Summary
Son yıllarda, in vitro kültür yöntemler kullanılarak germ hücre oluşumunu somatik kök hücrelerin birkaç farklı türde kullanılarak gösterilmiştir. Bu makale, görsel erken oosit benzeri hücrelere yeni doğan fare edilen kök hücrelerin farklılaşma sunacak.
Abstract
Germ hücre oluşumu ve farklılaşması incelenmesi geleneksel olarak düşük hücre sayıları ve gelişmekte olan embriyoların içinde derin kendi konumu nedeniyle çok zor olmuştur. In vitro tabanlı sistem bir "kapalı" durumu gametogenez anlayışımız için çok değerli olabilecek. Yeni doğan fare deri izole somatik kök hücreler, gelen oosit-benzeri hücreler (OLCS) oluşumu gösterilmiştir ve bu video protokolde görüntülenebilir. Elde edilen OLCS gibi Oct4 Vasa, Bmp15 ve SCP3 gibi oosit ile tutarlı çeşitli işaretleri ifade eder. Ancak, olgunlaşma ya da mayoz tamamlamak için bir hatası nedeniyle gübreleme geçmesi mümkün kalır. Bu protokol daha olgun gamet içine germ hücrelerinin erken oluşumu ve farklılaşma eğitim için yararlı bir sistem sağlayacaktır. Erken farklılaşması sırasında Oct4 eksprese eden hücrelerin sayısına (potansiyel germ hücreleri gibi), ancak şu anda, F ~% 5 ulaşırOLCS bir ormation nispeten verimsiz kalır. Özel bakım başlangıç hücre popülasyonu sağlıklı ve erken bir geçit olduğundan emin olmak için alınması gereken rağmen protokol oldukça yalındır.
Introduction
Erken embriyo sırasında, gametogenez primordial germ hücreli (PGC) oluşumu, göç ve gonadal sırtlar sonunda kolonizasyon dahil olmak üzere aşamalarında bir dizi oluşur. Bu süre zarfında PGCs giderek daha olgun gamet 1 içine çoğalması ve farklılaşması tabi. PGCs embriyo hindgut içine allantoisi en tabanından ve son olarak sonunda gonadal sırtlar kolonize dorsal duvar boyunca göç gerçeğini 2 çalışma onları son derece zor hale getirir. Alanında ilerlemelere rağmen, PGC oluşumu ve farklılaşma anlamaya çalışırken çalışmalar sınırlı sayısı, yeri ve göçmen doğa 3,4 engellemektedir edilmiştir.
Son yıllarda, embriyonik kök hücrelerinin in vitro 5,6 germ hücreleri oluşturmak için potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir. Benzer şekilde, birçok somatik kök hücreleri de germ hücreleri FOLL oluşturmak için potansiyele sahip olduğu gösterilmiştirin vitro kültür 7-11 nedeniyle. Son zamanlarda yeni doğan fare deri izole kök hücre germ-benzeri hücreler ve erken evre oosit 12 in vitro ayırt edildi. Farklılaşma sırasında Oct4 ifade eden kök hücrelerin alt artmış ve yapılar benzeyen kümülüs-oosit kompleksleri oluşturulmuştur. Oosit-benzeri hücreler (OLCS) kültürlerden aldı ve doğal oosit ile karşılaştırılabilir. 40-45 mikron ölçüm Bu kültür yöntemi OLCS kullanılarak elde edilir böyle Gdf9b, VASA ve DAZL olarak oosit için ifade benzer işaretleri. Bugüne kadar ortaya çıkan OLCS 12 olgun veya döllenmiş olması mümkün kalır.
