Summary
Levende billeddannelse af celler udsat for den lipofile farvestof FM1-43 muliggør en præcis bestemmelse af kinetikken, som poredannende toksiner er fjernet fra plasmamembranen. Det er et følsomt assay, der kan bruges til at vurdere kravene til Ca 2 +, sphingomyelinase og andre faktorer på plasma membran reparation.
Abstract
Plasma membran skade er en hyppig begivenhed, og sår skal hurtigt repareret for at sikre cellulær overlevelse. Tilgangen af Ca2 + er en vigtig signalering hændelse, der udløser reparation af mekaniske sår på plasmamembranen i ~ 30 sek. Nylige undersøgelser har vist, at pattedyrceller også tillukkes deres plasmamembranen efter permeabilisering med poredannende toksiner i en Ca2 +-afhængig proces, der involverer exocytose af lysosomale enzym acid sphingomyelinase efterfulgt af pore endocytose. Her beskriver vi den metode, der anvendes til at påvise, at genlukning af celler permeabiliserede af giftstoffet streptolysin O er også hurtig og afhængig af Ca 2 + tilstrømning. Assay design tillader synkronisering af skaden begivenhed og en præcis kinetisk måling af cellernes evne til at genoprette plasmamembran integritet ved billeddannelse og kvantificere det omfang, hvormed den liphophilic farvestof FM1-43 når intracellulære membraner. Denne levende assay also tillader en følsom vurdering af evnen af eksogent tilsat opløselige faktorer såsom sphingomyelinase at inhibere FM1-43 tilstrømning, hvilket afspejler cellernes evne til at reparere deres plasmamembran. Dette assay tilladt os at vise for første gang, at sphingomyelinase virker nedstrøms for Ca2 +-afhængig exocytose, da ekstracellulær tilsætning af enzymet fremmer genlukning af cellerne permeabiliseret i fravær af Ca2 +.
Introduction
Det har været kendt i flere årtier, at plasmamembran reparation efter mekanisk skade er en Ca2 +-afhængig proces 1,2. Senere undersøgelser viste, at Ca2 + indstrømning gennem såret udløser en kraftig proces exocytose af intracellulære vesikler på læsionsstedet, hvilket er påkrævet for genlukning 3,4. Satsen for tab af et fluorescerende farvestof indlæst i cytoplasmaet i celler blev brugt til at vurdere hastigheden af reparation, og konkluderede, at genlukning blev afsluttet inden <30 sek efter skade 5.. To modeller blev oprindeligt foreslået at forklare kravet om exocytose i plasmamembranen reparation: 1) "patch"-modellen, som foreslog, at Ca2 + tilstrømning gennem læsionen udløser oprindeligt homotypisk fusion af intracellulære vesikler, der udgør en stor "patch", der ville derefter anvendes på plasmamembranen at forsegle såret 6 og 2) spændinger reduktion model, som foreslog, at membran-Added af Ca2 +-afhængig exocytose i nærheden af såret vil reducere plasma membranspænding lette genlukning af dobbeltlaget 7. Den rolle, Ca 2 +-udløst exocytose i plasmamembranen reparation blev yderligere forstærket af undersøgelser, der viser, at lysosomer indeholder en Ca 2 +-sensor molekyle, synaptotagmin VII, hvilket letter deres exocytose og plasma membran reparation i skadede celler 8,9,10,11 .
Imidlertid har yderligere dokumentation tilkendegivet, at exocytose alene ikke var tilstrækkelig til at fremme plasmamembran reparation. Ud over mekaniske tårer på plasmamembranen, en hyppig form for cellebeskadigelse er permeabilisering af poredannende toksiner produceret af bakterier 12,13 eller immunceller 14,15. I modsætning til mekaniske tårer, poredannende proteiner indsætte sig på plasmamembranen danne en stabil, protein-foret porestørrelse, som ikke kan lukkes igen blot ved at anvende en membran "patch" eller ved reduktionning membranspænding. Interessant undersøgelser viste, at pattedyrceller har en effektiv mekanisme til at reparere deres plasmamembranen efter permeabilisering med pore-dannende proteiner, og denne proces kræver også tilstedeværelsen af ekstracellulær Ca2 + 12. Dette fund rejst spørgsmålet om, hvorvidt transmembrane pore fjernelse fra celleoverfladen var også en hurtig proces, som observeret med mekaniske sår 5. Overraskende vores nylige undersøgelser viste, at genlukning af cellerne permeabiliseret med poredannende toksiner har meget lignende egenskaber til reparation af mekaniske sår: processen kræver ekstracellulær Ca2 + og er afsluttet inden for ~ 30 sek. Undersøgelse denne proces mere detaljeret, for nylig har vi lært, at ud over Ca 2 +-reguleret exocytose af lysosomer plasmamembranen reparation medfører en hurtig form for endocytose, som udløses ved frigivelse af det lysosomale enzym acid sphingomyelinase (ASM) og er afgørende ikke kun for the fjernelse af transmembrane porer, men også til reparation af mekaniske sår 16.
