Summary
Live avbildning av celler som utsätts för den lipofila färgämnet FM1-43 möjliggör exakt bestämning av kinetiken genom vilken por-bildande toxiner avlägsnas från plasmamembranet. Detta är en känslig analys som kan användas för att bedöma kraven för Ca2 +, sfingomyelinas och andra faktorer på plasmamembran reparation.
Abstract
Plasma membranskada är en vanlig händelse, och sår måste snabbt repareras för att säkerställa cellöverlevnad. Flödet av Ca 2 + är en viktig signalerande händelse som utlöser reparation av mekaniska skador på plasmamembranet inom ~ 30 sek. Nyligen genomförda studier visar att däggdjursceller återför även deras plasmamembran efter permeabilisering med por bildar toxiner i en 2 +-beroende process Ca som involverar exocytos av det lysosomala enzymet surt sfingomyelinas följt av por endocytos. Här beskriver vi den metod som används för att visa att den återförslutning av celler permeabilized av toxinet streptolysin O är också snabb och beroende av Ca2 + inflöde. Analysen design tillåter synkronisering av händelsen skada och en noggrann kinetisk mätning av förmågan hos celler att återställa plasmamembranintegritet, genom att avbilda och kvantifiera den utsträckning varmed lipofil färgämnet FM1-43 når intracellulära membran. Denna levande analys also medger en känslig bedömning av förmågan hos exogent tillsatt lösliga faktorer såsom sfingomyelinas att inhibera FM1-43 tillströmning, vilket återspeglar förmågan hos celler att reparera sitt plasmamembran. Denna analys tillät oss att visa för första gången att sfingomyelinas verkar nedströms av Ca 2 +-beroende exocytos, eftersom extracellulärt tillsats av enzymet främjar återförslutning av celler permeabiliserade i frånvaro av Ca2 +.
Introduction
Det har varit känt under flera årtionden att plasmamembranet reparation efter mekanisk skada är en Ca 2 +-beroende process 1,2. Senare studier visade att Ca2 + inflöde genom såret utlöser en kraftfull process för exocytos av intracellulära vesiklar vid platsen för skadan, vilket krävs för återförslutning 3,4. Graden av förlust av ett fluorescerande färgämne laddas in i cytoplasman av celler användes för att bedöma hastigheten på reparation, och drog slutsatsen att återförslutning fördes inom <30 sek efter skada 5. Två modeller ursprungligen föreslagits för att förklara kravet på exocytos i plasmamembranet reparation: 1) den "patch"-modellen, som föreslog att Ca2 + inflöde genom lesionen utlöser en början homotypisk fusion av intracellulära vesiklar, som utgör en stor "patch" som skulle sedan appliceras till plasmamembranet för att återförsluta såret 6 och 2) modell spänningen reduktion, där det föreslås att membranet added med Ca2 +-beroende exocytos i närheten av såret skulle reducera plasmamembranspänning, underlätta återförslutning av dubbelskiktet 7. Rollen av Ca2 +-utlöst exocytos i plasmamembranet reparation förstärktes ytterligare av studier som visar att lysosomer innehåller en Ca2 +-sensor molekyl, synaptotagmin VII, vilket underlättar exocytos och plasmamembran reparation i skadade celler 8,9,10,11 .
Dock har ytterligare bevisning visade att enbart exocytos inte var tillräckliga för att främja plasmamembran reparation. Förutom mekaniska tårar på plasmamembranet, är permeabilisering av porbildande toxiner producerade av bakterier 12,13 eller immunceller 14,15 en frekvent form av cellskada. Till skillnad från mekaniska tårar, porbildande proteiner infoga sig på plasmamembranet som bildar en stabil, protein-fodrade por som inte kan återförslutas genom att helt enkelt applicera en membran "patch", eller genom att minskaningsmembranspänning. Intriguingly studier visade att däggdjursceller har en effektiv mekanism för att reparera deras plasmamembran efter permeabilisering med por bildande proteiner, och denna process kräver också närvaron av extracellulärt Ca2 + 12. Detta fynd tog upp frågan om huruvida trans por bort från cellytan var också en snabb process, som observerats med mekaniska sår 5. Överraskande nog visade vår nya studier att återförslutning av celler permeabiliserade med por-bildande toxiner har mycket liknande egenskaper som reparation av mekaniska sår: processen kräver extracellulära Ca2 +, och slutförs inom ~ 30 sek. Undersökning av denna process i större detalj, som nyligen har vi lärt oss att förutom Ca 2 +-reglerad exocytos av lysosomer involverar plasmamembranet reparera en snabb form av endocytos, som triggas av frisättningen av det lysosomala enzymet surt sfingomyelinas (ASM) och är nödvändig inte bara för the avlägsnande av trans porer, men även för reparation av mekaniska sår 16.