OLCS bu OLCS oluşturmak için kullanılan protokol hala içinde daha erken bir aşamada germ hücrelerinin oluşumu ve gelişimini incelemek için bir test olarak yardımcı olabilir çalışması için mümkün kalmasına rağmen bir in vitro sistemde kapalı. Kadar gelen OLCS oluşumunu tartışırken orijinal yayınmatic kök hücreler bir kök hücre kaynağı 8 olarak fetal domuz deri kullanılmaktadır. Bağlı farklılaşma sırasında erken oluşan İKK-benzeri hücreler, Oct4 olarak OLCS ve ekspres bu İKK işaretleri için VASA, STELLA, C-KIT ve DAZL 13 öncüleri olduğu gösterilmiştir olduğunu çalışmaya genişletilmesi. Bu, in vitro olarak germ hücre oluşumu ve farklılaşma incelemek için bu sistemi kullanan potansiyel destekler. Yeni doğan fare deriden OLCS oluşturmak için kullanılan protokol Bu video makalede gösterilecektir. Bu protokol kendi çoğalması ve farklılaşması için faktörlerin önemli aydınlatmak için bir araç sağlayabilir germ hücre gelişimi incelemek için bir in vitro model sunuyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medya Hazırlık
- Deney yer alacak hücre kültürü inkübatör bir gevşetti kapağı ile kullanım ve yer önceden medya 2-3 saat hazırlayın. Bu protokolde kullanılan Medya:
- 1 x B27, 40 ng / ml bFGF ve 20 ng / ml EGF ile desteklenmiş DMEM/F12 oluşan hücre orta kök hazırlayın.
- 0.05 IU FSH, 0.03 IU LH, 3 mg / ml BSA, 5 ul / mL, 0.23 mM sodyum piruvat, 1 mg / ml fetuin, ve 1 ng / ml EGF ile takviye edilmiş M199 oluşan germ hücre farklılaşması orta hazırlayın. Tüm katkı maddelerinden oluşan ama FSH kullanılmadan bir baz vasatı, LH ve EGF ° C ila bir hafta için hazırlanmış ve 4 'de saklanabilir.
2. Hücre Kültürü Hazırlanması Kök
- Daha önce 12 açıklandığı gibi yeni doğan fare yavrular kök hücre izole edin. In vitro germ hücreli farklılaşmasında için geçiş 2-4 kök hücre yararlanın. VerimiOLC oluşumunu doğrudan ana kök hücrelerinin kalitesi ile ilgilidir. Bu en kısa sürede nüfusun geçit yaklaşık 2 genel olarak olan temiz ve sağlıklı göründüğü gibi farklılaşma başlamak en iyisidir. Ayrıca kültür kök hücreler son geçit 2 olumsuz OLC oluşumu verimliliği (yayınlanmamış) etkiler.
- Önce alt-kültürü kök hücreler farklılaşma başlamadan 48 saat. Tüm askıya küresel hücre agrega ve harcanan medya kültür çanak, bir serolojik pipet kullanarak, ve bir 15 ml tüp içinde yer çıkarın. Sadece askıya küresel hücrelerin agrega değil, kendiliğinden ayırıyoruz çanak alt bağlı hücreleri toplamak için önemlidir.
- 5 dakika boyunca 500 xg'de Pelet hücreleri., Supernatant ve taze kök hücre, 500 ul ortam içinde tekrar süspansiyon 37 ° C ye ısıtıldı Yavaşça kısmen hücreleri ayırmak için agrega pipetle. Agresif hücre PipetiBu kadar s hücre canlılığı azaltacaktır. Düşük bir bağlanma 10 cm hücre kültürü kabı, taze, önceden ısıtılmış kök hücre orta 9.5 mi içine kısmen ayrışmış hücreleri yıkayın.
- Farklılaşmanın başlamasından önce, 48 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör hücre kültürü hücreleri dönün.
3. OLC Farklılaşma
- Serolojik bir pipet kullanarak 15 ml tüp içinde kültür çanak ve yerden kök hücreleri çıkarmak, takılı olan hücreler geride bırakmak. 500 ul steril PBS içinde 500 xg ve tekrar süspansiyon de Pelet hücreleri. Güçlü pipet geniş kullanarak hücrelerin 10-20 hücreleri daha büyük değil kümeleri içine 1.000 ul ucu delik. Periyodik ayrışma sırasında, hücre küçük bir miktar kaldırmak ve toplu hücreler 10-20 tek tek hücrelerin kümeleri olan onaylamak için beyaz bir ışık mikroskobu altında kontrol edin. Ayrışma boyunca düşük hücre canlılığı ile sonuçlanacaktır.
- Ayrışmış hücreleri için 9.5 ml PBS ekleyin ve 1 ekleyinHücre sayımı için bir hemasitometre bu hücre süspansiyonu 5 ul. 5 dakika boyunca 500 xg'de Pelet hücreleri.
- 1.32X10 6 hücre / farklılaşma ortamda ml 'lik bir konsantrasyonda, hücre yeniden askıya.