For at bestemme kinetikken af celle genlukning efter permeabilisering med pore-dannende proteiner i vores laboratorium vi tilpasset en levende billedbehandling metode, der var blevet brugt tidligere til at vurdere genlukning af laser-såret isolerede muskelfibre 17. Dette assay er baseret på egenskaberne af den lipofile farvestof FM1-43, som stabilt interkalerer ind i det ydre blad af lipiddobbeltlag stigende i fluorescensintensitet. Når plasma membrandobbeltlaget er forstyrret ekstracellulære farvestof får adgang til intracellulære membraner, hvilket giver en følsom metode til påvisning af plasmamembranen skade og reparation 18,16,19,20. At tilpasse dette assay til vurdering af celle genlukning efter permeabilisering med poredannende proteiner, vi præinkuberes celler ved 4 ° C med det bakterielle toksin streptolysin O (SLO), som binder til membran cholesterol 21. Synkron cellepermeabilisering kan derefter let opnås ved at bevæge cellerne fra isen til at varme medium i en opvarmet mikroskopobjektbord, som aktiverer oligomerisering og ændring i konformation, som fører til transmembranprotein poredannelse. En fordel ved denne fremgangsmåde i de tidligere publicerede assays ved hjælp af laser sårdannelse, er, at et større antal celler kan analyseres samtidigt i en mikroskopisk felt, der giver bedre prøvetagning af cellepopulationen. I betragtning af de mekanistiske ligheder mellem cellen genlukning proces ses efter mekanisk skade og permeabilisering med poredannende toksiner assayet beskrevet her giver en meget alsidig og effektiv metode til at dissekere faktorer involveret i den grundlæggende proces med plasmamembranen reparation. Som et eksempel viser vi, at det er muligt at anvende dette assay til at identificere Ca2 + afhængige og uafhængige trin i reparationsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Transcriptional undertrykkelse af ASM
- Seed 1,5 x 10 5 HeLa-celler i 2 ml DMEM vækstmedier (DMEM høj glucose med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1% Penn-Strep) på 35 mm glasbund retter (Mattek) og inkuberes natten over ved 37 ° C i en 5% CO 2-inkubator.
- Den følgende dag, aspirat fra medierne vækst og erstatte det med 2 ml DMEM reduceret serum medium (DMEM med 4% FBS), mindst 1 time, før du tilføjer siRNA transfektion blanding.
- Forbered 4 rør for siRNA oligo transfektion blanding. I rør A og C, tilsættes 250 ul Optimem reduceret serum og 4 pi Lipofectamin RNAiMax pr 35 mm skål til transficeres. I rør B, tilsættes 250 ul Optimem reduceret serum og 8 ul (160 pmol) af kontrol medium GC-indhold oligo (kontrol siRNA) per 35 mm skål, der skal transficeres. I rør D, tilsættes 250 ul Optimem reducerede serum og 8. pi (160 pmol) af SMPD1 oligo (siASM), pr 35 mm skål to transficeres. Inkuber rørene ved stuetemperatur i 5 min.
- Kombiner rør A og B til dannelse af transfektion kompleks for kontrol siRNA, og rør C og D for ASM siRNA. Inkubér reaktioner ved stuetemperatur i 20 minutter.
- Tilsæt Kontrol siRNA og ASM siRNA transfektion reaktionsblandinger langsomt dråbevis i de respektive 35-mm glasbund retter og inkuberes ved 37 ° C / 5% CO 2. På 24 timer efter transfektion, forsigtigt aspireres fra medier og erstatte med frisk DMEM vækstmedier. Til effektiv ASM knockdown bør retter yderligere inkuberet ved 37 ° C / 5% CO2 i omkring 31 timer (i alt 55 timer) før den direkte billeddannelse.
