Summary
近年、インビトロ培養法において用い生殖細胞の形成は、体性幹細胞のいくつかの異なるタイプを使用して実証されている。この記事では、視覚的に早期の卵母細胞様細胞に新生マウス由来幹細胞の分化を紹介します。
Abstract
生殖細胞の形成と分化を研究することは、伝統的に低い細胞数と途上胚奥深くその場所のために非常に困難であった。 試験管ベースのシステムで 、 "クローズド"の可用性は、配偶子形成の我々の理解のための貴重な証明することができた。新生児マウス皮膚から単離された体性幹細胞から卵母細胞様細胞（OLCs）の形成が実証されており、このビデオプロトコルで可視化することができる。結果OLCsはそのようなのOct4、ヴァーサ、BMP15、そしてSCP3として卵母細胞と一致し、様々なマーカーを発現する。しかし、彼らは成熟や減数分裂を完了するために、障害のために受精を受けることができないままです。このプロトコルは、より成熟した配偶子に生殖細胞の初期段階の形成と分化を研究するために有用であるシステムを提供します。初期の分化の間のOct4（電位生殖細胞様細胞）を発現する細胞の数をfしかしながら、現在、約5％に達するOLCsのormationは比較的非効率的なままです。特別な注意を出発細胞集団の健康と早いパッセージであることを確認するために取られるべきであるにもかかわらずプロトコルは比較的単純です。
Introduction
初期胚発生時には、配偶子形成は性腺尾根の始原生殖細胞（PGC）の形成、移行、および最終的に植民地化を含む一連の段階を介して行われます。この時間の間のPGCがますます成熟配偶子1に増殖および分化を受ける。始原生殖細胞は胚の後腸に尿膜のベースから、最終的には最終的には性腺尾根に定着背壁に沿って移動しているという事実には、2を勉強するには、それらを非常に困難になります。分野における進歩にもかかわらず、PGCの形成および分化を理解しようとする研究は、その限られた数、位置、渡り鳥自然3,4によって妨げてきた。
近年、胚性幹細胞は、 インビトロ 5,6 の生殖細胞を形成する電位を有することが示されている。同様に、いくつかの体性幹細胞は、生殖細胞のfollのを形成する可能性を有することが示されている体外培養7-11 のおかげ。最近生まれたばかりのマウスの皮膚から単離された細胞を幹生殖細胞様細胞と初期段階の卵母細胞12にin vitroで分化させた。分化中のOct4を発現する幹細胞のサブセットが増加し、構造が類似している卵丘 - 卵母細胞複合体を形成した。卵母細胞様細胞（OLCs）培養物から採取し、天然の卵母細胞と比較することができる。 40-45程度を測定するこの培養方法のOLCsを使用して得られるようGdf9b、VASA、そしてDAZLなどの卵母細胞に発現する類似のマーカー。現在までに生じOLCsが成熟することができないまま、12を受精する。
OLCsは、これらのOLCsを形成するために使用されるプロトコルは、依然として内の初期段階の生殖細胞の形成と発展を研究するためのアッセイとして有用性を有することができる機能することができないままであるが、インビトロ系で閉じた。そうからOLCsの形成を議論初版発行マチック幹細胞は、幹細胞源8として胎児のブタ皮膚を利用した。分化誘導時に早期に形成されたPGC様細胞は、OCT4としてOLCsと急行などPGCマーカーにVASA、STELLA、C-KIT、及びDAZL 13の前駆体であることが示されたその研究に拡大。このデータは、in vitroでの生殖細胞の形成と分化を研究するために、このシステムを利用する可能性をサポートしています。新生児マウスの皮膚からOLCsを形成するために利用プロトコルはこのビデオの記事で実証される。このプロトコルは、in vitroモデルにおけるそれらの増殖および分化に重要な要素を明らかにするための手段を提供することができる生殖細胞の発達を研究するために提供する。
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Protocol
1。メディアの準備
- 実験が行われる細胞培養インキュベーターで緩めキャップを使用し、場所の前にメディア2-3時間を準備します。現在のプロトコルで使用されるメディア：
- 1×B27、40 ngの/ mlのbFGFを、および20 ngの/ mlのEGFを補ったDMEM/F12から成る細胞培地を食い止める準備。
- 0.05 IUのFSH、0.03 IU LH、3 mg / mlのBSA、5μL/ mlのITS、0.23 mMのピルビン酸ナトリウム、1 mg / mlのフェツイン、および1 ngの/ mlのEGFを補ったM199から成る生殖細胞分化培地を準備します。全ての添加剤から構成されるが、FSHを省く基本培地は、LHおよびEGF℃で最大一週間のために準備し、4℃で保存することができます。
2。細胞培養の準備を食い止める
- 以前に12を説明したように生まれたばかりの仔マウスから幹細胞を分離します。 インビトロ生殖細胞分化のための通路2-4で幹細胞を利用する。の効率OLC形成を直接開始幹細胞の質に関連している。それは、すぐに人口が通路2付近で、一般的になっている清潔で健康な表示される分化を開始するのが最善です。一節過去さらに培養幹細胞2悪影響OLC形成効率を（未発表結果）に影響します。
- 従来のサブ培養幹細胞を分化を開始する48時間。すべて中断球状細胞凝集体を取り外し、血清ピペットを用いて、培養皿からメディアを費やし、、15 mlチューブで開催。それだけでサスペンド球状の細胞の集合体ではなく自発的に差別されているお皿の底に付着した細胞を回収することが重要です。
