Summary
Negli ultimi anni la formazione di cellule germinali utilizzando metodi in coltura in vitro è stata dimostrata utilizzando diversi tipi di cellule staminali somatiche. Questo articolo presenta visivamente la differenziazione delle cellule staminali derivate topo neonato per primi cellule ovocita-like.
Abstract
Studiare la formazione delle cellule germinali e la differenziazione è sempre stato molto difficile a causa di un basso numero di cellule e la loro posizione nel profondo di sviluppo degli embrioni. La disponibilità di un "chiuso" nel sistema basato vitro potrebbe rivelarsi prezioso per la nostra comprensione della gametogenesi. La formazione di ovociti-come le cellule (oLc) da cellule staminali somatiche, isolate dalla pelle neonato topo, è stata dimostrata e può essere visualizzato in questo protocollo video. Le oLc risultanti esprimono vari marker coerenti con gli ovociti come Oct4, Vasa, BMP15 e SCP3. Tuttavia, rimangono in grado di sottoporsi a maturazione o la fecondazione a causa di un mancato completamento della meiosi. Questo protocollo fornirà un sistema che è utile per studiare la formazione fase iniziale e la differenziazione delle cellule germinali in gameti più mature. Durante precoce differenziazione del numero di cellule che esprimono Oct4 (potenziali cellule germinali-simili) raggiunge ~ 5%, tuttavia attualmente il formazione delle oLc rimane relativamente inefficiente. Il protocollo è relativamente semplice ma particolare cura deve essere presa per assicurare la popolazione di cellule di partenza è sano e ad un passaggio precoce.
Introduction
Durante l'embriogenesi precoce, gametogenesi avviene attraverso una serie di tappe tra cui cellule germinali primordiali (PGC) formazione, migrazione, e, infine, la colonizzazione delle creste delle gonadi. Durante questo periodo PGC subiscono proliferazione e differenziazione in sempre gameti più mature 1. Il fatto che il PGC migrano dalla base del allantoide nella hindgut embrione e infine lungo la parete dorsale finalmente colonizzando le creste delle gonadi li rende estremamente difficile da studiare 2. Nonostante i progressi nel campo, gli studi che tentano di comprendere la formazione PGC e differenziazione sono stati ostacolati dal loro numero limitato, la posizione e la natura migratoria 3,4.
Negli ultimi anni le cellule staminali embrionali hanno dimostrato di avere il potenziale per formare le cellule germinali in vitro 5,6. Analogamente numerosi cellule staminali somatiche hanno anche dimostrato di avere il potenziale di formare cellule germinali Follgrazie in coltura in vitro 7-11. Recentemente staminali cellule isolate dalla cute neonato topo sono state differenziate in vitro in cellule germinali-simili e primi ovociti stage 12. Durante la differenziazione del sottoinsieme delle cellule staminali che esprimono Oct4 aumentata e le strutture che assomigliano complessi cumulo-ovocita si sono formati. L'ovocita-come le cellule (oLc) possono essere ritirati dalle culture e confrontati con ovociti naturali. Utilizzando questo metodo di coltura oLc di misura 40-45 micron si ottengono che esprimono i marcatori simili a ovociti come Gdf9b, VASA, e DAZL. Ad oggi le oLc risultanti rimangono incapaci di maturare o essere fecondati 12.
Sebbene i oLc rimangono incapaci di funzionare il protocollo utilizzato per formare questi oLc può ancora avere utilità come un saggio per studiare la formazione e lo sviluppo delle cellule germinali fase precedente all'interno di un sistema chiuso in vitro. La pubblicazione originale discutere la formazione di oLc da cosìcellule staminali matic utilizzati pelle porcina fetale come fonte di cellule staminali 8. Ampliando tale studio le cellule PGC-come si formano presto durante la differenziazione indotta hanno dimostrato di essere i precursori per la oLc ed esprimere tali marcatori PGC come OCT4, VASA, STELLA, C-KIT, e DAZL 13. Questi dati supportano la possibilità di utilizzare questo sistema per studiare la formazione di cellule germinali e differenziazione in vitro. Il protocollo utilizzato per formare oLc dalla pelle appena nato del mouse sarà dimostrato in questo articolo il video. Questo protocollo offre un modello in vitro per lo studio dello sviluppo delle cellule germinali che possono fornire un mezzo per delucidare i fattori importanti per la loro proliferazione e differenziazione.
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Protocol
1. Media Preparazione
- Preparare i media 2-3 ore in anticipo di utilizzo e luogo con un tappo allentato nella cultura incubatore cella in cui l'esperimento avrà luogo. Supporti utilizzati nel presente protocollo:
- Preparare staminali mezzo cella costituita dal DMEM/F12 addizionato con 1 x B27, 40 ng / ml bFGF, e 20 ng / ml EGF.
- Preparare cellule germinali terreno di differenziamento composto M199 addizionato con 0,05 UI di FSH, LH 0,03 IU, 3 mg / ml BSA, 5 microlitri / ml ITS, 0,23 mM di piruvato di sodio, 1 mg / ml Fetuina, e 1 ng / ml EGF. Un mezzo base costituita da tutti gli additivi ma omettendo FSH, LH e EGF può essere preparata e conservata a 4 ° C per una settimana.