För att bestämma kinetiken hos cellåterförslutning efter permeabilisering med porbildande proteiner, i vårt laboratorium har vi anpassat en levande avbildning metod som hade använts tidigare för att bedöma återförslutning av laser skadade isolerade muskelfibrer 17. Denna analys bygger på egenskaper hos den lipofila färgämnet FM1-43, som stabilt interkalerar i den yttre broschyren av lipidbiskikt ökar i fluorescensintensiteten. När plasma membranbiskiktet störs cellulära färgämnes får tillgång till intracellulära membran, som ger en känslig analys för att detektera plasmamembranet skada och reparera 18,16,19,20. För att anpassa denna analys för bedömning av cell återförslutning efter permeabilisering med porbildande proteiner, vi förinkuberas cellerna vid 4 ° C med bakteriellt toxin streptolysin O (SLO), som binder till membran kolesterol 21. Synkron cellpermeabilisering kan sedan lätt uppnås genom att förflytta cellerna från isen att värma mediet i ett uppvärmt mikroskop skede, som aktiverar oligomerisering och förändring i konformationen som leder till transmembran porbildning. En fördel med denna metod, under de tidigare publicerade analyser med hjälp av laser såra, är att ett större antal celler kan analyseras samtidigt i ett mikroskopiskt område, vilket ger bättre provtagning av cellpopulationen. Med tanke på de mekanistiska likheterna mellan cellåterförslutningsprocessen ses efter mekanisk skada och permeabilisering med por-bildande toxiner, analysen beskriver vi här ger en mycket mångsidig och kraftfull metod för att dissekera faktorer som den grundläggande processen för plasmamembran reparation. Som ett exempel, visar vi att det är möjligt att använda denna analys för att identifiera Ca2 +-beroende och oberoende steg i reparationsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transcriptional tysta av ASM
- Seed 1,5 x 10 5 HeLa-celler i 2 ml DMEM-odlingsmedium (DMEM hög glukoshalt med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1% Penn-Strep) på 35 mm glas botten rätter (MatTek) och inkubera över natten vid 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
- Följande dag, aspirera utanför tillväxtmedier och ersätta den med 2 ml DMEM minskat serum-medium (DMEM med 4% FBS), minst 1 timme före tillsats av siRNA transfektion blandningen.
- Förbered 4 rör för siRNA oligo transfektion blandning. I rör A och C, tillsätt 250 l Optimem minskade serum och 4 pl Lipofectamine RNAiMax, per 35 mm skål som ska transfekterade. I rör B, tillsätt 250 l av Optimem minskade serum och 8 pl (160 pmol) av kontrollmedium innehåll GC oligo (kontroll siRNA), per 35 mm skål som ska transfekterade. I röret D, tillsätt 250 l av Optimem minskade serum och 8 pl (160 pmol) av SMPD1 oligo (siASM), per 35 mm skål to transfekteras. Inkubera rören vid rumstemperatur under 5 min.
- Kombinera rör A och B för att bilda transfektion komplex för reglage siRNA, och rören C och D för den ASM siRNA. Inkubera reaktioner vid rumstemperatur under 20 min.
- Lägg Control siRNA och ASM siRNA transfektion reaktionsblandningar långsamt, droppvis, i respektive 35-mm glas botten rätter och inkubera vid 37 ° C / 5% CO 2. Vid 24 h efter transfektion, försiktigt suga bort medierna och ersätta med färskt DMEM-tillväxtmediet. För effektiv ASM knockdown, bör disken inkuberas ytterligare vid 37 ° C / 5% CO2 i ca 31 timmar (totalt 55 timmar) innan live-avbildning.