- Düz dipli içine de ortalama 24 iyi süspansiyon çanak 500 ul ekleyerek plaka hücreleri.
- 48 saat boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de hücre kültürü inkübatöründe içine 24 ° C de çanak yerleştirin. Bir buna etiketli 1.5 ml tüp her iyi ve yerden 250 ul orta çıkarın. Her bir kuyunun 250 ul taze farklılaşma orta ekleyin. 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj harcanan aracı. ve supernatant atın. 50 ul taze farklılaşma ortamda herhangi bir pelet hücreleri tekrar süspansiyon ve farklılaşma plaka üzerinde de ilgili kültür dönmek.
- Her 48 saat farklılaşma gün 12 yarım orta değişiklere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başlangıçta hücrelerin kültür çanak altına eklemek ve yaymak. Farklılaşma içine 42-72 saatte küçük askıya Oct4 pozitif hücreler oluşturmak ve (Şekil 1A) çoğalırlar. Kısa bir süre bu hücrelerin görselleştirme sonra çoğunluğu kaybolur ve bağlı hücrelerin kültür altındaki yoğun koloni agrega oluşturacaktır. Birkaç gün sonra bu agrega kültür yüzeyinden ayırır. Bu agrega bazılarında bir büyük hücreli (Şekil 1b ve 1c) görülebilir. Ilk görselleştirme üzerine hücrelerin çapı ~ 35 mikron olacaktır. Devam kültürü ile OLCS çapı ~ 45 mikron ulaşmak için büyüyecek. Bunlar OLCS ve destek hücreleri ile toplanan veya (Şekil 1d) bağlı diğer hücrelere olmadan OLCS elde etmek için tripsinize olabilir.
OLCS doğal oosit benzer transkript ifade onaylamak için OLCS için toplanan ve test edilebilirSGK, SCP3, CMOS, Oct4, Bmp15 ve Vasa gibi belirteçlerin ifade. Oct4 ve Vasa farklılaşmamış kök hücrelerde ifade edilir ise bu Bmp15 ve SGK gibi çeşitli işaretleri oosit özeldir. BMP15 TGF-β ailesinin bir üyesidir ve oosit ve folikül gelişimi yer almaktadır. Oosit özel zona pellucida membran yapısı ZP3 dahil olmak üzere birçok protein oluşur. Bu oosit spesifik belirteçler ifade farklılaşmalar içinde OLCS varlığını doğrulamak için kullanılabilir. Ayrıca, bu tür SCP3 ve CMOS gibi mayoz spesifik belirteçler ifade kültür sistemi içinde potansiyel mayoz hücreleri tanımlayabilirsiniz. Bu örnekte 10 OLCS sağlanan ve 10 oosit (Şekil 2) toplandı ve doğrudan cDNA sentezi yapılmıştır. Elde edilen örnekleri, daha sonra yarı-nicel PCR ile test edilmiştir. Gördüğümüz doğal fare oosit bu belirteçlerin ifade karşılaştırılmasıtranskript seviyeleri açısından farklılıklar (Şekil 2). Farklılaşma başarılı olup olmadığını oosit ifade Birçok işaretleri OLCS tarafından ifade edilecektir.
Şekil 1. Cilt elde edilen kök hücrelerin bağlı farklılaşması sırasında sık morfolojileri. Oct4 (yeşil) için pozitif bir erken evre sırasında, hücre farklılaşması) kültürü içinde tespit edilebilir. Çekirdekleri karşı Hoechst (mavi) ile boyandı. Farklılaşma ilerledikçe b) bazı hücre agrega Oct4 (yeşil) Oct4 negatif hücreleri ile çevrili pozitif hücreleri ile görülecektir. Hoechst ile nükleer boyanma da (mavi). C) kültür yüzey. D kopmasının ardından bir folikül benzeri bir yapı bir beyaz ışık görüntüsü) fark sırasında tasvir edilmiştirerentiation büyük Oct4 pozitif (yeşil) oosit-benzeri hücre ya da kültür içinde hücreleri ya da tek başına çevrili görülebilir. Ölçek çubukları: a = 20 mikron, b = 100 mm, c = 40 mikron, d = 10 mm.
