Summary
Vivo imaging di cellule esposte al colorante lipofilo FM1-43 consente una determinazione precisa della cinetica con cui tossine formanti pori vengono rimossi dalla membrana plasmatica. Questo è un test sensibile che può essere utilizzato per valutare requisiti di Ca 2 +, sfingomielinasi e altri fattori sulla membrana plasmatica di riparazione.
Abstract
Lesione della membrana plasmatica è un evento frequente, e le ferite devono essere rapidamente riparato per garantire la sopravvivenza cellulare. Afflusso di Ca 2 + è un evento chiave di segnalazione che attiva la riparazione di ferite meccaniche sulla membrana plasmatica entro ~ 30 sec. Recenti studi hanno rivelato che le cellule di mammifero anche richiudersi loro membrana plasmatica dopo permeabilizzazione con formazione di pori tossine in un processo 2 +-dipendente Ca che coinvolge esocitosi della sfingomielinasi acida lisosomiale seguita da pori endocitosi. Qui, descriviamo la metodologia utilizzata per dimostrare che la richiusura delle cellule permeabilizzate dalla tossina streptolisina O è anche un rapido e dipendente da Ca 2 + afflusso. Il design saggio permette la sincronizzazione dell'evento lesioni e una misurazione cinetica precisa della capacità delle cellule di ripristinare l'integrità della membrana plasmatica mediante imaging e quantificare la misura in cui il colorante liphophilic FM1-43 raggiunge membrane intracellulari. Questo live als testO consente una valutazione sensibile della capacità di esogenamente aggiunto fattori solubili quali sphingomyelinase inibire FM1-43 afflusso, riflettendo la capacità delle cellule di riparazione sulla membrana plasmatica. Questa analisi ha permesso di mostrare per la prima volta che sphingomyelinase agisce a valle di Ca 2 +-dipendente esocitosi, poiché extracellulare aggiunta dell'enzima promuove richiusura delle cellule permeabilizzate in assenza di Ca 2 +.
Introduction
E 'noto da diversi decenni riparazione della membrana plasmatica dopo una lesione meccanica è un 1,2 Ca 2 +-dipendente processo. Studi successivi hanno mostrato che Ca 2 + afflusso attraverso la ferita innesca un vigoroso processo di esocitosi di vescicole intracellulari al sito della lesione, che è richiesto per richiusura 3,4. Il tasso di perdita di un colorante fluorescente caricato nel citoplasma delle cellule è stato utilizzato per valutare la velocità di riparazione, concludendo che richiusura è stato completato entro <30 sec dopo la lesione 5. Due modelli sono stati inizialmente proposti per spiegare il requisito di esocitosi nella riparazione membrana plasmatica: 1) il modello "patch", che suggerisce che Ca 2 + afflusso attraverso la lesione innesca fusione inizialmente omotipica di vescicole intracellulari, formando una grande "patch" che sarebbe poi essere applicato alla membrana plasmatica di richiudere la ferita 6 e 2) il modello di riduzione della tensione, che propone di membrana Added entro Ca 2 +-dipendente esocitosi in prossimità della ferita ridurrebbe tensione della membrana plasmatica, facilitando richiusura del doppio strato 7. Il ruolo di Ca 2 +-triggered esocitosi nel plasma di riparazione della membrana è stata ulteriormente rafforzata da studi che dimostrano che i lisosomi contengono una molecola di Ca 2 + sensore, synaptotagmin VII, che facilita il loro esocitosi e plasma riparazione della membrana in cellule danneggiate 8,9,10,11 .