2. Beredning av reagenser för Live Mikroskopi
- Bered en lösning av rekombinant porbildande toxin streptolysin O (SLO) vid en koncentration av 100 ng / | il i kall 1 x PBS utan Ca 2 + och Mg 2 +. SLO som används i dessa analyser är en constitutively aktiv cystein mutant som inte kräver reduktionsmedel för verksamheten, vänligen tillhandahållen av Dr Rod Tweten, University of Oklahoma. Toxinet uttrycktes i E. coli BL21 DE3 och renades under nativa betingelser, såsom beskrivits tidigare 16.
- Förbered FM1-43 stamlösning: Resuspendera FM1-43 frystorkat pulver i DMSO för att skapa en 25 mM lösning.
- Förbered Lösning A: Späd FM1-43 stamlösning i kall DMEM med Ca 2 + till en slutlig koncentration av 4 ^ M (1,5 ml krävs per MatTek skålen) och förvara på is tills de behövdes.
- Förbered Lösning B: Späd FM1-43 stamlösning i kall DMEM utan Ca 2 + och 10 mM EGTA (Ca 2 +-fritt DMEM) till en slutlig koncentration av 4 ^ M (1,5 ml behövs per MatTek skålen) och förvara på is tills behövs.
- Pre-varm (37 ° C) 1 ml alikvoter av lösning A och lösning B i Eppendorf-rör.
- Håll på is lösningar av DMEM med Ca2 + och Cen 2 ^-fri DMEM.
3. Levande cell imaging av FM1-43 tillströmning i SLO Behandlade och obehandlade celler
- Fyll en medelstorlek grunt metallbehållare med krossad is, invertera den till en stor glasbehållare med is, och lägga till ytterligare is lämnar endast bottenytan av metallbehållaren exponeras. Lägg en blöt pappershandduk på den exponerade metall botten för att möjliggöra även termotransfer.
- Ta en kontroll siRNA-behandlad MatTek skålen (Prov 1) och placera den på den kalla våta pappershandduk. Aspirera försiktigt av alla medier och tvätta 3x med kallt Ca2 +-fri DMEM. Efter den sista tvätten, aspirera bort all media i skålen.
- Till bildcellassocierade FM1-43 i celler med ingen SLO sårskada (prov 1) i närvaro av Ca 2 +, tillsätt 180 | il kall lösning B till centrum glas täckglas i 35-mm glas nedre skålen och inkubera under 5 min på is (tabell 1). Placera MatTek skålen på scenen av en konfokalmikroskop uppvärmd till 37 ° C och utrustad med en klimatkammare (som håller temperatur, luftfuktighet och CO 2 nivåer). Hitta det fält av celler som kommer att avbildas tittar genom en 40X NA 1,3 objektiv (Nikon). Om tillgängligt, slå på PerfectFocus eller liknande anordning för att korrigera för termisk drift.
- Tillsätt 1 ml förvärmd lösning A försiktigt till sidan av den 35-mm skål och ersätta locket av miljökammare (tabell 1).
- Hämta bilder för 4 min på 1 bildruta var 3 sek med hjälp av lämpligt bildprogram (Volocity i Ultraview Vox Perkin Elmer spinning disk konfokalmikroskopi systemet). Excitation av FM1-43 uppnås med en 488 nm laserlinjen med hjälp av ett dikroiskt filter med en 488 nm bandpass, och diskriminering utsläpp uppnås genom användning av en 527 (W55) emissionsfilter. Lasereffektnivåer och kamerakänsligheten är inställd på att nå bildexponering om 100 msek.
- Upprepa steg från 3,2 till 3,6 för att detektera FM1-43 i kontroll siRNA-behandlade celler utan SLO såra (Prov 2) i frånvaro av Ca2 +, med undantag för att i steg 3,5 Lösning B bör läggas (Tabell 1).
- För att mäta FM1-43 tillströmning till Kontroll siRNA-behandlade celler sårade med SLO, antingen i närvaro (prov 3) eller frånvaro av Ca 2 + (prov 4), tillsätt 180 | il kall lösning B innehållande SLO till centrum täckglas av 35-mm glas botten skålen och inkubera i 5 minuter på is som i steg 3.3. Upprepa steg 3.2 till 3.6, justera lägga antingen Lösning A eller lösning B i steg 3.5 (Tabell 1).