2. Klargøring af reagenser til live Microscopy
- Der fremstilles en opløsning af rekombinant poredannende toxin streptolysin O (SLO) ved en koncentration på 100 ng / ul i kold 1x PBS uden Ca2 + og Mg2 +. Sikkerhedsforbindelsesofficeren anvendes i disse analyser er en constitutively aktive cystein-mutant, der ikke kræver reduktionsmidler for aktivitet, venligst stillet til rådighed af Dr. Rod Tweten, University of Oklahoma. Toksin blev udtrykt i E. coli BL21 DE3 og oprenses under native betingelser som beskrevet tidligere 16..
- Forbered FM1-43 stamopløsning: Resuspender FM1-43 frysetørret pulver i DMSO til at oprette en 25 mM løsning.
- Forbered Opløsning A: FM1-43 stamopløsning i kold DMEM fortyndes med Ca2 + til en slutkoncentration på 4 mM (der er brug for 1,5 ml pr Mattek skål) og opbevares på is indtil brug.
- Forbered Opløsning B: FM1-43 stamopløsning i kold DMEM fortyndes uden Ca2 + og 10 mM EGTA (Ca 2 +-fri DMEM) til en endelig koncentration på 4 um (1,5 ml, der er nødvendige pr Mattek skål) og opbevares på is, indtil behov.
- Pre-varm (37 ° C) 1 ml alikvoter af opløsning A og opløsning B i Eppendorf-rør.
- Hold på is løsninger DMEM med Ca 2 + og Cen 2 +-fri DMEM.
3. Live-Cell Imaging af FM1-43 Tilgangen i SLO behandlede og ubehandlede celler
- Fyld en medium størrelse lavvandet metalbeholder med knust is, bland det i en stor glasbeholder med is, og der tilsættes yderligere is og efterlader kun den nederste overflade af metallet udsættes beholderen. Placer et vådt stykke køkkenrulle på den eksponerede metal bund for at tillade selv termisk overførsel.
- Tag en kontrol siRNA-behandlede Mattek fad (Prøve 1), og læg den på kolde våde køkkenrulle. Forsigtigt aspireres fra alle medier og vask 3x med kold Ca 2 +-DMEM. Efter den sidste vask, aspireres fra alle medier i skålen.
- Til billedet celleassocierede FM1-43 i celler uden SLO såret (Prøve 1) i nærvær af Ca 2 +, tilsættes 180 ul kold opløsning B til centrum dækglas af 35-mm glasbund fad og inkuberes i 5 min på is (tabel 1). Placer Mattek parabol på scenen af en konfokal mikroskop opvarmet til 37 ° C og er udstyret med en miljø-kammer (som opretholder temperatur, fugtighed og CO 2 niveauer). Find på celler, der vil blive afbildet kigge gennem et 40X NA 1.3 mål (Nikon). Hvis det er tilgængeligt, tænd PerfectFocus eller en lignende anordning til at korrigere for termisk drift.
- Tilsæt 1 ml forvarmet Solution A forsigtigt på siden af den 35-mm skål og erstatte dækning af miljø-kammer (Tabel 1).
- Anskaf billeder til 4 min på 1 ramme hver 3 sek anvendelse af passende imaging software (Volocity i UltraView Vox Perkin Elmer spinning disk konfokal mikroskopi system). Excitation af FM1-43 er opnået med en 488 nm laser linje ved hjælp af et dikroisk filter med en 488 nm band pass, og diskrimination emission opnås gennem brug af en 527 (W55) emission filter. Laser magt niveauer og kamera følsomhed er indstillet til at opnå billeddata eksponeringer på 100 msek.
- Gentag trin 3,2-3,6 at detektere FM1-43 i kontrol siRNA-behandlede celler uden SLO såret (Prøve 2) i fravær af Ca 2 +, bortset fra at i trin 3,5 Løsning B bør tilføjes (tabel 1).
- Til måling FM1-43 indstrømning i kontrol siRNA-behandlede celler såret med SLO enten i nærvær (prøve 3) eller fravær af Ca2 + (prøve 4), tilsættes 180 pi kold opløsning B indeholder SLO til centrum dækglas af 35-mm glasbund fad og inkuberes i 5 minutter på is som i trin 3.3. Gentag trin 3.2 gennem 3,6, justere tilføje enten løsning A eller opløsning B ved trin 3,5 (tabel 1).