Tuttavia, ulteriori elementi di prova ha indicato che solo esocitosi non era sufficiente a promuovere la riparazione della membrana plasmatica. Oltre alle rotture meccaniche sulla membrana plasmatica, una forma frequente di danno cellulare è permeabilizzazione da tossine formanti pori prodotte da batteri o cellule immunitarie 12,13 14,15. Diversamente lacrime meccanici, proteine formanti pori si inseriscono sulla membrana plasmatica formando una stabile, poro proteina-allineato che non può essere richiuso semplicemente applicando una "patch" membrana o da riduzioneing tensione della membrana. Curiosamente, studi hanno rivelato che le cellule di mammifero hanno un meccanismo efficace per riparare la membrana plasmatica dopo permeabilizzazione con proteine formanti pori, e questo processo richiede anche la presenza di Ca 2 + extracellulare 12. Questa scoperta ha sollevato la questione se la rimozione dei pori transmembrana dalla superficie cellulare era anche un processo rapido, come osservato con ferite meccaniche 5. Sorprendentemente, i nostri studi recenti rivelato che la richiusura delle cellule permeabilizzate con tossine formanti pori ha proprietà molto simili alla riparazione di ferite meccaniche: il processo richiede Ca 2 + extracellulare, e completata entro ~ 30 sec. Indagare questo processo più in dettaglio, abbiamo recentemente appreso che, oltre a Ca 2 + esocitosi regolata dei lisosomi, riparazione membrana plasmatica comporta una rapida forma di endocitosi, che viene attivato dal rilascio dell'enzima lisosomiale sfingomielinasi acida (ASM) ed è essenziale non solo per the rimozione dei pori transmembrana, ma anche per la riparazione di ferite meccaniche 16.
Per determinare la cinetica di una nuova chiusura cellule dopo permeabilizzazione con le proteine formanti pori, nel nostro laboratorio abbiamo adattato una metodologia di imaging dal vivo che era stato precedentemente utilizzato per valutare la richiusura delle fibre muscolari isolate infortunato laser 17. Questo test si basa sulle proprietà del colorante lipofilo FM1-43, che si intercala stabilmente nel foglietto esterno di bistrati lipidici crescente di intensità di fluorescenza. Quando la membrana a doppio strato plasma viene perturbato extracellulari guadagni tinture accesso alle membrane intracellulari, fornendo un saggio sensibile per rilevare lesioni membrana plasmatica e riparare 18,16,19,20. Per adattare questo test per la valutazione della richiusura cellule dopo permeabilizzazione con le proteine formanti pori, abbiamo le cellule pre-incubate a 4 ° C con la tossina batterica streptolisina O (SLO), che si lega al colesterolo di membrana 21. Cell sincronopermeabilizzazione può quindi essere facilmente ottenuto spostando le celle da ghiaccio per riscaldare medie in una fase microscopio riscaldata, che attiva l'oligomerizzazione e cambio di conformazione che porta alla formazione di pori transmembrana. Un vantaggio di questo approccio, nei saggi precedentemente pubblicati utilizzando ferimento laser, è che un numero maggiore di cellule possono essere analizzati simultaneamente in un campo microscopico, fornendo una migliore campionamento della popolazione cellulare. Date le similarità meccanicistiche tra il processo richiusura cellulare visto dopo l'infortunio meccanica e permeabilizzazione con le tossine che formano pori, il saggio che descriviamo qui fornisce un metodo molto versatile e potente per i fattori coinvolti nel fondamentale processo di riparazione della membrana plasmatica dissezione. Come esempio, si dimostra che è possibile utilizzare questo test per identificare fasi Ca 2 + dipendenti ed indipendenti del processo di riparazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Trascrizionale silenziamento di ASM
- Seme 1,5 x 10 5 cellule HeLa in 2 ml di DMEM mezzi di crescita (alto glucosio DMEM con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, 1% Penn-Strep) su piastre inferiori 35 millimetri di vetro (MatTek) e incubare una notte a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%.
- Il giorno seguente, aspirato fuori i terreni di crescita e sostituirlo con 2 ml di DMEM ridotta mezzo siero (DMEM con 4% FBS), almeno 1 ora prima di aggiungere la miscela di trasfezione siRNA.