2. Stem Cell Culture Preparazione
- Isolate le cellule staminali da cuccioli appena nati del mouse come descritto in precedenza 12. Utilizzare le cellule staminali al passaggio 2-4 per la differenziazione in vitro delle cellule germinali. L'efficienza diFormazione OLC è direttamente correlata alla qualità delle cellule staminali iniziali. È meglio iniziare la differenziazione non appena la popolazione appare sana e pulita che è generalmente intorno passaggio 2. Ulteriormente coltivando le cellule staminali passato passaggio 2 influisce negativamente sull'efficienza formazione OLC (risultati non pubblicati).
- 48 hr prima di iniziare differenziazione sub-coltura delle cellule staminali. Rimuovere tutti gli aggregati sferici sospesi cellulari e media spesi dal piatto di coltura, utilizzando una pipetta sierologica, e posto in una provetta da 15 ml. È importante raccogliere solo i sospese aggregati sferici di cellule e non le cellule attaccate al fondo del piatto che si differenzia spontaneamente.
- Agglomerare le cellule a 500 xg per 5 min., Scartare il surnatante e risospendere in 500 ml di mezzi di cellule staminali fresche riscaldato a 37 ° C. Pipettare delicatamente gli aggregati di dissociare parzialmente le cellule. Non aggressivo pipettare la cellas per evitare di ridurre la vitalità cellulare. Lavare le cellule parzialmente dissociato in 9,5 ml di fresco pre-riscaldato medio di cellule staminali su un 10 centimetri piatto di coltura cellulare a basso attaccamento.
- Riportare le cellule ad una ° C, 5% CO 2 incubatore di coltura cellulare 37 per 48 ore prima di iniziare differenziazione.
3. Differenziazione OLC
- Usando una pipetta sierologica rimuovere le cellule staminali dal piatto di coltura e posto in una provetta da 15, lasciarsi alle spalle tutte le celle collegate. Agglomerare le cellule a 500 xg e risospendere in 500 microlitri di PBS sterile. Pipetta vigoroso le cellule utilizzando un ampio foro 1000 punta microlitri in ciuffi non più grandi di 10-20 cellule. Periodicamente rimuovere una piccola quantità di cellule, durante la dissociazione, e verificare sotto un microscopio a luce bianca per confermare le cellule sono aggregati in gruppi di 10-20 cellule individuali. Oltre dissociazione provocherà vitalità cellulare ridotta.
- Aggiungere 9,5 ml di PBS per le cellule dissociate e aggiungere 15 microlitri di sospensione cellulare ad un emocitometro per la conta cellulare. Agglomerare le cellule a 500 xg per 5 min.
- Risospendere le cellule ad una concentrazione di 1.32X10 6 cellule / ml in terreno di differenziamento.
- Piastra le cellule con l'aggiunta di 500 microlitri per pozzetto in un fondo piatto 24 piatto sospensione bene.
- Posizionare il piatto ben 24 in una coltura cellulare incubatore a 37 ° C in 5% CO 2 per 48 ore. Togliere 250 medie microlitri di ogni bene e mettere in un marcato corrispondentemente 1.5 tubo ml. Aggiungere 250 microlitri terreno di differenziamento fresco in ciascun pozzetto. Centrifugare il medium speso a 500 xg per 5 min. e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in pellet in 50 microlitri terreno di differenziamento fresco e ritornare alla cultura corrispondente pozzetto della piastra differenziazione.
- Ogni 48 ore cambia la metà del mezzo fino al giorno 12 di differenziazione.
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Representative Results
Inizialmente le cellule attribuiscono alla cultura piatto fondo e sparsi. A 42-72 ore in differenziazione piccoli sospesi OCT4 cellule positive formano e proliferano (Figura 1A). Poco dopo la visualizzazione di queste cellule maggioranza scompare e le cellule attaccate formerà aggregati colonia dense sul fondo cultura. A seguito di un paio di giorni questi aggregati si staccano dalla superficie cultura. In alcuni di questi aggregati può osservare una grande cella (Figura 1b e 1c). Su visualizzazione iniziale le cellule saranno ~ 35 micron di diametro. Con la cultura continua le oLc crescerà per raggiungere ~ 45 micron di diametro. Questi sono i oLc e possono essere raccolti con le cellule di supporto o tripsinizzate ottenere oLc senza altre cellule collegate (Figura 1d).
