Summary
In de afgelopen jaren de vorming van kiemcellen middels in vitro kweekmethoden is aangetoond met behulp van verschillende soorten van somatische stamcellen. Dit artikel zal visueel presenteren de differentiatie van pasgeboren muizen afgeleide stamcellen om vroeg eicel-achtige cellen.
Abstract
Studeren kiemcellen vorming en differentiatie is van oudsher zeer moeilijk geweest vanwege de lage cel aantallen en hun locatie diep in de ontwikkeling van embryo's. De beschikbaarheid van een "gesloten" in vitro systeem zou van onschatbare waarde voor ons begrip van gametogenese. De vorming van de eicel-achtige cellen (OLC) van somatische stamcellen, geïsoleerd uit pasgeboren muizen huid, is aangetoond en kunnen worden gevisualiseerd in deze video protocol zijn. De resulterende OLC uiten verschillende markeringen in overeenstemming met eicellen, zoals Oct4, Vasa, Bmp15 en Scp3. Maar ze blijven niet in staat om de rijping of bevruchting te wijten aan een gebrek aan meiose voltooien ondergaan. Dit protocol zal een systeem dat bruikbaar is voor het bestuderen van de vroege fase vorming en differentiatie van kiemcellen in meer volwassen gameten. Tijdens de vroege differentiatie het aantal cellen die Oct4 (potentiële ziektekiemen achtige cellen) bereikt ~ 5% echter nog de formatie van OLC blijft relatief inefficiënt. Het protocol is relatief ongecompliceerd al speciale zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen de start celpopulatie is gezond en in een vroeg passage.
Introduction
Tijdens de vroege embryogenese, gametogenese gebeurt door een reeks stappen, waaronder primordiale kiemcellen (PGC) vorming, migratie, en tenslotte kolonisatie van de gonadale richels. Gedurende deze tijd PGC ondergaan proliferatie en differentiatie in steeds meer volwassen gameten 1. Dat PGC migreren vanaf de basis van de allantois in de embryo hindgut en tenslotte langs de dorsale wand uiteindelijk kolonisatie van de gonadale richels maakt ze zeer moeilijk te bestuderen 2. Ondanks de vooruitgang in het veld, hebben studies probeert PGC vorming en differentiatie begrijpen werden belemmerd door hun beperkte aantal, de locatie en migrerende natuur 3,4.
De laatste jaren embryonale stamcellen is aangetoond dat het potentieel kiemcellen vorming in vitro 5,6 hebben. Zo hebben verschillende somatische stamcellen ook aangetoond dat het potentieel voor het vormen kiemcellen hebben evgevolg in vitro kweken 7-11. Onlangs stamcellen geïsoleerd uit pasgeboren muizen huid werden gedifferentieerd in vitro in kiem-achtige cellen en vroegtijdig oöcyten 12. Tijdens de differentiatie deelverzameling van de stamcellen tot expressie Oct4 toegenomen en structuren lijken cumulus-eicel complexen werden gevormd. De eicel-achtige cellen (OLC) kan worden opgehaald van de culturen en in vergelijking met natuurlijke eicellen. Met behulp van deze kweekmethode OLC meten van 40-45 micrometer worden verkregen die uitdrukken soortgelijke markers om eicellen zoals Gdf9b, VASA, en DAZL. Tot op heden is de resulterende OLC er nog steeds niet te rijpen of worden bevrucht 12.