- Preparare 4 tubi per la miscela di oligo trasfezione di siRNA. In provette A e C, aggiungere 250 microlitri OptiMEM ridotta siero e 4 microlitri Lipofectamine RNAiMax, per 35 millimetri piatto da transfettate. In tubo B, aggiungere 250 ml di OptiMEM ridotti siero e 8 microlitri (160 pmoli), del controllo del contenuto GC medio oligo (Control siRNA), per 35 millimetri piatto da transfettate. In tubo D, aggiungere 250 ml di OptiMEM ridotti siero e 8 microlitri (160 pmoli) di SMPD1 oligo (smo), per 35 millimetri piatto to essere transfettate. Incubare le provette a temperatura ambiente per 5 min.
- Unire i tubi A e B per formare il complesso trasfezione per il controllo siRNA e tubi C e D per la ASM siRNA. Incubare le reazioni a temperatura ambiente per 20 min.
- Aggiungere miscele di reazione trasfezione controllo siRNA e ASM siRNA lentamente, goccia a goccia, nei rispettivi piatti peggiori 35 mm vetro e incubare a 37 ° C / 5% di CO 2. A 24 ore dopo la trasfezione, delicatamente aspirare fuori dei media e sostituirlo con fresco terreni di coltura DMEM. Per efficiente knockdown ASM, i piatti dovrebbero essere ulteriormente incubate a 37 ° C / 5% di CO 2 per circa 31 ore (totale 55 ore) prima di imaging in tempo reale.
2. Preparazione dei reagenti per Live Microscopia
- Preparare una soluzione di formazione di pori ricombinante tossina Streptolisina O (SLO) ad una concentrazione di 100 ng / ml in PBS 1x freddo senza Ca 2 + e Mg 2 +. La SLO utilizzata in questi test è un constitutively mutante cisteina attivo che non richiede agenti riducenti per l'attività, gentilmente fornito dal Dr. Rod Tweten, University of Oklahoma. La tossina è stata espressa in E. coli BL21 DE3 e purificata in condizioni native, come descritto in precedenza 16.
- Preparare la soluzione stock FM1-43: Risospendere FM1-43 polvere liofilizzata in DMSO per creare una soluzione di 25 mm.
- Preparare Soluzione A: Diluire la soluzione stock FM1-43 in DMEM fredda con Ca 2 + ad una concentrazione finale di 4 micron (1,5 ml sono necessari per ogni piatto MatTek) e memorizzare sul ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Preparare Soluzione B: Diluire la soluzione stock FM1-43 in DMEM freddo senza Ca EGTA mM 2 + e 10 (Ca 2 + DMEM-free) ad una concentrazione finale di 4 micron (1,5 ml necessari per ogni piatto MatTek) e memorizzare sul ghiaccio fino necessario.
- Pre-caldo (37 ° C) 1 ml della soluzione A e soluzione B in provette Eppendorf.
- Continuate a soluzioni di ghiaccio di DMEM con Ca 2 + e Cun DMEM 2-free +.
3. Imaging cellulare dal vivo di FM1-43 Afflusso in SLO trattati e cellule non trattate
- Riempire un contenitore metallico superficiale medie dimensioni con ghiaccio tritato, invertire in un grande contenitore di vetro con ghiaccio, e aggiungere ulteriori ghiaccio lasciando solo la superficie di fondo del contenitore metallico esposto. Mettere un tovagliolo di carta bagnato sul fondo metallico esposto per consentire il trasferimento anche termico.
- Prendete un piatto MatTek controllo siRNA-trattati (campione 1) e posizionarlo sul freddo umido tovagliolo di carta. Aspirare delicatamente tutti i media e lavare 3 volte con il freddo Ca 2 + senza DMEM. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare via tutti i supporti nel piatto.
