Summary
최근 몇 년 동안 체외 배양 방법에서 사용하는 생식 세포의 형성은 체세포 줄기 세포의 여러 가지 유형을 사용하여 증명되었습니다. 이 문서에서는 시각적으로 초기 난 모세포 - 유사 세포로 신생아 마우스 유래 줄기 세포의 분화를 발표 할 예정이다.
Abstract
생식 세포의 형성과 분화를 연구하는 것은 전통적으로 낮은 세포 수 및 개발 배아에서 깊은 자신의 위치로 인해 매우 어려운 일이다. 체외 기반 시스템에서 "폐쇄"의 여부는 배우자 형성에 대한 우리의 이해를 위해 매우 유용 할 수 있습니다. 신생아 마우스 피부에서 고립 된 체세포 줄기 세포에서 난자 세포와 같은 (OLCs)의 형성이 입증되었으며,이 비디오 프로토콜 시각화 할 수 있습니다. 결과 OLCs는 OCT4, 바사, Bmp15 및 Scp3으로 난자와 일치 다양한 마커를 표현한다. 그러나, 그들은 성숙 또는 감수 분열을 완료하는 데 오류로 인해 수정을받을 수없는 남아 있습니다. 이 프로토콜은 더 성숙한 배우자로 생식 세포의 초기 형성과 분화를 연구하는 데 유용 시스템을 제공합니다. 초기 분화 OCT4을 표현하는 세포의 수 (잠재적 인 생식 세포와 같은)하지만 현재 F를 ~ 5 %에 도달OLCs의 ormation은 상대적으로 비효율적 남아있다. 특별한주의가 시작 세포 인구가 건강하고 초기 통로이다 않도록주의해야하지만 프로토콜은 비교적 똑바로 앞으로이다.
Introduction
초기 배아 발생 동안, 배우자 형성은 원시 생식 세포 (PGC) 형성, 마이그레이션 및 생식 능선의 마지막으로 식민지 등 일련의 단계를 통해 발생합니다. 이 시간 동안 PGCs는 점점 더 성숙 배우자 1에 증식과 분화를 겪는다. PGCs는 배아 hindgut에 allantois의 기지에서 마침내 결국 생식 능선을 식민지화 등의 벽을 따라 마이그레이션하는 것이 사실은 2 공부하기가 대단히 어렵다. 분야의 발전에도 불구하고, PGC 형성과 분화를 이해하려는 연구들은 제한된 수의 위치 및 철새 성격 3,4에 의해 방해되었다.
최근 배아 줄기 세포는 체외 5,6에서 생식 세포를 형성 할 수있는 잠재력을 가지고 보여왔다. 마찬가지로, 여러 체세포 줄기 세포는 배아 세포가 FOLL 형성 할 수있는 잠재력을 가지고 표시되었습니다체외 배양 7-11 때문에. 최근 신생아 쥐의 피부에서 분리 된 줄기 세포 배아 같은 세포와 초기 단계의 난자를 12으로 체외에서 분화되었다. 분화 OCT4을 표현하는 줄기 세포의 집합이 증가하고 구조를 닮은 적운-난자 복합체가 형성되었다. 난 모세포와 같은 세포 (OLCs) 문화에서 고른 자연 난자에 비교할 수 있습니다. 40-45 μm의 측정이 문화 방법 OLCs를 사용하면 얻을 수있다 그러한 Gdf9b, VASA 및 DAZL으로 난자에 명시 유사한 표식입니다. 최신 결과 OLCs 12 성숙하거나 기름지게 할 수없는 남아 있습니다.
