Leucine rich repeat kinases 1 en 2 (LRRK1 en LRRK2) zijn multidomain eiwitten die zowel GTPase en kinase domeinen coderen en die gefosforyleerd zijn in cellen. Hier presenteren we een protocol om LRRK1 en LRRK2 label in cellen met 32p orthofosfaat, waardoor een middel om hun algemene cellulaire fosforylering te meten.
Leucine rich repeat kinases 1 en 2 (LRRK1 en LRRK2) zijn paralogen die eenzelfde domein organisatie delen, waaronder een serine-threonine kinase domein, een Ras van complexe eiwitten domein (ROC), een C-terminale domein van ROC (COR), en leucine-rijke en ankyrine-achtige herhalingen in de N-terminus. De precieze cellulaire rol van LRRK2 LRRK1 en moeten nog worden opgehelderd, maar LRRK1 is betrokken bij tyrosine kinase receptor signalisatie 1,2, terwijl LRRK2 is betrokken bij de pathogenese van de ziekte van Parkinson 3,4. In dit rapport presenteren we een protocol bij de LRRK1 en LRRK2 eiwitten te labelen in cellen met 32p orthofosfaat, waardoor een middel om de algemene fosforylering niveaus van deze 2 eiwitten in cellen te meten. Kortom, affiniteit gelabeld LRRK eiwitten worden uitgedrukt in HEK293T cellen die zijn blootgesteld aan medium met 32P-orthofosfaat. De 32P-orthofosfaat wordt opgenomen door de cellen na enkeleuur incubatie en alle moleculen in de cel met fosfaten daardoor radioactief gelabeld. Via de affiniteit tag (3xflag) de LRRK eiwitten worden geïsoleerd van andere cellulaire componenten door immunoprecipitatie. Immunoprecipitaten worden dan gescheiden via SDS-PAGE, geblot op PVDF membranen en analyse van de opgenomen fosfaten wordt uitgevoerd door autoradiografie (32 P-signaal) en Western detectie (eiwit-signaal) van de eiwitten op de blots. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan fosforylering van andere eiwitten die tot expressie worden gebracht in cellen en geïsoleerd door immunoprecipitatie controleren.
Leucine rich repeat kinasen 1 en 2 (LRRK1 en LRRK2) zijn multidomein paralogen die een soortgelijke domeinnaam organisatie delen. Beide eiwitten coderen een GTPase sequentie verwant aan de familie van Ras GTPases (Ras van complexe eiwitten, of ROC) en een C-terminale domein van ROC (COR), effectief classificeren beide eiwitten aan de ROCO eiwitfamilie 5,6. N-terminus van de ROC-COR domein tandem, beide eiwitten coderen een leucine-rich repeat domein en een ankyrine-achtige domein, terwijl slechts LRRK2 codeert extra armadillo domein 6-8. C-terminus van ROC-COR, beide eiwitten delen een serine-threonine kinase domein terwijl slechts LRRK2 codeert voor een WD40 domein in het C-terminale gebied 8. De precieze cellulaire rol van LRRK2 LRRK1 en moeten nog worden opgehelderd, maar LRRK1 is betrokken bij tyrosine kinase receptor signalisatie 1,2, terwijl genetische gegevens wijzen op een rol voor LRRK2 in de pathogenese van de ziekte van Parkinson 3,4.
<pclass = "jove_content"> De fosforylering van eiwitten is een gemeenschappelijk mechanisme in cellen. Bijvoorbeeld kan fosforylatie van essentieel belang voor de activering van enzymen of de werving van eiwitten aan een signaleringscomplex. De cellulaire fosforylering van LRRK2 is uitgebreid gekarakteriseerd en phosphosite mapping is gebleken dat een meerderheid van de cellulaire fosforylatieplaatsen te komen in een cluster tussen de ankyrin repeat en leucine rich repeat domeinen 9-11. Hoewel LRRK1 cellulaire fosforyleringsplaatsen zijn nog niet in kaart gebracht, gegevens uit studies met fosfoproteïne kleuring van blots van immunologisch LRRK1 eiwit van COS7 cellen suggereert dat LRRK1 eiwit is gefosforyleerd in cellen 12.Dit document biedt een fundamentele protocol voor het testen van algemene fosforylering niveau van LRRK1 en LRRK2 in cellijnen met behulp van metabole labeling met 32 P-orthofosfaat. De algemene strategie is eenvoudig. Affiniteit tagged LRRK proteins worden uitgedrukt in HEK293T cellen die blootgesteld aan medium met 32P-orthofosfaat. De 32P-orthofosfaat wordt opgenomen door de cellen na enkele uren incubatie en alle moleculen in de cel met fosfaten daardoor radioactief gelabeld. De affiniteit tag (3xflag) wordt vervolgens gebruikt om de LRRK eiwitten van andere cellulaire componenten te isoleren door immunoprecipitatie. Immunoprecipitaten worden dan gescheiden via SDS-PAGE, geblot op PVDF membranen en analyse van de opgenomen fosfaten wordt uitgevoerd door autoradiografie (32 P-signaal) en Western detectie (eiwit-signaal) van de eiwitten op de blots.
Dit document biedt een fundamentele protocol voor het testen van algemene fosforylering niveau van LRRK1 en LRRK2 in cellijnen met behulp van metabole labeling met 32 P-orthofosfaat. De algemene strategie is eenvoudig. Affinity LRRK tagged eiwitten worden uitgedrukt in HEK293T cellen die zijn blootgesteld aan medium met 32P-orthofosfaat. De 32P-orthofosfaat wordt opgenomen door de cellen na enkele uren incubatie en alle moleculen in de cel met fosfaten daardoor radioactief gelabeld. De a…
The authors have nothing to disclose.
We zijn ook dankbaar voor de Michael J. Fox Foundation ter ondersteuning van deze studie. Wij danken het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek – Vlaanderen FWO (FWO-project G.0666.09, senior onderzoeker fellowship aan JMT), het IWT SBO/80020 project Neuro-TARGET, de KU Leuven (OT/08/052A en IOF-KP/07 / 001) voor hun steun. Dit onderzoek werd mede ondersteund door het Fonds Druwe-Eerdekens beheerd door de Koning Boudewijnstichting om JMT.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
Ponceau S solution | Sigma | P7170 |