- Per immagine associata alle cellule FM1-43 in cellule senza SLO ferimento (Esempio 1) in presenza di Ca 2 +, aggiungere 180 ml di soluzione fredda B al vetro coprioggetto centro del piatto inferiore 35 mm vetro e incubare per 5 min in ghiaccio (Tabella 1). Posizionare piatto MatTek sulla scena di un microscopio confocale riscaldato a 37 ° C e dotato di una camera climatica (che mantiene la temperatura, l'umidità e CO 2 livelli). Trovare il campo di celle che verrà creata l'immagine guardando attraverso un 40X NA 1.3 obiettivo (Nikon). Se disponibile, attivare PerfectFocus o un dispositivo simile per correggere la deriva termica.
- Aggiungere 1 ml di soluzione A preriscaldata delicatamente al lato del piatto 35 mm e rimettere il coperchio della camera ambientale (Tabella 1).
- Acquisire immagini per 4 min a 1 fotogramma ogni 3 secondi utilizzando il software di imaging appropriato (Volocity del sistema di filatura di microscopia confocale disco UltraView Vox Perkin Elmer). Eccitazione FM1-43 è realizzato con una linea laser 488 nm usando un filtro dicroico con un passa banda 488 nm, e la discriminazione di emissione è ottenuta attraverso l'uso di un filtro 527 (W55) emissione. Livelli di potenza del laser e la sensibilità della fotocamera sono impostate per ottenere esposizioni di immagine di 100 msec.
- Ripetere i punti da 3.2 a 3.6 per rilevare FM1-43 in cellule siRNA-trattate controllo senza ferita SLO (Esempio 2) in assenza di Ca 2 +, salvo che al punto 3.5 Soluzione B dovrebbe essere aggiunto (Tabella 1).
- Per misurare FM1-43 afferisce nelle cellule di controllo siRNA-trattati con feriti SLO sia in presenza (Esempio 3) o assenza di Ca 2 + (Esempio 4), aggiungere 180 ml di soluzione fredda B contenenti SLO al vetro coprioggetto centro 35-mm piatto fondo di vetro e incubare per 5 minuti sul ghiaccio come nella fase 3.3. Ripetere i passi 3.2 tramite 3.6; regolare l'aggiunta di uno o Soluzione A Soluzione B nella fase 3.5 (Tabella 1).
- Per determinare il ruolo di ASM nel plasma di riparazione della membrana, ripetere i passaggi 3,2-3,6 utilizzando cellule trattate con siRNA ASM per tutte le condizioni (campioni 5-8) (Tabella 1).
- Per determinare il ruolo di sfingomielinasi extracellulare ricombinante (SM) sulcinetica di riparazione della membrana plasmatica (riflessi dalla inibizione in FM1-43 afflusso) (Campioni 9-10), SM viene aggiunto (0-50 μU) a uno o Soluzione A Soluzione B al punto 3.5 e quindi aggiunti alle cellule durante cellule vive rappresentazione in un volume totale di 1 ml (Tabella 1).
4. Quantificazione dei FM1-43 Afflusso in cellule
- Dopo il film sono stati acquisiti, misurare l'intensità di fluorescenza intracellulare di FM1-43 utilizzando il software di analisi di immagine (Volocity Suite, PerkinElmer). Prelievo di una regione di interesse nella regione citosolica di ciascuna cella nel campo e applicare gli strumenti software per determinare la media FM1-43 intensità di fluorescenza in tutte le strutture del video.
- Per regolare le variazioni di iniziale FM1-43 colorazione, i dati per ciascun video vengono espressi come fold aumento di intensità di fluorescenza nel tempo, e tracciate per ciascuna delle diverse condizioni. L'aumento piega in fluorescenza di ciascun tempo di valutazione percella viene calcolato come F T / F 0, dove F T è la fluorescenza media al timepoint specifico, e F 0 è la fluorescenza media a T = 0 (figure 1-2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Basse concentrazioni di batteri plasma sphingomyelinase (SM) salvataggio riparazione della membrana delle cellule impoverito in acido lisosomiale sphingomyelinase.