OLCs이 OLCs을 형성하는 데 사용되는 프로토콜은 여전히 내 초기 단계의 생식 세포의 형성과 발전을 연구하는 분석으로 유틸리티가 작동하지 않을 수없는 남아 있지만, 체외 시스템에 마감했다. 그래서에서 OLCs의 형성을 논의 출판물매틱 줄기 세포는 줄기 세포 소스 8로 태아의 돼지 피부를 활용. 유도 분화 초기에 형성된 PGC와 같은 세포, OCT4로 OLCs을 표현 같은 PGC 마커에 VASA, STELLA, C-KIT, 그리고 DAZL 13 전구체로 표시되었던 연구를 확대. 이 데이터는 체외에서 생식 세포의 형성과 분화를 연구하기 위해이 시스템을 활용하는 가능성을 지원합니다. 신생아 쥐의 피부에서 OLCs를 형성하기 위해 이용되는 프로토콜이 비디오 문서에서 설명 될 것입니다. 이 프로토콜은 자신의 증식과 분화 요인이 중요한 명료하게하는 수단을 제공 할 수 생식 세포 발달을 연구하는 체외 모델을 제공합니다.
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Protocol
1. 미디어 준비
- 실험이 진행되는 세포 배양 인큐베이터에서 느슨해 캡 사용 및 장소를 사전에 용지 2 ~ 3 시간을 준비합니다. 본 프로토콜에서 사용 미디어 :
- 1 개 B27, 40 NG / ML bFGF를, 20 NG / ML EGF와 보충 DMEM/F12로 구성된 세포 매체를 줄기 준비한다.
- 0.05 IU의 FSH, 0.03 IU LH, 3 MG / ML BSA, 5 μL / ㎖ ITS, 0.23 mM의 나트륨 피루 베이트, 1 MG / ML Fetuin, 1 NG / ML EGF와 보충 M199로 구성된 생식 세포 분화 매체를 준비합니다. 모든 첨가제로 구성하지만, FSH를 생략 기본 매체는, LH 및 EGF는 ° C까지 1 주일을 준비하고 4시에 저장할 수 있습니다.
2. 세포 배양 준비 줄기
- 이전 12 설명 된대로 신생아 쥐 새끼에서 줄기 세포를 분리. 체외 배아 세포 분화에 대한 구절 2-4에서 줄기 세포를 사용합니다. 의 효율성OLC 형성은 바로 시작 줄기 세포의 품질에 관련되어 있습니다. 그것은 곧 인구가 통과 약 2에서 일반적으로하는 깨끗하고 건강한 나타나는 분화를 시작하는 것이 좋습니다. 또한 배양 줄기 세포 과거 통로 2 부정적인 OLC 형성 효율 (미발표 결과)에 영향을 미칩니다.
- 이전의 하위 문화 줄기 세포 분화를 시작하기 48 시간. 일시 중지 된 모든 구형 세포 집계 및 지출 미디어 배양 접시에서, 혈청 피펫을 사용하고 15 ML 튜브에 장소를 제거합니다. 만 중단 된 구형 세포의 집합체가 아니라 자발적으로 차별화 된 접시의 바닥에 부착 된 세포를 수집하는 것이 중요합니다.
- 5 분 500 XG에서 펠렛은 세포., 상층 액을 버리고, 신선한 줄기 세포 미디어 500 μL에 resuspend을 37 ° C로 예열 부드럽게 부분적으로 세포를 해리하는 집계를 피펫. 적극적으로 세포를 피펫하지 마십시오이 같은의 세포 생존을 줄일 수 있습니다. 낮은 첨부 10cm 세포 배양 접시에 신선한 사전 예열 줄기 세포 매체의 9.5 ML에 부분적으로 해리 세포를 씻으십시오.
- 분화의 시작하기 전에 48 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2 세포 배양 배양기에 세포를 반환합니다.
3. OLC 차별화
- 혈청 피펫을 사용하여 15 ML 튜브에서 배양 접시와 장소에서 줄기 세포를 분리, 장착 된 세포를 뒤에 남겨두고. 500 ㎕의 멸균 PBS 500 XG와를 Resuspend에서 펠렛 세포. 활발한 피펫 전체를 사용하여 세포를 20 세포보다 크지 덩어리에 1,000 μL 팁을 낳았다. 주기적으로 분리하는 동안, 세포의 작은 금액을 제거하고, 집계 된 세포가 20 개인 세포의 대단히 짧은 시간에 확인하는 하얀 빛을 현미경으로 확인합니다. 해리 이상 감소 세포 생존에 발생합니다.