- At fastlægge den rolle, ASM i plasmamembranen reparation, skal du gentage trin 3,2-3,6 hjælp ASM siRNA-behandlede celler for alle forhold (Prøver 5-8) (tabel 1).
- For at bestemme den rolle ekstracellulære rekombinant sphingomyelinase (SM) påkinetik plasmamembranen reparation (afspejlet ved inhibering i FM1-43 tilstrømning) (prøve 9-10), tilsættes SM (0,50 g enhed) til enten opløsning A eller opløsning B i trin 3.5, og derefter tilsat til cellerne i levende celler billeddannelse i et samlet volumen på 1 ml (tabel 1).
4.. Kvantificering af FM1-43 Tilstrømning Into Cells
- Efter film er erhvervet, måle intracellulære fluorescens intensiteten af FM1-43 ved hjælp af billedanalyse software (Volocity Suite, PerkinElmer). Tegn en region af interesse i cytosoliske region af hver celle i området og anvende software-værktøjer til at bestemme den gennemsnitlige FM1-43 fluorescens intensitet gennem alle rammer af videoen.
- At korrigere for variationer i den indledende FM1-43 farvning, er dataene for hver video udtrykt som fold stigning i fluorescens intensitet over tid, og plottet for hver forskellig tilstand. Den fold stigning i fluorescens enkelte tidspunkterne percelle beregnes som F T / F 0, hvor F T er den gennemsnitlige fluorescens ved den specifikke tidspunkterne og F 0 er den gennemsnitlige fluorescens ved t = 0 (figur 1-2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lave koncentrationer af bakteriel sphingomyelinase (SM) rednings plasmamembran reparation i celler udtømte i lysosomale syre sphingomyelinase.
Brug FM1-43 imaging assay vi tidligere viste, at celler, der mangler for lysosomale enzym ASM og udsat for SLO sårdannelse i nærvær af Ca2 + har en plasmamembran defekt reddes af ekstracellulær tilsætning af det rekombinante humane enzym 19. Da den menneskelige lysosomale ASM har en lav pH-optimum, undersøgte vi, om genlukning også kunne genoprettes tilsætning SM oprenset fra Bacillus cereus (Sigma), som er fuldt aktive ved neutralt pH. Som tidligere vist, celler behandlet med kontrol siRNA eller ASM siRNA oligoer og udsat for SLO i fravær af Ca2 + (betingelser ikke permissive til reparation) blev ligeligt permeabiliseret, viser, at ASM udtømning ikke interfererer med følsomhed over for toksinet (figur 1A ). Interessant, en fuld redning of evne ASM-deficiente celler til at genlukke efter udsættelse for SLO blev observeret med lave koncentrationer af SM, 5 og 7,5 g enhed / ml (Figur 1B). Som enzymkoncentration tilsat til mediet steg, var der et gradvist tab i redningen fænotype - celler udsat for 10 g enhed / ml kun delvist blokeret tilstrømningen af FM1-43 efter udsættelse for SLO og celler udsat for 50 g enhed / ml viste en stærk farvestof tilstrømning mønster, der afspejler et fuldt genforseglingsevne defekt svarende til den observeret i ASM-udtømte celler (figur 1B og 1C). Dette resultat antyder, at endocytisk fjernelse af SLO porer er stramt reguleret af ceramidniveauer dannet ved plasmamembranen af SM - over et vist niveau processen ikke forekommer normalt, og cellerne kan ikke fjerne læsioner.
Sphingomyelinase tilsætning omgår kravet om Ca2 + i plasmamembranen reparation.
Bemærkelsesværdigt, tilsætning af bakteriel SM til cellerne permeabiliseret ved SLO i fravær af Ca2 + (normalt en betingelse, der ikke tillader celle genlukning) også reddet plasmamembran reparation. Som det ses i celler udsat for det poredannende toksin i nærværelse af Ca2 + (figur 1B og 1C), kun lave koncentrationer af SM var effektivt ved blokering af tilstrømning af FM1-43 (figur 2A og 2B). Disse resultater indikerer, at sphingomyelinase funktioner nedstrøms for Ca 2 +-afhængige trin i plasmamembranen reparation. Denne konstatering er i fuld overensstemmelse med vores tidligere foreslået model, som postulerer, at Ca 2 + strømmer gennem transmembrane porer udløser exocytose af lysosomer og ASM udgivelse, som spalter sphingomyelin på den ydre folder af plasmamembranen, genererer ceramid og fremme pore fjernelse ved endocytose 22 19. Den kendsgerning, at tilsætning af oprenset SM omgår behovet for Ca2 + kraftig styrkelses, at under fysiologiske betingelser Ca2 +-reguleret exocytose lysosomer er kilden for sphingomyelinase-aktivitet kræves for at fremme endocytose.