Usando il test di imaging FM1-43, abbiamo precedentemente dimostrato che cellule carenti per la ASM lisosomiale ed esposte a SLO ferendo in presenza di Ca 2 + hanno una membrana plasmatica difetto viene salvato da extracellulare aggiunta dell'enzima umano ricombinante 19. Poiché la ASM lisosomiale umano ha un basso pH ottimale, abbiamo studiato se richiusura potrebbe anche essere ripristinata aggiungendo SM purificato da Bacillus cereus (Sigma), che è pienamente attiva a pH neutro. Come precedentemente illustrati, cellule trattate con siRNA controllo o oligonucleotidi siRNA ASM ed esposti a SLO in assenza di Ca 2 + (condizioni non permissive per la riparazione) erano ugualmente permeabilizzate, mostrando che ASM esaurimento non interferisce con la sensibilità alla tossina (Figura 1A ). È interessante notare che, una full salvataggio of la capacità delle cellule ASM-carenti per richiudere dopo esposizione a SLO è stato osservato con basse concentrazioni di SM, 5 e 7,5 μU / ml (Figura 1B). Come la concentrazione dell'enzima aggiunti al mezzo aumentata, c'era una graduale perdita nel fenotipo soccorso - cellule esposte a 10 μU / ml, solo parzialmente bloccato l'afflusso di FM1-43 dopo esposizione a SLO, e cellule esposte a 50 μU / ml mostravano un modello forte colorante afflusso, riflettendo un difetto richiusura completa simile a quella osservata in cellule ASM-impoverito (Figure 1B e 1C). Questo risultato suggerisce che la rimozione di endocitosi SLO pori è strettamente regolata dai livelli di ceramide generati a livello della membrana plasmatica da SM - sopra di un certo livello il processo non si verifica normalmente, e le cellule non può rimuovere le lesioni.
Sphingomyelinase inoltre bypassa l'obbligo di Ca 2 + nel plasma di riparazione della membrana.
Sorprendentemente, l'aggiunta di batteri SM a cellule permeabilizzate da SLO in assenza di Ca 2 + (normalmente una condizione che non permette richiusura cella) anche salvato plasma membrana riparazione. Come visto in cellule esposte alla tossina formano pori in presenza di Ca 2 + (Figure 1B e 1C), solo basse concentrazioni di SM erano efficaci nel bloccare afflusso di FM1-43 (Figura 2A e 2B). Questi risultati indicano che funzioni sphingomyelinase valle del Ca 2 +-dipendente passo di plasma membrana riparazione. Questo risultato è pienamente coerente con il nostro modello proposto in precedenza, che postula che Ca 2 + che scorre attraverso i pori transmembrana innesca esocitosi dei lisosomi e rilascio di ASM, che scinde sfingomielina sul foglietto esterno della membrana plasmatica, generando ceramide e promuovere la rimozione dei pori per endocitosi 22 , 19. Il fatto che l'aggiunta di purificato SM evita il bisogno di Ca 2 + fortemente rafforzanos ritiene che in condizioni fisiologiche Ca 2 +-esocitosi regolata lisosomi è la fonte dell'attività sphingomyelinase occorrente per promuovere endocitosi.
Figura 1. Cereus sphingomyelinase Bacillus (SM) possono integrare il difetto plasma riparazione della membrana delle cellule a tacere per l'espressione di sfingomielinasi acida (ASM), ferito dalla formazione di pori tossina streptolisina O (SLO). Cellule HeLa trattate con siRNA di controllo o ASM siRNA oligonucleotidi sono stati feriti in assenza o in presenza di Ca 2 + e afflusso del colorante lipofilo FM1-43 è stato ripreso a 1 frame / 3 sec per 4 min. FM1-43 fluorescenza intracellulare è stata quantificata utilizzando software Volocity e espressa volte maggiore intensità di fluorescenza nel tempo. (A) l'assenza di Ca 2 +, sia di controllo siRNA e le cellule siRNA-trattate ASM sono state permeabilizzate da SLO. 18-27 cellule sono state analizzate in ogni condizione,. Barre di errore sono la media + / - SEM (B) In presenza di Ca 2 +, cellule trattate con siRNA di controllo sono stati in grado di richiudere la membrana plasmatica e fermare tingere afflusso, mentre cellule trattate con ASM siRNA non è riuscito a richiudere. Inoltre, in presenza di Ca 2 +, esogena aggiunta di basse dosi di sfingomielinasi integra il difetto membrana plasmatica delle cellule ASM siRNA-trattati. 18-62 cellule sono state analizzate in ogni condizione, le barre di errore corrispondono alla media + / - SEM (C) selezionati time frame del filmato analizzato in B.. Bar, 9 micron. Clicca qui per ingrandire la figura .