- ペレットを5分間500 xgで細胞。、上清を捨て、新鮮な幹細胞培地を500μlに再懸濁し、37℃に温め優しく部分の細胞を解離する凝集体をピペット。積極的に細胞をピペッティングしないでくださいこのようなsが細胞生存率が低下します。低アタッチメント10センチ細胞培養皿に新鮮予め温めておいた幹細胞培地の9.5ミリリットルに部分的に解離された細胞を洗浄します。
- 分化の開始前に48時間37℃、5％CO 2細胞培養インキュベーターに細胞を返す。
3。 OLC分化
- を15mlチューブに培養皿と場所から幹細胞を除去する血清用ピペットを使用して、接続されているすべてのセルを残す。ペレットを500μlの滅菌PBSで500×gで再懸濁しの細胞。活発なピペット広いを用いて細胞は10〜20セルより大きくない塊に1,000μlの先端を産んだ。定期的に解離の際、細胞の小さな量を削除し、集約された細胞が10〜20個々の細胞の塊である確認のため白色光顕微鏡下で確認してください。解離にわたり減少、細胞の生存率になります。
- 解離細胞は9.5 mlのPBSを加え、1を追加細胞計数のために血球計数器にこの細胞懸濁液5μlの。 5分間500×gでペレットは、細胞。
- 1.32X10 6細胞/分化培地におけるmlの濃度で細胞を再懸濁する。
- 500μlのウェルあたりに平底24ウェルサスペンション皿を追加することにより、プレートの細胞を。
- 48時間、5％CO 2で37℃細胞培養インキュベーターに24ウェルディッシュ°Cを置きます。それに応じてラベル1.5mlチューブで各ウェル場所から250μlの培地を除去。各ウェルに250μlの新鮮な分化培地を追加します。 5分間500 xgで過ごした培地を遠心分離。し、上清を捨てる。 50μlの新鮮な分化培地における任意のペレット化した細胞を再懸濁しと分化プレートにうまく対応する文化に戻ります。
- すべての48時間は、分化の12日目に半分の培地を変更してください。
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Representative Results
最初に細胞が培養皿の底に付着すると広がる。分化小さな浮遊OCT4陽性細胞に42から72時間後に形成し、増殖する（ 図1A）。まもなくこれらの細胞の可視化後大半が消え、付着した細胞は、培養底に密集コロニー凝集体を形成します。数日の後、これらの凝集体は、培養表面からデタッチします。これらの凝集体のいくつかにおいて大きなセル（ 図1bおよび図1c）を観察することができる。初期視覚化されると細胞は直径〜35μmとなります。継続的な文化とOLCsは直径〜45ミクロンに達するために成長します。これらはOLCsあるとサポート細胞を採取したり（ 図1d）が付属し、他のセルなしでOLCsを得るためにトリプシン処理することができます。
OLCsは自然卵母細胞と同様の転写物を発現することを確認するためには、OLCsために収集し、試験することができるZPC、SCP3、CMOSのOct4、BMP15、とヴァーサのようなマーカーの発現。 Oct4の 、 ヴァーサ号は未分化の幹細胞で発現されていますがそのようなBMP15とZPCのようないくつかのマーカーは、卵母細胞特異的である。 BMP15は、TGF-βファミリーのメンバーであり、卵母細胞と卵胞の発育に関与している。卵母細胞特異的透明帯膜構造体は、ZP3を含むいくつかのタンパク質で構成されている。これらの卵母細胞特異的マーカーの発現は、分化中のOLCsの存在を確認するために使用することができる。さらに、そのようなSCP3やCMOSなどの減数分裂特異的マーカーの発現は、培養系内で潜在的に減数分裂細胞を識別することができます。この例では10 OLCsと10卵母細胞収集及び直接cDNA合成が（ 図2）を実施したを提供した。得られた試料は、次いで、半定量的PCRを用いて試験した。私たちが見る自然マウス卵母細胞にこれらのマーカーの発現を比較する転写産物のレベルの差（ 図2）。差別化が成功したかどうか卵母細胞によって発現多くのマーカーはOLCsで表現されます。
図1。皮膚由来幹細胞の分化誘導時の一般的な形態。 OCT4（緑）のための正早期分化細胞時）は培養で検出することができる。核は、ヘキスト（青）とカウンターで染色されています。b）は、分化などのいくつかの細胞凝集がOCT4陰性細胞に囲まOCT4（緑）陽性細胞で見られる進行。ヘキストと核染色も（青）描かれている。培養表面から剥離後に卵胞のような構造のc）の白色光画像。d）は diffの中erentiation大OCT4プラス（緑）卵母細胞様細胞のいずれか文化の中の細胞または単独で囲まれ見ることができます。スケールバー=20μmと、B = 100μmの、C = 40ミクロン、D =10μmである。
図2。一般的な卵母細胞マーカーの卵母細胞に比べOLCsにおける転写レベル、。OLCsに共通卵母細胞マーカーの転写レベルを示す代表リアルタイムPCR結果。この比較は10新生児マウス卵母細胞と比較さ10卵母細胞様細胞に起因している。
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Discussion
官能OLCsを最新の状態にすると、in vitroアッセイを使用して完全に開発されていない。最近、林らによる研究は、in vitroで形成されており、さらなる開発14 インビボで導入細胞PGC-等から子孫を産生することができた。それらはインビボで移植後に回収し、細胞のようPGCを形成することができたES細胞または人工多能性細胞で始まるが、成熟受精、および子孫14を生成するために使用することができた。これは、様々なソースからの幹細胞は、卵母細胞の機能を形成する可能性を、適切な条件下で、持っていることを示している。