Şekil 2. Ortak oosit belirteçlerin oosit, göre OLCS olarak transkript düzeyi,. OLCS ortak oosit belirteçlerin transkript düzeyini gösteren Temsilcisi gerçek zamanlı PCR sonuçları. Bu karşılaştırma 10 oosit-benzeri hücreler 10 yeni doğan fare oosit göre olmaktan neden oluyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fonksiyonel OLCS Bugüne kadar in vitro tamamen kullanılarak geliştirilmiştir edilmemiştir. Son Hayashi ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada. In vitro oluşan ve daha da geliştirilmesi 14 in vivo transfer hücreleri İKK-gibi gelen yavrular üretmek mümkün oldu. Onlar in vivo nakli sonrasında kurtarıldı, hücreleri gibi PGC oluşturmak başardık ES hücreleri veya uyarılmış pluripotent hücreler ile başlayan, olgunlaşmış döllenmiş ve yavrular 14 oluşturmak için kullanılabilir başardık. Bu, çeşitli kaynaklardan elde edilen kök hücreler fonksiyonel oosit oluşturmak için, doğru koşullar altında, bir potansiyele sahiptir göstermektedir.
Kültür sistemi bazı yönlerini bu işleyen için kritik öneme sahiptir. Kök hücrelerin izole edilmesi için kullanılan farelerin suşu çok önemlidir. Bu protokol Jackson Lab (Stok # 008.214) gelen B6 fare ile geliştirilmiş ve kullanılmıştır. Bu fareler sağlayan bir Oct4-EGFP transgen taşımak visEGFP protein üzerinden Oct4 ifade eden hücrelerin ualization. Protokol CD1 fareler kök hücreleri kullanarak teşebbüs edildiğinde etkinliğini çok daha düşük ve OLC oluşumu daha az güvenilir. Şu anda OLC oluşumu verimliliğini B6 fareler kullanırken bile düşüktür. Daha sonra geçiş hücreleri kullanıldığında germ hücre oluşumu verimi çok daha düşük olduğu gibi kullanılan kök hücreler önce başlatılması germ hücre farklılaşması geçişi 2-4 olmalıdır. Çeşitli reaktiflerin kaynağı da önemli olduğu kanıtlanmıştır.
OLCS çeşitli mRNA transkript analiz kültür sistemi optimize yararlı olabilir. Yarı-kantitatif PCR kullanarak OLCS ve oosit (Şekil 2) arasında birçok belirteçleri ifade düzeylerinin karşılaştırılmasında sağlar. Sonuçlar OLCS kırılgan doğası ve OLCS daha ince zona pellucida membran açıklayabilir oosit, daha az SGK ifade olduğunu göstermektedir. Mayoz marker ifadesi
Burada tarif edilen protokole germ hücre oluşumu ve farklılaşma incelemek için in vitro olarak kontrol edilen bir yöntem sağlar. Şu anda üretilen İKK-benzeri hücreler in vitro bakımı yapıldığında fonksiyonel OLCS oluşturmak mümkün değildir. Yeni doğan yumurtalık somatik hücreleri ile toplanır ve in vivo nakledilen zaman İKK-benzeri hücreler erken ikincil folikül oluşturmak edebiliyoruz. Ancak OLCS geri zaman hala güvenilir olgunlaştı ve 12 döllenmiş olması mümkün değildir. Bu tahlilde yardımcı somatik kök hücrelerinden elde edilen ön-mayoz germ hücreleri, eğitim gelmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
PWD Batı Üniversitesi'nde Gerald M. Kidder için Sağlık Araştırma Bursu (CIHR) ve CIHR hibe Kanadalı bir Enstitüleri tarafından desteklenmektedir. Yazar ayrıca Burada sunulan protokol gelişimi ile yardım için Guelph Üniversitesi'nde Julang Li kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
- van den Hurk, R., Zhao, J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).
- Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration. Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).
- Lawson, K. A., Hage, W. J. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).
- Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation. Development. 110, 521-528 (1990).
- Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science. 300, 1251-1256 (2003).
- Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).
- Wang, L., Cao, J., et al. Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells. Cell Biosci. 2, 27 (2012).
- Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin. Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).
- Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line. Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).
- Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells. DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).
- Song, S. H., Kumar, B. M., et al. Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells. Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).
- Dyce, P. W., Liu, J., et al. In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin. PLoS One. 6, e20339 (2011).
- Linher, K., Dyce, P., Li, J. Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells. PLoS One. 4, e8263 (2009).
- Hayashi, K., Ogushi, S., et al. Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice. Science. , (2012).