g "alt =" Figura 2 "fo: content-width =" 3.25in "fo: src =" / files/ftp_upload/50531/50531fig2highres.jpg "/>
Figura 2. Sfingomielinasi Inoltre bypassa il requisito di Ca 2 + nel plasma membrana riparazione. Cellule HeLa trattate con siRNA di controllo sono stati feriti con SLO in assenza di Ca 2 + e afflusso del colorante lipofilo FM1-43 è stato ripreso in 1 frame / 3 sec per 4 min. FM1-43 fluorescenza intracellulare è stata quantificata utilizzando software Volocity e espressa volte maggiore intensità di fluorescenza nel tempo. (A) La mancanza di membrana plasmatica richiusura normalmente visto in cellule danneggiate con SLO in assenza di Ca 2 + è invertita dalla esogeno aggiunta di basse dosi di sfingomielinasi. 18-31 cellule sono state analizzate in ogni condizione, le barre di errore corrispondono alla media + / - SEM (B) selezionati time frame del filmato analizzato in A.. Bar, 9 micron.g2large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 3. Procedura timeline. Timeline per le fasi sperimentali coinvolti nella procedura. Clicca qui per ingrandire la figura .
| Ca2 +-condition | Ca2 condizione di libero + | SLO tossina | Soluzione Warm A | Soluzione Warm B | Sphingomyelinase | Procedura Passo |
| + | - | - | + | - | - | 3.2 |
| - | + | - | - | + | - | 3.7 |
| + | - | + | + | - | - | 3.8 |
| - | + | + | - | + | - | 3.8 |
| + | - | - | + | - | - | 3.9 |
| - | + | - | - | + | - | 3.9 |
| + | - | + | + | - | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | + | 3.10 |
| + | - | + | + | - | + | 3.10 |
Tabella 1. Composizione delle soluzioni utilizzate nella procedura sperimentale. Campioni come descritto nella procedura sono elencati in righe. Le colonne indicano la presenza (+) o assenza (-) del componente denominato (oligo, Ca 2 + o Ca 2 + a medio-libero, SLO, Soluzione A o B, sphingomyelinase). Sono indicate le misure sperimentali in cui questi campioni sono dapprima utilizzati per l'imaging cellulare dal vivo nella Procedura sezione 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studi precedenti sul pregiudizio e la membrana plasmatica riparazione meccanica invocati diversi meccanismi delle cellule feriti, che vanno dalla caduta perle di vetro, micropipetting, tranciatura, graffiare o raschiare. La lettura di tutti questi saggi era più qualitativa che quantitativa, e non dare informazioni precise sulla cinetica del meccanismo di riparazione. La capacità delle cellule di richiudere loro membrana plasmatica dopo queste forme di lesioni è stata misurata dalla presenza o assenza di rivelatori aggiunti al fluido extracellulare nel citoplasma, la penetrazione della membrana coloranti impermeabili, perdita di enzimi citosolici livelli di ATP, o lungo termine sopravvivenza cellulare. Sebbene alcuni di questi saggi possono essere eseguiti quantitativamente, uno dei principali ostacoli in questi studi era la difficoltà nel sincronizzare caso ferimento, mentre rapidamente valutare la cinetica di richiusura a livello di singola cellula.