- För att bestämma vilken roll ASM i plasmamembranet reparation, upprepa steg från 3,2 till 3,6 med hjälp av ASM siRNA-behandlade celler för alla förhållanden (prov 5-8) (Tabell 1).
- För att bestämma vilken roll cellulära rekombinant sfingomyelinas (SM) påkinetiken för plasmamembrantätning (som återspeglas av inhibitionen i FM1-43 tillströmning) (prov 9-10), är SM tillsättes (0-50 pU) till antingen lösning A eller lösning B i steg 3,5 och sattes sedan till cellerna under levande cell avbildning i en total volym av 1 ml (Tabell 1).
4. Kvantifiering av FM1-43 tillströmning i celler
- Efter att ha förvärvat filmer, mäta intracellulära fluorescensintensiteten av FM1-43 med hjälp av bildanalys programvara (Volocity Suite, PerkinElmer). Rita ett område av intresse för cytosoliska regionen i varje cell i fält och tillämpa de programvaruverktyg för att bestämma medelvärdet FM1-43 fluorescensintensiteten i alla ramar i videon.
- För att justera för variationer i den inledande FM1-43 färgning, är data för varje video uttryckt som faldig ökning av fluorescensintensiteten över tiden, och plottas för olika förutsättningar. Ökningen veck i fluorescens av varje enskild tidpunkt percell beräknas som F T / F 0 där F T är den genomsnittliga fluorescens vid varje enskild tidpunkt, och F 0 är medelvärdet fluorescens vid t = 0 (figurerna 1-2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Låga halter av bakterie sfingomyelinas (SM) räddningsplasmamembran reparation i celler utarmat på lysosomala syra sfingomyelinas.
Använda FM1-43 avbildningsanalys, tidigare har vi visat att celler med brist på det lysosomala enzymet ASM och utsatta för SLO sårskada, i närvaro av Ca 2 + har en plasmamembrandefekt räddas av extracellulära tillsatsen av det rekombinanta humana enzymet 19. Eftersom humant lysosomalt ASM har ett lågt pH-optimum, undersökte vi om återförslutning kan också återställas tillsats SM renat från Bacillus cereus (Sigma), som är fullt aktiva vid neutralt pH. Som tidigare visat, celler behandlade med Kontroll siRNA eller ASM siRNA oligos och utsatta för SLO i frånvaro av Ca2 + (villkor inte permissiva för reparation) var lika permeabiliserades, som visar att ASM utarmning stör inte känslighet för toxinet (Figur 1A ). Intressant, en full räddnings of förmågan hos ASM-deficienta celler att återförsluta efter exponering för SLO iakttogs med låga koncentrationer av SM, 5 och 7,5 pU / ml (Figur 1B). Som enzymkoncentrationen sattes till mediet ökade skedde en gradvis förlust i räddnings fenotyp - celler exponerade för 10 pU / ml endast delvis blockerat tillströmningen av FM1-43 efter exponering för SLO, och celler exponerade för 50 uU / ml visade en stark färg tillströmning mönster, vilket återspeglar en fullständig återförslutande defekt liknande den som observerades i ASM-utarmade celler (figurerna 1b och 1c). Detta resultat tyder på att endocytic borttagning av SLO porer är hårt reglerad av ceramid nivåer som genereras vid plasmamembranet av SM - över en viss nivå processen sker inte normalt, och cellerna kan inte ta bort skador.
Sfingomyelinas Dessutom kringgår kravet på Ca2 + i plasmamembranet reparation.
Remarkably, tillsats av bakterie-SM till celler permeabilized av SLO i frånvaro av Ca2 + (normalt ett tillstånd som inte tillåter cellåterförslutning) också räddade plasmamembran reparation. Såsom ses i celler exponerade för det porbildande toxin i närvaro av Ca 2 + (figurerna 1B och 1C), endast låga koncentrationer av SM var effektiva i att blockera inflödet av FM1-43 (figur 2A och 2B). Dessa resultat indikerar att sfingomyelinas funktioner nedströms av Ca 2 +-beroende steg av plasmamembranet reparation. Detta resultat är helt i linje med vår tidigare föreslagna modellen, som postulerar att Ca2 + strömmar genom trans porer utlöser exocytos av lysosomer och ASM frisättning, som klyver sfingomyelin på ytterblad av plasmamembranet, genererar ceramid och främja por avlägsnande genom endocytos 22 , 19. Det faktum att tillsats av renat SM kringgår behovet av Ca 2 + kraftigt förstärkas anser att under fysiologiska betingelser av Ca2 +-reglerad exocytos av lysosomer är källan av sfingomyelinas-aktivitet krävs för att främja endocytos.