- 해리 세포에 9.5 ML PBS를 추가하고 추가 1세포 계수에 대한 혈구이 세포 현탁액의 5 μL. 5 분 500 XG에서 펠렛은 세포.
- 1.32X10 6 세포 / 분화 배지에서 ML의 농도에서 세포를 다시 일시 중지합니다.
- 평평한 바닥에 잘 당 24 잘 서스펜션 요리를 500 μl를 추가하여 플레이트 세포.
- 48 시간 동안 5 % CO 2 37 세포 배양 인큐베이터에 24 잘 접시 ° C를 놓습니다. 대응 표시 1.5 ML 튜브에 각 우물과 장소에서 250 μL 매체를 제거합니다. 각 well에 250 ㎕의 신선한 차별화 매체를 추가합니다. 5 분 500 XG에서 보낸 매체를 원심 분리기. 그리고 상층 액을 버린다. 50 μL 신선한 차별화 매체의 모든 펠렛 세포를 resuspend을하고 차별화 접시에 잘 대응하는 문화로 돌아갑니다.
- 매일 48 시간은 차별화의 날 12 반 매체를 변경합니다.
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Representative Results
처음에는 세포가 배양 접시 바닥에 부착 확산. 차별화에 42-72 시간에 작은 정지 OCT4 양성 세포가 형성하고 (그림 1A) 확산. 곧 이러한 세포의 시각화 후 대부분 사라지고 첨부 된 세포 배양 하단에 밀도 식민지 집계를 형성합니다. 몇 일 다음이 집계 문화 표면에서 분리합니다. 이러한 골재의 일부 대형 세포 (그림 1B 및 1C) 관찰 할 수있다. 초기 구상에 따라 세포는 직경 ~ 35 μm의 수 있습니다. 지속적인 문화 OLCs 직경 ~ 45 μm의에 도달하기 위해 성장할 것이다. 이들은 OLCs하고 지원 세포 수집하거나 (그림 1D) 부착 다른 세포없이 OLCs을 얻기 위해 트립신 할 수 있습니다.
OLCs 자연 난자와 유사한 성적을 표현할 수 있는지 확인하기 위해 OLCs를 수집하고 테스트 할 수 있습니다ZPC, Scp3, CMOS OCT4, Bmp15 및 바사와 같은 마커의 식입니다. OCT4 및 바사가 미분화 된 줄기 세포에서 발현하는 동안 같은 Bmp15와 ZPC 같은 여러 마커 난자 다릅니다. BMP15는 TGF-β 가족의 일원이며, 난자와 난포 개발에 참여하고있다. 난자 특정 투명대 막 구조는 ZP3 등 여러 가지 단백질로 구성되어 있습니다. 이러한 난자 특정 마커의 발현은 분화에 OLCs의 존재를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 같은 Scp3 및 비교기 등의 감수 특정 마커의 발현은 배양 시스템에서 잠재적 감수 세포를 식별 할 수 있습니다. 이 예에서는 10 OLCs을 제공하고 10 난 모세포 (그림 2) 수집 및 직접 cDNA를 합성 하였다. 결과 샘플은 다음 반 정량적 PCR를 사용하여 테스트 하였다. 우리가 보는 자연 마우스 난자에이 마커의 발현을 비교성적의 수준의 차이 (그림 2). 차별화에 성공하면 난자로 표현 여러 마커는 OLCs에 의해 표현됩니다.
그림 1. 피부 유래 줄기 세포의 유도 분화 일반적인 형태학. OCT4 (녹색)에 대한 긍정적 인 초기 분화 세포 중)이 문화에서 발견 할 수 있습니다. Nucleuses은 카운터 훽스트 (파란색)으로 염색된다. 차별화가 진행 b)는 일부 세포 집합체가 OCT4 (녹색) OCT4 부정적인 세포에 의해 둘러싸여 양성 세포를 볼 수 있습니다. 훽스트와 핵 염색도 (파란색). C) 문화면. D에서 분리 후 여포와 같은 구조의 백색광 이미지) 비교하는 동안 그려져 있습니다erentiation 큰 OCT4 양 (녹색) 난 모세포 - 유사 세포는 하나의 문화 내의 세포 또는 단독으로 둘러싸인 볼 수 있습니다. 스케일 바 : = 20 μm의, B = 100 μm의, C = 40 μm의, D = 10 μm의.