培養システムの特定の側面は、それが機能するために重要である。幹細胞を単離するために利用されたマウスの歪みが非常に重要である。このプロトコルは、ジャクソンラボ（在庫＃008214）からB6マウスと開発され、使用されました。これらのマウスは、VIは許可のOct4-EGFP遺伝子を運ぶEGFPタンパク質を介してのOct4を発現する細胞のualization。プロトコルはCD1マウスから幹細胞を使用して実行しようとしたときの効率は非常に低く、OLC形成が少なく信頼性があった。現在OLC形成の効率がB6マウスを用いた場合でも、低いままである。後で通路細胞を用いたときに生殖細胞形成の効率がかなり低いとして利用する幹細胞は、従来開始生殖細胞分化への通路2-4であるべきである。種々の試薬の供給源も重要であることが判明した。
OLCsの様々なmRNA転写物の分析は、培養システムを最適化するのに有用であろう。半定量PCRを使用してOLCs及び卵母細胞（ 図2）との間のいくつかのマーカーの発現レベルの比較を可能にする。結果はOLCsは壊れ自然とOLCsの薄い透明帯膜を説明するかもしれない卵母細胞、未満ZPC表現することを示している。減数分裂マーカーの発現
ここで説明するプロトコルは、生殖細胞の形成および分化を研究するためのインビトロで制御方法を提供する。現在生成PGC様細胞は、in vitroで維持する際の機能OLCsを形成することができません。新生児卵巣体細胞で集計し、 インビボで PGC様細胞を移植したときに早期二次包を形成することができる。しかしOLCsが回復されたとき、彼らはまだ確実に成熟し、12を受精することができません。このアッセイでは、ユーティリティ体性幹細胞に由来するプレ減数分裂生殖細胞を研究に由来する。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Acknowledgments
PWDは、ウエスタン大学のジェラルドM.キダーにヘルスリサーチフェローシップ（CIHR）とCIHR助成のカナダの協会によってサポートされています。著者はまた、ここで提示されたプロトコルの開発を支援するためのゲルフ大学でJulang李を承認したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
- van den Hurk, R., Zhao, J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).
- Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration. Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).
- Lawson, K. A., Hage, W. J. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).
- Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation. Development. 110, 521-528 (1990).
- Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science. 300, 1251-1256 (2003).
- Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).
- Wang, L., Cao, J., et al. Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells. Cell Biosci. 2, 27 (2012).
- Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin. Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).
- Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line. Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).
- Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells. DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).
- Song, S. H., Kumar, B. M., et al. Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells. Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).
- Dyce, P. W., Liu, J., et al. In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin. PLoS One. 6, e20339 (2011).
- Linher, K., Dyce, P., Li, J. Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells. PLoS One. 4, e8263 (2009).
- Hayashi, K., Ogushi, S., et al. Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice. Science. , (2012).