Figur 1. Bacillus cereus sfingomyelinas (SM) kan komplettera plasmamembranet reparera defekt hos celler tystas för expression av surt sfingomyelinas (ASM) sårad av det porbildande toxin streptolysin O (SLO). HeLa-celler som behandlats med kontroll siRNA eller ASM siRNA oligos sårades i frånvaro eller närvaro av Ca2 + och tillströmningen av den lipofila färgämnet FM1-43 avbildades på 1 bildruta / 3 sek under 4 min. FM1-43 intracellulär fluorescens kvantifierades med användning av Volocity programvara och uttrycktes som-faldig ökning i fluorescensintensitet med tiden. (A) I avsaknad av Ca2 +, var båda kontroll siRNA och ASM siRNA-behandlade celler permeabiliserades av SLO. 18-27 celler analyserades vid varje tillstånd,. Felstaplar motsvara medelvärdet + / - SEM (B) i närvaro av Ca 2 +-celler behandlade med Kontroll siRNA kunde återförsluta deras plasmamembran och stoppa dye inflöde, medan celler behandlade med ASM siRNA misslyckades att återförsluta. Dessutom, i närvaro av Ca 2 +, exogen tillsats av låga doser av sfingomyelinas kompletterar plasmamembranet defekt hos ASM siRNA-behandlade celler. 18-62 celler analyserades i varje tillstånd, felstaplar motsvarar medelvärdet + / - SEM (C) Valt tidsramar av filmen analyseras i B.. Barer, 9 um. Klicka här för att visa en större bild .
g "alt =" Bild 2 "fo: innehåll-width =" 3.25in "fo: src =" / files/ftp_upload/50531/50531fig2highres.jpg "/>
Figur 2. Sfingomyelinas Dessutom kringgår kravet för Ca 2 + i plasmamembranet reparation. HeLa-celler behandlade med Kontroll siRNA sårades med SLO i frånvaro av Ca 2 + och tillströmning av det lipofila färgämnet FM1-43 avbildades på en ram / 3 sekund för fyra min. FM1-43 intracellulär fluorescens kvantifierades med användning av Volocity programvara och uttrycktes som-faldig ökning i fluorescensintensitet med tiden. (A) Avsaknaden av plasmamembranet återförslutning ses normalt i celler som skadats med SLO i frånvaro av Ca2 + omkastas genom exogen tillsats av låga doser av sfingomyelinas. 18-31 celler analyserades i varje tillstånd, felstaplar motsvarar medelvärdet + / - SEM (B) Vald tidsramar av filmen analyseras i A.. Barer, 9 um.g2large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Tillvägagångssätt tidslinje. Tidslinje för de experimentella stegen i proceduren. Klicka här för att visa en större bild .
| Ca2 +-tillstånd | Ca2 +-fritt tillstånd | SLO toxin | Varm Lösning A | Varm Lösning B | Sfingomyelinas | Procedur Steg |
| + | - | - | + | - | - | 3,2 |
| - | + | - | - | + | - | 3,7 |
| + | - | + | + | - | - | 3,8 |
| - | + | + | - | + | - | 3,8 |
| + | - | - | + | - | - | 3,9 |
| - | + | - | - | + | - | 3,9 |
| + | - | + | + | - | - | 3,9 |
| - | + | + | - | + | - | 3,9 |
| - | + | + | - | + | + | 3,10 |
| + | - | + | + | - | + | 3,10 |
Tabell 1. Sammansättning av lösningar som används i den experimentella proceduren. Prover som beskrivs i förfarandet är listade i rader. Kolumnerna betecknar närvaro (+) eller frånvaro (-) av nämnda komponent (oligo, Ca 2 + och Ca 2 +-fritt medium, SLO, Lösning A eller B, sfingomyelinas). De experimentella steg där dessa prover först används för levande cell imaging i Procedur 3 § anges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare studier på mekanisk skada och plasmamembran reparation förlitat sig på olika mekanismer för skadar celler, allt från att tappa glaspärlor, mikropipettering, klippning, repor eller skrapning. Avläsningen av alla dessa analyser var kvalitativ snarare än kvantitativ, och inte ge exakta uppgifter på kinetiken för mekanismen reparation. Förmågan hos celler att återförsluta deras plasmamembranet efter det att dessa former av skador mättes genom närvaro eller frånvaro av spårämnen tillsättas till den extracellulära vätskan i cytoplasman, penetration av membran ogenomträngliga färgämnen, förlust av cytosoliska enzymer, ATP-nivåer, eller långsiktig cellöverlevnad. Även om flera av dessa analyser kan utföras kvantitativt, en stort hinder i dessa studier var svårigheten att synkronisera såra händelsen, medan snabbt bedöma kinetiken för återförslutning på enskild cellnivå.