Al fine di confermare che le oLc esprimono trascrizioni simili come ovociti naturali le oLc possono essere raccolti e testati per laespressione di tali marcatori come CPS, SCP3, CMOS, Oct4, BMP15 e Vasa. Mentre Oct4 e Vasa sono espressi nelle cellule staminali indifferenziate diversi marcatori come BMP15 e CPS sono specifici ovocita. BMP15 è un membro della famiglia TGF-β e si occupa di ovocita e lo sviluppo follicolare. La struttura della membrana dell'oocita specifica zona pellucida è composto di diverse proteine tra cui ZP3. L'espressione di questi marcatori specifici oocita può essere usato per confermare la presenza di oLc nelle differenziazioni. Inoltre, l'espressione di marcatori specifici meiotiche come SCP3 e CMOS in grado di identificare le cellule potenzialmente meiotiche all'interno del sistema cultura. Nell'esempio fornito oLc 10 e 10 oociti sono stati raccolti e sintesi di cDNA diretto eseguite (Figura 2). I campioni risultanti sono stati poi testati mediante PCR semi-quantitativa. Confrontando l'espressione di questi marcatori di ovociti naturali topo che vediamodifferenze nei livelli di trascritti (Figura 2). Molti marcatori espressi da oociti saranno espresse dai oLc se la differenziazione è riuscita.
Figura 1. Morfologie comune durante la differenziazione indotta di pelle cellule staminali derivate. a) Durante la fase iniziale di differenziazione delle cellule positive per OCT4 (verde) può essere rilevato nella cultura. Nuclei sono bancone colorati con Hoechst (blu). B) Poiché la differenziazione progredisce alcuni aggregati di cellule saranno visti con OCT4 (verde), le cellule positive circondate da OCT4 cellule negative. Colorazione nucleare con Hoechst è anche raffigurato (blu). C) Un'immagine luce bianca di una struttura follicolo-come dopo il distacco dalla superficie cultura. D) Durante il differentiation grandi Oct4 positivi (verdi), le cellule degli ovociti-come può essere visto sia circondato da cellule o singolarmente all'interno della cultura. Barre di scala: a = 20 micron, b = 100 micron, c = 40 micron, d = 10 micron.
Figura 2. Livello di trascrizione in oLc, a fronte di ovociti, di marcatori ovocita comuni. Rappresentante in tempo reale i risultati della PCR che mostrano il livello di trascrizione di marcatori ovocita comuni in oLc. Questo confronto è derivato da 10 celle ovocita-come essere confrontati con 10 ovociti appena nati del mouse.
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Discussion
Ad oggi oLc funzionali non sono stati sviluppati utilizzando una completamente in vitro. Recentemente uno studio condotto da Hayashi et al. Era in grado di produrre prole da PGC-come le cellule formati in vitro e trasferimento in vivo per un ulteriore sviluppo 14. Partendo da cellule ES o cellule pluripotenti indotte sono stati in grado di formare PGC come le cellule che, una volta recuperati a seguito di trapianto in vivo sono stati in grado di essere maturato, fecondato, e utilizzato per generare prole 14. Questo dimostra che le cellule staminali da varie fonti hanno il potenziale, in condizioni ottimali, per formare ovociti funzionali.
Alcuni aspetti del sistema di coltura sono critici per esso funzionante. Il ceppo di topi utilizzati per isolare le cellule staminali è molto importante. Questo protocollo è stato sviluppato e utilizzato con B6 topi dalla Jackson Lab (Archivio # 008214). Questi topi portano un transgene Oct4-EGFP permettendo visualization di cellule esprimenti Oct4 tramite la proteina EGFP. Quando il protocollo è stato tentato utilizzando cellule staminali da topi CD1 l'efficienza era molto più basso e la formazione OLC era meno affidabile. Attualmente l'efficienza di formazione OLC rimane bassa anche utilizzando topi B6. Le cellule staminali utilizzate dovrebbero essere al passaggio 2-4 prima di iniziare la differenziazione delle cellule germinali come l'efficienza della formazione delle cellule germinali è molto più bassa quando si usano cellule di passaggio successive. La fonte di vari reagenti ha anche dimostrato di essere importante.
L'analisi dei vari trascritti di mRNA nei oLc potrebbe essere utile per ottimizzare il sistema di coltura. Utilizzando la PCR semi-quantitativa consente il raffronto dei diversi marcatori livelli di espressione tra oLc e ovociti (Figura 2). I risultati mostrano che i oLc esprimono meno CPS di ovociti, che possono spiegare la natura fragile e sottile zona pellucida membrana delle oLc. L'espressione del marcatore meiosi
Il protocollo qui descritto fornisce un metodo controllato in vitro per studiare la formazione delle cellule germinali e differenziazione. Attualmente le celle PGC-simili generati sono incapaci di formare oLc funzionali se mantenuti in vitro. Quando aggregate con le cellule somatiche ovariche appena nati e trapiantato in vivo le cellule PGC-simili sono in grado di formare early stage follicoli secondari. Tuttavia quando i oLc sono recuperati sono ancora in grado di essere affidabile maturato e fecondato 12. L'utilità di questo test viene da studiare le cellule germinali pre-meiotica derivati da cellule staminali somatiche.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
PWD è supportato da una Canadian Institutes of Health Research fellowship (CIHR) e una borsa di CIHR di Gerald M. Kidder alla Western University. L'autore desidera inoltre ringraziare Julang Li presso l'Università di Guelph per un aiuto con lo sviluppo del protocollo presentato qui.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
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