Lo sviluppo e l'utilizzo delle lesioni UV-laser delle fibre muscolari Followed dalla rilevazione del flusso del colorante lipofilo FM1-43 era un importante progresso in questi studi 17,20. Invece del danno inflitto lordo all'intera popolazione cellulare mediante raschiatura o mezzi meccanici simili di lesioni, questi saggi introdotto un modo più definito ferire cellule che hanno permesso l'analisi singola cellula. Tuttavia, vari problemi sussistono in tali saggi. Le dimensioni delle lesioni indotte laser è grande e molto variabile a seconda dell'intensità del laser, e di natura molto diversa rispetto alle forme di lesioni membrana che si verificano in condizioni fisiologiche. Un altro problema è che solo una cella o fibre muscolari possono essere feriti alla volta utilizzando microscopio laser-associata, riducendo il numero di richiusura eventi che possono essere seguiti, e così la significatività statistica dei risultati. Questi problemi di riproducibilità e campionamento notevolmente ridotto l'utilità di lesioni laser come un metodo per studiare i meccanismi di riparazione della membrana plasmatica.
To affrontare questi problemi, abbiamo sviluppato un nuovo test di imaging cellulare dal vivo di misurare con precisione la cinetica di riparazione delle lesioni della membrana plasmatica causate da batteri tossine formanti pori. Questa è una forma di lesione che si verifica frequentemente in natura, poiché molti microbi possiedono numerose tossine che sono capaci di permeabile la membrana delle cellule eucariotiche. Questa analisi può essere sincronizzato con precisione da pre-incubazione delle cellule con la tossina a basse temperature, e permette un gran numero di cellule in un campo microscopico da analizzare per afflusso di FM1-43, la temperatura viene aumentata per innescare formazione di pori.
La sincronizzazione precisa del poro formazione raggiunto con questo test permette misurazioni riproducibili delle cinetica plasmatica riparazione membrana, che può essere quantificato contemporaneamente in più singole celle all'interno del campo microscopico. Un importante fattore tecnico in questi test è la qualità della lente obiettivo microscopio da utilizzare per l'imaging. Tegli 40X NA 1.3 (Nikon) obiettivo usato nei nostri saggi permette un campionamento sufficiente di cellule in una popolazione senza perdere la risoluzione dell'immagine. Il passaggio a un obiettivo 10X consentirebbe formato campionamento della popolazione cellulare, ma la risoluzione che si ottiene è insufficiente per una corretta quantificazione intracellulare FM1-43. Un punto critico per questo live saggio imaging cellulare è l'uso di PerfectFocus o un dispositivo simile per correggere la deriva termica. La nostra procedura richiede pre-legame di batteri che formano pori tossina di celle su ghiaccio e poi spostando la temperatura rapidamente a 37 ° C per l'imaging cellulare dal vivo. Questa regolazione della temperatura provoca fluttuazioni fuoco assiali durante il periodo di acquisizione delle immagini, e deve essere corretta. PerfectFocus o dispositivi analoghi saranno correggere questo problema permettendo di cellule vive di un piano focale selezionata su periodi di tempo estesi, permettendo così precisa quantificazione della cinetica plasmatica riparazione membrana.
Una chiave diil successo di questo saggio deve sempre titolo diverse concentrazioni della tossina preformatura per determinare dosi riparabili e non riparabili, poiché questo può variare per ogni batch di tossina utilizzata. L'attività di molte tossine, e di SLO in particolare, è sensibile alla temperatura e multiple di gelo-disgelo cicli sono dannosi per la sua attività. Tuttavia, titolazioni effettuate fianco in ogni esperimento permettono la dose di tossina corretta da determinare con precisione in pochi minuti di time-lapse imaging.