Utvecklingen och användningen av UV-laser skada muskelfibrer fölwed genom detektering av tillströmningen av den lipofila färgämnet FM1-43 var ett stort framsteg i dessa studier 17,20. I stället för brutto skadorna till hela cellpopulationen genom skrapning eller liknande mekaniska medel för skada, dessa analyser infört ett mer definierat sätt att såra celler som tillåts enda cell analys. Förblev dock flera problem vid sådana analyser. Storleken på laser-inducerad skador är stor och ganska varierande beroende på laser intensitet, och mycket olika karaktär än de former av membranskada som inträffar under fysiologiska förhållanden. Ett annat problem är att endast en cell eller muskelfiber kan såras i taget med hjälp av mikroskop-associerade lasrar, minska antalet återförslutning händelser som kan följas, och därmed den statistiska signifikansen av resultaten. Dessa problem med reproducerbarhet och provtagning reduceras kraftigt användbarheten för laserskada som en metod för att undersöka mekanismerna för plasmamembranreparation.
To hantera dessa frågor, har vi utvecklat en ny levande cell imaging analys för att exakt mäta reparation kinetiken för plasmamembranskador orsakade av bakteriella por-bildande toxiner. Detta är en form av skada som förekommer ofta i naturen, eftersom många mikrober besitter talrika gifter som är i stånd att permeabilisering membranet hos eukaryota celler. Denna analys kan synkroniseras exakt genom att i förväg inkubera cellerna med toxinet vid låga temperaturer, och tillåter ett stort antal celler i ett mikroskopiskt fält som skall analyseras med avseende på inflöde av FM1-43, eftersom temperaturen ökas för att utlösa porbildning.
Den exakta synkroniseringen av por-bildning uppnås med denna analys medger reproducerbara mätningar av plasmamembranet reparations kinetik, vilket kan kvantifieras samtidigt i flera enskilda celler inom det mikroskopiska området. En viktig teknisk faktor i dessa analyser är kvaliteten på mikroskopets objektivlins som används för avbildning. THan 40X NA 1,3 (Nikon) objektiv som används i våra analyser möjliggör en tillräcklig provtagning av celler i en population utan att förlora bildupplösning. Att byta till en 10X mål skulle möjliggöra en större provtagning av cellpopulationen, men den resolution som uppnås är otillräckligt för korrekt kvantifiering av intracellulära FM1-43. Ett kritiskt steg för levande cell imaging assay är användningen av PerfectFocus eller en liknande anordning för att korrigera för termisk drift. Vår procedur kräver pre-bindning av bakteriellt porbildande toxin till celler på is och sedan skifta temperaturen snabbt till 37 ° C i levande cell imaging. Denna justering temperatur orsakar axiella fokus svängningar under bildförvärvsperioden, och måste korrigeras. PerfectFocus eller en liknande anordning kommer att korrigera detta problem tillåter levande cell imaging av ett valt fokalplan över långa tidsperioder, vilket möjliggör exakt kvantifiering av plasmamembran reparation kinetik.
En nyckel tillframgången med denna analys är att alltid titer olika koncentrationer av pre bildande toxin för att bestämma reparabla och icke-reparerbara doser, eftersom detta kan variera för varje parti av toxin används. Aktiviteten för många gifter, och av SLO i synnerhet, är temperaturkänslig och flera frys tinar cykler är till skada för sin verksamhet. Men titreringar som utförs parallellt i varje experiment tillåter rätt toxin dos som ska bestämmas exakt på bara ett par minuter av time-lapse avbildning.