Hoewel de OLC nog niet functioneert het protocol gebruikt om deze OLC vormen nog steeds bruikbaar zijn als een test om de vorming en ontwikkeling van eerder kiemcellen bestuderen in een gesloten systeem in vitro. De oorspronkelijke publicatie bespreken van de vorming van OLC van zomatic stamcellen gebruikt foetale varkens huid als een stamcel bron 8. Uitbreiden op dat onderzoek de PGC-achtige cellen vroeg tijdens geïnduceerde differentiatie gevormd werden getoond aan de voorlopers aan de OLC en uitdrukkelijke zoals PGC markers zoals OCT4, VASA, STELLA, C-KIT, en DAZL 13. Deze gegevens ondersteunt het potentieel van het gebruik van dit systeem om de kiemcellen vorming en differentiatie in vitro te bestuderen. Het protocol gebruikt om OLC van pasgeboren muizen huid te vormen zal worden gedemonstreerd in deze video artikel. Het protocol biedt een in vitro model voor kiemcelontwikkeling die een middel om belangrijke factoren toelichten voor hun proliferatie en differentiatie kunnen voorzien bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mediavoorbereiding
- Bereid media 2-3 uur van tevoren van het gebruik en de plaats met een los kapje in de celkweek incubator waar het experiment zullen plaatsvinden. Media gebruikt in het huidige protocol:
- Bereid stam celmedium bestaande uit DMEM/F12 aangevuld met 1 x B27, 40 ng / ml bFGF en 20 ng / ml EGF.
- Bereid kiemcellen differentiatiemedium bestaande uit m199 gesupplementeerd met 0,05 IU FSH, LH 0,03 IU, 3 mg / ml BSA, 5 ui / ml ITS, 0,23 mM natrium pyruvaat, 1 mg / ml fetuïne en 1 ng / ml EGF. Een basismedium namelijk alle additieven maar zonder FSH, LH en EGF kan worden bereid en bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal een week.
2. Stem Cell Culture Voorbereiding
- Isoleren stamcellen uit pasgeboren muizen pups zoals eerder beschreven 12. Maken gebruik van stamcellen bij passage 2-4 voor in vitro kiem celdifferentiatie. De efficiëntie vanOLC vorming is direct gerelateerd aan de kwaliteit van het uitgangsmateriaal stamcellen. Het beste is om de differentiatie starten zodra de bevolking wordt schone en gezonde die in het algemeen rond passage 2. Verder kweken van de stamcellen laatste passage 2 nadelige invloed op de vorming OLC efficiency (ongepubliceerde resultaten).
- 48 uur voorafgaand aan de start differentiatie sub-cultuur van de stamcellen. Verwijder al het geschorste bolvormige cel aggregaten en bracht media uit de cultuur schotel, met behulp van een serologische pipet, en plaats in een 15 ml buis. Het is belangrijk om alleen de zwevende bolvormige aggregaten van cellen en niet de cellen aan de bodem van de schaal die spontaan differentiëren verzamelen.
- Pellet de cellen bij 500 g gedurende 5 minuten., Verwijder het supernatant en resuspendeer in 500 ul vers medium stamcel verwarmd tot 37 ° C. Voorzichtig pipet de aggregaten naar de cellen gedeeltelijk distantiëren. Niet agressief de cel pipets omdat dit cellevensvatbaarheid verminderen. Was de gedeeltelijk gedissocieerde cellen in 9,5 ml vers voorverwarmde stamcel medium op een lage bevestiging 10 cm celkweekschaal.
- De cellen terug naar een 37 ° C, 5% CO 2 celkweek incubator gedurende 48 uur voorafgaand aan de differentiatie.
3. OLC Differentiatie
- Met behulp van een serologische pipet verwijder de stamcellen van de cultuur schotel en plaats in een 15 ml buis, achter elke aangehechte cellen. Pellet de cellen bij 500 xg en resuspendeer in 500 pi steriel PBS. Krachtige pipet de cellen met behulp van een breed boring 1000 ul tip in groepjes niet groter dan 10-20 cellen. Periodiek verwijderen van een kleine hoeveelheid cellen, tijdens dissociatie, en kijk onder een wit licht microscoop te bevestigen geaggregeerde cellen zijn in groepjes van 10-20 individuele cellen. Over dissociatie leidt tot verminderde cellevensvatbaarheid.
- Voeg 9,5 ml PBS aan de gedissocieerde cellen en voeg 15 pi van deze celsuspensie een hemocytometer voor celtelling. Pellet de cellen bij 500 g gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de cellen bij een concentratie van 1.32X10 6 cellen / ml in differentiatiemedium.
- Het bord van de cellen door het toevoegen van 500 ul per putje in een vlakke bodem 24 goed schorsing gerecht.
