Leucin rika upprepnings kinaser 1 och 2 (LRRK1 och LRRK2) är multidomänproteiner som kodar både GTPas och kinasdomäner och som är fosforylerad i celler. Här presenterar vi ett protokoll för att märka LRRK1 och LRRK2 i celler med 32p ortofosfat, vilket ger en möjlighet att mäta sina övergripande cellulära phophorylation nivåer.
Leucin rika upprepnings kinaser 1 och 2 (LRRK1 och LRRK2) är paraloger som delar en liknande organisation domän, inklusive ett serin-treonin-kinasdomän, en Ras av komplexa proteiner domän (ROC), en C-terminal av ROC-domänen (COR), och leucin-rika och ankyrin-liknande upprepningar vid N-terminus. De exakta cellulära roller LRRK1 och LRRK2 har ännu inte klarlagd, men LRRK1 har varit inblandad i tyrosinkinasreceptor signalering 1,2, medan LRRK2 är inblandad i patogenesen av Parkinsons sjukdom 3,4. I denna rapport presenterar vi ett protokoll för att märka LRRK1 och LRRK2 proteiner i celler med 32p ortofosfat, vilket ger ett medel för att mäta den totala fosforyleringsnivåer av dessa två proteiner i celler. I korthet tagged affinitet LRRK proteiner uttrycks i HEK293T-celler som exponeras för medium innehållande 32 P-ortofosfat. Den 32 P-ortofosfat assimileras av cellerna efter endast ett fåtaltimmars inkubering och alla molekyler i den cell som innehåller fosfater därigenom radioaktivt märkt. Via affinitetsmärkning (3xflag) de LRRK proteiner isolerade från andra cellkomponenter genom immunfällning. Immunoprecipitat separeras sedan genom SDS-PAGE, blottades till PVDF-membran och en analys av de införlivade fosfater utförs genom autoradiografi (32 P-signal) och western-detektion (protein-signal) av proteinerna på blotten. Protokollet kan lätt anpassas för övervakning av fosforylering av något annat protein som kan uttryckas i celler och isolerades genom immunfällning.
Leucin rika upprepnings kinaser 1 och 2 (LRRK1 och LRRK2) är multidomain paraloger som delar en liknande organisation domän. Båda proteinerna koda ett GTPas-sekvens besläktad med Ras-familjen av GTPases (RAS av komplexa proteiner, eller ROC) såväl som en C-terminal av ROC-domänen (COR), vilket effektivt klassificera båda proteinerna till ROCO proteinfamiljen 5,6. N-terminalen av domänen tandem ROC-COR, båda proteinerna koda en leucinrik upprepningsdomän samt en ankyrin-liknande domän, medan endast LRRK2 kodar en extra bält Domein 6-8. C-terminal av ROC-COR, båda proteinerna delar ett serin-treonin-kinas-domänen medan endast LRRK2 kodar ett WD40 domänen i den C-terminala regionen 8. De exakta cellulära roller LRRK1 och LRRK2 har ännu inte klarlagd, men LRRK1 har varit inblandad i tyrosinkinasreceptor signalering 1,2, medan den genetiska bevisen pekar på en roll för LRRK2 i patogenesen av Parkinsons sjukdom 3,4.
<pclass = "jove_content"> Den fosforylering av proteiner är en gemensam rättslig mekanism i cellerna. Till exempel kan fosforylering vara avgörande för aktivering av enzymer eller för rekrytering av proteiner till en signaleringskomplex. Den cellulära fosforylering av LRRK2 har i stor utsträckning präglas och phosphosite kartläggning har visat en majoritet av cellulär fosforyleringssäten att inträffa i ett kluster mellan ankyrin repeat och leucin rika upprepa domäner 9-11. Även LRRK1 cellulära fosforyleringssäten har ännu inte kartläggas, tyder allt från studier med fosfoprotein färgning av blöts av immunoprecipiterade LRRK1 protein från COS7 celler som LRRK1 protein fosforyleras i cellerna 12.Detta dokument ger en grundläggande protokoll för analys av allmän fosforylering nivån LRRK1 och LRRK2 i cellinjer med hjälp av metabolisk märkning med 32 P-ortofosfat. Den övergripande strategin är okomplicerad. Affinity tagged LRRK proteins uttrycks i HEK293T-celler som exponeras för medium innehållande 32 P-ortofosfat. Den 32 P-ortofosfat assimileras av cellerna efter bara några timmars inkubation och alla molekyler i cellen som innehåller fosfater är därmed radioaktivt märkt. Den affinitetsmarkör (3xflag) används sedan för att isolera de LRRK proteiner från andra cellulära komponenter genom immunoutfällning. Immunoprecipitat separeras sedan genom SDS-PAGE, blottades till PVDF-membran och en analys av de införlivade fosfater utförs genom autoradiografi (32 P-signal) och western-detektion (protein-signal) av proteinerna på blotten.
Detta dokument ger en grundläggande protokoll för analys av allmän fosforylering nivån LRRK1 och LRRK2 i cellinjer med hjälp av metabolisk märkning med 32 P-ortofosfat. Den övergripande strategin är okomplicerad. Affinity tagged LRRK proteiner uttrycks i HEK293T-celler som exponeras för medium innehållande 32 P-ortofosfat. Den 32 P-ortofosfat assimileras av cellerna efter bara några timmars inkubation och alla molekyler i cellen som innehåller fosfater är därmed radioaktivt…
The authors have nothing to disclose.
Vi är också tacksamma för Michael J. Fox Foundation stödjer denna studie. Vi tackar Research Foundation – Flandern FWO (FWO projekt G.0666.09, senior forskare gemenskap till JMT), IWT SBO/80020 projekt Neuro-TARGET, KU Leuven (OT/08/052A och IOF-KP/07 / 001) för deras stöd. Denna forskning stöddes också delvis av fondens Druwé-Eerdekens förvaltas av King Baudouin Foundation till JMT.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
Ponceau S solution | Sigma | P7170 |