그림 2. 일반적으로 난자 마커의 난자에 비해 OLCs의 성적 수준. OLCs에서 일반적으로 난자 마커의 성적 수준을 보여주는 대표적인 실시간 PCR 결과. 이 비교는 10 모세포 - 유사 세포가 10 신생아 마우스 난자에 비해되는 결과입니다.
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Discussion
기능 OLCs 날짜를하려면 생체 분석에 완벽을 사용하여 개발되지 않았습니다. 최근 하야시 외 의해 연구. 체외에서 형성되고 발전 14 생체 내에서 전송되는 세포 PGC 같은에서 자손을 생산할 수 있었다. 그들은 생체 이식 후 회복, 세포처럼 PGC를 형성 할 수 있었다 ES 세포 나 유도 만능 세포로 시작은 성숙 시비, 자손 14를 생성하는 데 사용 될 수 있었다. 이 다양한 소스로부터의 줄기 세포가 기능 난자를 형성하기 위해, 올바른 조건 하에서 잠재력을 가지고 보여줍니다.
문화 시스템의 특정 측면은 기능에 중요하다. 줄기 세포를 분리하기 위하여 이용 생쥐의 변형은 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 잭슨 연구소 (주식 # 008214)에서 B6 생쥐로 개발하여 사용 하였다. 이 마우스는 허용 OCT4-EGFP 유전자를 가지고 힘을EGFP 단백질을 통해 OCT4을 표현하는 세포의 ualization. 프로토콜 CD1 생쥐에서 줄기 세포를 사용하여 시도했을 때 효율이 매우 낮았다 및 OLC 형성이 덜 안정적이었다. 현재 OLC 형성의 효율성 B6 마우스를 사용하는 경우에도 낮은 상태로 유지됩니다. 나중에 통로 세포를 사용하는 경우 생식 세포 형성의 효율이 훨씬 낮은으로 활용 줄기 세포는 이전에 시작 생식 세포 분화에 통과 2-4에 있어야합니다. 각종 시약의 소스는 중요한 것으로 입증되었습니다.
OLCs의 다양한 mRNA의 성적의 분석은 배양 시스템을 최적화 유용 할 수 있습니다. 반 정량 PCR을 사용하면 OLCs와 난자 (그림 2) 사이에 여러 마커의 발현을 비교 할 수 있습니다. 결과는 OLCs는 깨지기 쉬운 자연과 OLCs의 얇은 투명대 막 설명 할 수 난자,보다 ZPC 표현하는 것을 보여줍니다. 감수 분열 마커의 발현
여기에 설명 된 프로토콜은 생식 세포의 형성과 분화를 연구하는 체외에서 제어 방법을 제공합니다. 현재 생성 된 PGC 같은 세포는 체외에서 유지 될 때 기능 OLCs를 형성 할 수 없습니다. 신생아 난소 체세포로 집계 생체에 이식하면 PGC 같은 세포는 초기 차 난포를 형성 할 수 있습니다. 그러나 OLCs이 복구 될 때 그들은 여전히 안정적으로 성숙 12 기름지게 할 수 없습니다. 이 분석의 유틸리티는 체세포 줄기 세포에서 파생 된 사전 감수 배아 세포 연구에서 비롯됩니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
PWD 웨스턴 대학의 제럴드 M. 키더에 건강 연구 교제 (CIHR)와 CIHR 부여의 캐나다 연구소에 의해 지원됩니다. 저자는 여기에 제시 프로토콜의 개발에 도움을 구 엘프 대학에서 Julang 리를 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
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