- Plaats de 24 putjes in een cel incubator bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 48 uur. Verwijder 250 ul medium uit elk putje en doe dit in een overeenkomstig gelabeld 1,5 ml buis. Voeg 250 ul vers differentiatiemedium aan elk putje. Centrifugeer het verbruikte medium bij 500 xg gedurende 5 minuten. en gooi het supernatant. Resuspendeer elke pellet cellen in 50 ul vers differentiatiemedium en terug in het overeenkomstige cultuur goed op de differentiatie plaat.
- Elke 48 uur verandert de helft van de middelgrote tot dag 12 van differentiatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aanvankelijk was de cellen hechten aan de cultuur schotel bodem en verspreid. Op 42-72 uur in differentiatie vormen kleine zwevende OCT4 positieve cellen en zich vermenigvuldigen (Figuur 1A). Kort na de visualisatie van deze cellen de meerderheid zal verdwijnen en de aangehechte cellen ontstaat een dichte kolonie aggregaten te vormen over de cultuur bodem. Na een paar dagen deze aggregaten losmaken van het kweekoppervlak. In sommige van deze aggregaten een grote cel worden waargenomen (figuur 1b en 1c). Bij de eerste visualisatie de cellen worden ~ 35 pm in diameter. Bij voortzetting van de cultuur van de OLC zal groeien tot ~ 45 micrometer te bereiken in diameter. Dit zijn de OLC en kunnen worden verzameld met steuncellen of getrypsineerd om OLC verkrijgen zonder andere cellen bevestigd (figuur 1d).
Om te bevestigen dat de OLC uiten vergelijkbare transcripten als natuurlijke oöcyten de OLC kan worden ingezameld en getest met deexpressie van dergelijke markers zoals ZPC, Scp3, Cmos, Oct4, Bmp15 en Vasa. Terwijl Oct4 en Vasa worden uitgedrukt in de ongedifferentieerde stamcellen verschillende merkers zoals Bmp15 en ZPC zijn eicel specifiek. BMP15 is een lid van de TGF-β familie en is betrokken bij eicel en follikelontwikkeling. De eicel specifieke zonapellucida membraan structuur is opgebouwd uit verschillende eiwitten waaronder ZP3. De expressie van deze oöcyt merkers kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid van OLC in de differentiaties bevestigen. Bovendien kan de expressie van meiotische specifieke merkers zoals Scp3 en CMOS identificeren potentieel meiotische cellen in het kweeksysteem. In het gegeven voorbeeld 10 OLC en 10 oöcyten werden verzameld en directe cDNA-synthese uitgevoerd (Figuur 2). De verkregen monsters werden vervolgens getest met semi-kwantitatieve PCR. Vergelijking van de expressie van deze markers om natuurlijke muis oöcyten weverschillen in de niveaus van transcripten (figuur 2). Veel markers door eicellen uitgedrukt wordt door OLC worden uitgedrukt als de differentiatie succesvol was.
Figuur 1. Gemeenschappelijke morfologie tijdens geïnduceerde differentiatie van huid afgeleide stamcellen. a) Tijdens de vroege fase differentiatie cellen positief voor OCT4 (groene) kan worden gedetecteerd in de kweek. Kernen zijn teller gekleurd met Hoechst (blauw). B) Als differentiatie vordert sommige mobiele aggregaten zal worden gezien met OCT4 (groene) positieve cellen omringd door OCT4 negatieve cellen. Nucleaire kleuring met Hoechst wordt ook afgeschilderd (blauw). C) Een wit licht beeld van een follikel-achtige structuur na onthechting van de cultuur oppervlak. D) Tijdens het differentiation grote OCT4 positief (groen) eicel-achtige cellen kunnen worden gezien ofwel omringd door cellen of alleen binnen de cultuur. Schaalbalken: a = 20 urn, b = 100 um, c = 40 urn, d = 10 urn.
