias ou células pluripotentes induzidas foram capazes de formar PGC como células que, quando recuperado após transplante in vivo foi capaz de ser maturados, fecundados e usado para gerar prole 14. Isto demonstra que as células estaminais a partir de várias fontes têm o potencial, sob as condições adequadas, para formar oócitos funcionais.
Certos aspectos do sistema de cultura que são críticas para o funcionamento. A estirpe de ratinhos utilizada para isolar as células estaminais é muito importante. Este protocolo foi desenvolvido e usado com camundongos B6 do Jackson Lab (Stock # 008214). Esses animais carregam um transgene Oct4-EGFP permitindo visualization de células que expressam a proteína através de Oct4 EGFP. Quando o protocolo foi tentada utilizando células estaminais a partir de ratinhos CD1 a eficiência foi muito inferior e a formação OLC era menos fiável. Actualmente, a eficiência de formação de OLC permanece baixa mesmo quando se utilizam ratinhos B6. As células estaminais utilizados devem ser pelo passagem 2-4 antes de se iniciar a diferenciação das células germinativas, como a eficiência da formação de células germinativas é muito inferior quando se usa células de passagem posteriores. A fonte de vários reagentes provou também ser importante.
A análise de várias transcrições de mRNA nas OLCS pode ser útil na otimização do sistema de cultura. Usando PCR semi-quantitativo permite a comparação dos níveis de expressão de vários marcadores, entre OLCS e oócitos (Figura 2). Os resultados mostram que os OLCS expressar menos ZPC de oócitos, o que pode explicar a natureza frágil e fino zona pelúcida membrana de OLCS. A expressão do marcador meiose
O protocolo aqui descrito proporciona um método in vitro controlada para estudar a formação de células de gérmen e diferenciação. Actualmente, as células PGC semelhantes gerados são incapazes de formar OLCS funcionais quando mantidos in vitro. Quando agregados com células somáticas ovarianos e recém-nascidos transplantadas in vivo, as células de PGC-como são capazes de formar folículos secundários precoces. No entanto, quando os OLCS são recuperados eles ainda não são capazes de ser amadurecido de forma confiável e fertilizado 12. A utilidade deste ensaio vem do estudo de células germinativas pré-meióticos derivados de células estaminais somáticas.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
PWD é apoiado por um Canadian Institutes of Health Research comunhão (CIHR) e uma bolsa CIHR para Gerald M. Kidder na Universidade Ocidental. O autor também gostaria de reconhecer Julang Li, da Universidade de Guelph para obter ajuda com o desenvolvimento do protocolo apresentado aqui.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
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