Questo test si basa sulla rilevazione di sufficiente intracellulare FM1-43 fluorescenza dopo lesione membrana plasmatica. Questo può essere limitante in determinate condizioni. Dopo aver inserito nelle membrane forme SLO pori con un diametro di circa 30 nm, permettendo robusto Ca 2 + afflusso e una risposta rapida riparazione della membrana plasmatica in cellule eucariotiche. Tuttavia, pori formando tossine che formano lesioni più piccole, come aerolysin e Lysenin che hanno diametri dei pori di circa1-3 nm 23-25 maggio non essere adatta a questo test in quanto possono causare insufficiente Ca 2 + e FM1-43 afflusso.
Anche usando una tossina che genera grandi pori come SLO, è importante tenere presente che questo test di imaging non consente la quantificazione assoluta di intensità di fluorescenza, ma piuttosto relativa fluorescenza. Pertanto, è fondamentale che l'imaging viene effettuata all'interno del range dinamico intrascene della fotocamera digitale. Poiché l'intensità di fluorescenza è influenzata dalla potenza del laser, tempo di esposizione, e guadagno della telecamera, è importante che questi tre parametri all'inizio di ogni esperimento, eseguendo l'imaging preliminare di cellule trattate con FM1-43 e SLO sia riparazione e non -riparazione condizioni (Ca 2 + o Ca 2 + a medio-free). Questo permette la scelta di impostazioni di acquisizione delle immagini che consentono il rilevamento della fluorescenza al tempo zero (prima SLO oltre), ma non menzionati nella saturazione del rivelatore (come determined dal software di lettura) al termine dell'acquisizione in condizioni di non-riparazione.
Usando questo test, siamo riusciti a dimostrare che i pori SLO vengono rimossi dalla membrana plasmatica di cellule di mammifero in meno di 30 secondi, dimostrando che questo processo ha una rapida cinetica simili alla riparazione di ferite meccaniche 16. Studi successivi hanno mostrato che la ASM lisosomiale è richiesto per la riparazione della membrana plasmatica, e in grado di ripristinare una nuova chiusura quando aggiunto extracellulare di cellule ASM-deficient 19. Nel presente studio, abbiamo sfruttato la sensibilità del saggio afflusso FM1-43 per mostrare, per la prima volta, che il plasma membrana riparazione può verificarsi anche in assenza di Ca 2 + extracellulare. L'esposizione delle cellule feriti a sphingomyelinase ricombinante è stato sufficiente a promuovere una nuova chiusura in cellule permeabilizzate da SLO in Ca 2 + mezzo libero, condizione normalmente non permissiva per il plasma la riparazione della membrana. È interessante notare che, complezione della capacità plasma riparazione della membrana non è stata osservata dopo l'esposizione ad alte concentrazioni di sfingomielinasi, suggerendo che la quantità di ceramide generato da questo enzima sul foglietto esterno della membrana plasmatica è un importante determinante del processo di rimozione lesione. Questo risultato dimostra che Ca 2 + è necessario attivare il passaggio esocitosi lisosomiale, ma non è necessario per l'endocitosi sfingomielinasi indotta che è responsabile di internalizzazione della ferita.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH R37 AI34867 e R01 GM064625 a NWA Ringraziamo il Dott. R. Tweten dalla University of Oklahoma per l'espressione plasmide SLO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
| FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
| Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
| Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
| SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
| Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
| Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
| 35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
| Material | |||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
| Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
| Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
| Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber | |
References
- Heilbrunn, L. The dynamics of living protoplasm. , Academic Press. (1956).
- Chambers, R., Chambers, E. Explorations into the nature of the living cell. , Harvard University Press. (1961).
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263, 390-393 (1994).
- McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).
- Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Chakrabarti, S., et al. Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice. J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).
- Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. Pore formation: an ancient yet complex form of attack. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).
- Morgan, B. P., Campbell, A. K. The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium. Biochem. J. 231, 205-208 (1985).
- Keefe, D., et al. Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis. Immunity. 23, 249-262 (2005).
- Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).
- Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).
- Zha, X., et al. Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis. J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).
- Buckley, J. T. Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin. FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).
- Parker, M. W., et al. Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states. Nature. 367, 292-295 Forthcoming.
- Yamaji-Hasegawa, A., et al. Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin. J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).