Figuur 2. Transcript niveau in OLC, vergeleken met eicellen, van gemeenschappelijke eicel markers. Vertegenwoordiger real time PCR resultaten tonen het transcript niveau van gemeenschappelijke eicel markers in OLC. Deze vergelijking resulteert bij 10 oöcyt-achtige cellen wordt vergeleken met 10 pasgeboren muizen oöcyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tot op heden functionele OLC niet zijn ontwikkeld met behulp van een volledig in vitro assay. Onlangs is een studie door Hayashi et al.. Kon nageslacht van PGC-achtige cellen gevormd in vitro en in vivo overgebracht voor verdere ontwikkeling 14. Beginnend met ES-cellen of geïnduceerde pluripotente cellen konden ze PGC vormen als cellen die, wanneer hersteld na in vivo transplantatie konden worden gerijpt, bevrucht, en gebruikt voor het nageslacht 14 genereren. Dit toont aan dat stamcellen uit diverse bronnen hebben het vermogen om onder de juiste omstandigheden om functionele eicellen vormen.
Bepaalde aspecten van de kweek systeem cruciaal voor het functioneren. De stam van muizen gebruikt om de stamcellen te isoleren is zeer belangrijk. Dit protocol is ontwikkeld en gebruikt met B6 muizen uit de Jackson Lab (Stock # 008214). Deze muizen dragen een Oct4-EGFP transgen waardoor visualization cellen dat Oct4 via de EGFP eiwit. Toen het protocol werd geprobeerd met behulp van stamcellen van CD1 muizen het rendement was veel lager en de OLC formatie was minder betrouwbaar. Momenteel is de efficiëntie van de OLC formatie blijft laag, zelfs bij gebruik van B6 muizen. De stamcellen ingezet moet worden op voorafgaand aan de start kiemcel differentiatie passage 2-4 als de efficiëntie van de kiemcel formatie is veel lager bij gebruik van latere passage cellen. De bron van verschillende reagentia is ook belangrijk gebleken.
De analyse van verschillende mRNA transcripten in de OLC bruikbaar zijn bij het optimaliseren van het kweeksysteem bewijzen. Middels semi-kwantitatieve PCR maakt de vergelijking van verschillende merkers expressieniveaus tussen OLC en eicellen (figuur 2). De resultaten tonen dat de expressie OLC minder dan ZPC eicellen die de broosheid en dunner zona pellucida membraan OLC kunnen verklaren. De expressie van de meiose marker
De hier beschreven protocol voorziet in een gecontroleerde in-vitro methode om kiemcellen vorming en differentiatie te bestuderen. Momenteel de PGC-achtige cellen gegenereerd zijn niet functioneel OLC vormen wanneer gehandhaafd in vitro. Wanneer geaggregeerd met pasgeboren ovariële somatische cellen en getransplanteerd in vivo de PGC-achtige cellen zijn in staat om vroeg stadium secundaire follikels te vormen. Echter wanneer de OLC worden teruggewonnen zijn ze nog steeds niet in staat om op betrouwbare wijze worden gerijpt en bevrucht 12. De bruikbaarheid van deze assay komt bestuderen pre-meiotische kiemcellen afgeleid van somatische stamcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
PWD wordt ondersteund door een Canadese Institutes of Health Research fellowship (CIHR) en een CIHR subsidie aan Gerald M. Kidder bij Western University. De auteur wil ook Julang Li erkennen aan de Universiteit van Guelph voor hulp bij de ontwikkeling van het protocol hier gepresenteerd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
- van den Hurk, R., Zhao, J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).
- Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration. Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).
- Lawson, K. A., Hage, W. J. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).
- Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation. Development. 110, 521-528 (1990).
- Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science. 300, 1251-1256 (2003).
- Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).
- Wang, L., Cao, J., et al. Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells. Cell Biosci. 2, 27 (2012).
- Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin. Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).
- Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line. Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).
- Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells. DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).
- Song, S. H., Kumar, B. M., et al. Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells. Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).
- Dyce, P. W., Liu, J., et al. In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin. PLoS One. 6, e20339 (2011).
- Linher, K., Dyce, P., Li, J. Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells. PLoS One. 4, e8263 (2009).
- Hayashi, K., Ogushi, S., et al. Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice. Science. , (2012).