Denna analys bygger på upptäckten av tillräcklig intracellulär FM1-43 fluorescens efter plasmamembran skada. Detta kan vara begränsande på vissa villkor. Efter insättning i membran SLO former porer med en diameter av ca 30 nm, vilket möjliggör stabil Ca2 +-inflöde och en snabb plasmamembranreparationssvar i eukaryota celler. Emellertid porbildande toxiner som bildar mindre lesioner, såsom aerolysin och lysenin som har pordiametrar av omkring1-3 nm 23-25 MAJ vara olämpliga för denna analys, eftersom de kan resultera i otillräcklig Ca2 + och FM1-43 tillströmning.
Även med hjälp av ett toxin som genererar stora porer såsom SLO, är det viktigt att komma ihåg att denna avbildning analys inte medger absolut kvantifiering av fluorescensintensiteten, utan snarare relativa fluorescens. Således är det kritiskt att avbildning utförs inom intrascene dynamiska området för den digitala kameran. Eftersom fluorescensintensiteten påverkas av laser makt, exponeringstid, och kameran vinst, är det viktigt att ställa dessa tre parametrar i början av varje experiment, genom att utföra förberedande avbildning av celler som behandlats med FM1-43 och SLO både reparation och icke -reparationsvillkor (Ca2 + och Ca2 +-fri medel). Detta gör valet av bildförvärvs inställningar som tillåter fluorescensdetektion vid tiden noll (före SLO tillägg) men inte resulterar i detektor mättnad (som determsökte av programvara avläsning) i slutet av förvärvet under icke-reparationsvillkor.
Med hjälp av denna analys, kunde vi visa att SLO porer tas bort från plasmamembranet av däggdjursceller på mindre än 30 sekunder, vilket visar att denna process har en snabb kinetik liknande reparation av mekaniska sår 16. Efterföljande undersökningar visade att det lysosomala enzymet ASM krävs för plasmamembran reparation, och kan återställa återförslutning när de läggs extracellulärt till ASM-brist celler 19. I den aktuella studien, tog vi fördel av känsligheten för FM1-43 tillströmning analys för att visa, för första gången, kan det plasmamembran reparation också förekomma i frånvaro av extracellulärt Ca2 +. Exponering av skadade celler till rekombinant sfingomyelinas var tillräckliga för att främja återförslutning i celler permeabilized av SLO i Ca2 + fritt medium, ett tillstånd som normalt inte tillåt för plasmamembran reparation. Interestingly kompletförandet av plasmamembranet reparationskapaciteten har inte observerats efter exponering för höga koncentrationer av sfingomyelinas, vilket tyder på att mängden ceramid som genereras av detta enzym på ytterblad av plasmamembranet är en viktig faktor för den skada borttagningsprocessen. Denna upptäckt visar att Ca2 + är nödvändigt för att utlösa det lysosomala exocytos steg, men behövs inte för sfingomyelinas-inducerade endocytos som är ansvarig för lindas intemalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag R37 AI34867 och R01 GM064625 till NWA Vi tackar Dr R. Tweten från University of Oklahoma för SLO uttrycksplasmiden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
| FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
| Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
| Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
| SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
| Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
| Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
| 35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
| Material | |||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
| Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
| Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
| Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber | |
References
- Heilbrunn, L. The dynamics of living protoplasm. , Academic Press. (1956).
- Chambers, R., Chambers, E. Explorations into the nature of the living cell. , Harvard University Press. (1961).
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263, 390-393 (1994).
- McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).
- Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Chakrabarti, S., et al. Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice. J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).
- Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. Pore formation: an ancient yet complex form of attack. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).
- Morgan, B. P., Campbell, A. K. The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium. Biochem. J. 231, 205-208 (1985).
- Keefe, D., et al. Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis. Immunity. 23, 249-262 (2005).
- Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).
- Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).
- Zha, X., et al. Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis. J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).
- Buckley, J. T. Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin. FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).
- Parker, M. W., et al. Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states. Nature. 367, 292-295 Forthcoming.
- Yamaji-Hasegawa, A., et al. Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin. J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).