Fig. 1. Bacillus cereus sphingomyelinase (SM) kan supplere plasmamembranen reparation defekt af celler tavshed til ekspression af sur sphingomyelinase (ASM) såret af det poredannende toksin streptolysin O (SLO). HeLa-celler behandlet med kontrol siRNA eller ASM siRNA oligoer blev såret i fraværet eller tilstedeværelsen af Ca 2 + og tilstrømning af den lipofile farvestof FM1-43 blev afbildet på 1 frame / 3 sek 4 min. FM1-43 intracellulær fluorescens blev kvantificeret ved hjælp Volocity software og udtrykt som fold stigning i fluorescens intensitet over tid. (A) I fravær af Ca 2 +, blev både kontrol siRNA og ASM siRNA-behandlede celler permeabiliseres af SLO. 18-27 celler blev analyseret i hver tilstand. Fejlsøjler svarer til middelværdien + / - SEM (B) Ved tilstedeværelse af Ca 2 +, celler behandlet med kontrol siRNA var i stand til at forsegle deres plasmamembranen og stoppe farvestof tilstrømning, mens celler behandlet med ASM siRNA undladt at forsegle. Derudover i nærvær af Ca2 +, exogen tilsætning af lave doser af sphingomyelinase supplerer plasmamembranen defekt ASM siRNA-behandlede celler. 18-62 celler blev analyseret i hver tilstand, fejlsøjler svarer til middelværdien + / - SEM (C) Valgt tidsrammer af filmen analyseres B.. Barer, 9 um. Klik her for at se større figur .
g "alt =" Figur 2 "fo: content-width =" 3.25in "fo: src =" / files/ftp_upload/50531/50531fig2highres.jpg "/>
Figur 2. Sphingomyelinase tilsætning omgår kravet om Ca2 + i plasmamembranen reparation. HeLa-celler behandlet med kontrol siRNA blev såret med SLO i fravær af Ca2 + og tilstrømning af den lipofile farvestof FM1-43 blev afbildet på 1 ramme / 3 sek 4 min. FM1-43 intracellulær fluorescens blev kvantificeret ved hjælp Volocity software og udtrykt som fold stigning i fluorescens intensitet over tid. (A) Den manglende plasmamembranen genlukning normalt ses i celler tilskadekomne med SLO i fravær af Ca 2 + vendes ved den exogene tilføjelse af lave doser af sphingomyelinase. 18-31 celler blev analyseret i hver tilstand, fejlsøjler svarer til middelværdien + / - SEM (B) Valgt tidsrammer af filmen analyseres i A.. Barer, 9 um.g2large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.
Figur 3. Procedure tidslinje. Tidslinie for de eksperimentelle trin i proceduren. Klik her for at se større figur .
| Ca2 +-tilstand | Ca2 +-fri tilstand | SLO toksin | Varm Opløsning A | Varm Opløsning B | Sphingomyelinase | Procedure trin |
| + | - | - | + | - | - | 3.2 |
| - | + | - | - | + | - | 3.7 |
| + | - | + | + | - | - | 3.8 |
| - | + | + | - | + | - | 3.8 |
| + | - | - | + | - | - | 3.9 |
| - | + | - | - | + | - | 3.9 |
| + | - | + | + | - | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | + | 3.10 |
| + | - | + | + | - | + | 3.10 |
Tabel 1. Sammensætning af løsninger, der anvendes i den eksperimentelle procedure. Prøver som beskrevet i proceduren, er opført i rækker. Kolonner angiver tilstedeværelsen (+) eller fravær (-) af den navngivne komponent (oligo, Ca2 + eller Ca 2 +-frit medium, SLO, opløsning A eller B, sphingomyelinase). De eksperimentelle trin, hvor disse prøver er første gang brugt til levende celler i Procedure Afsnit 3 er angivet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere undersøgelser af mekanisk skade og plasmamembranen reparation påberåbt sig forskellige mekanismer for at skade celler, der spænder fra slippe glasperler, micropipetting, klipning, ridser eller skrabning. Udlæsningen af alle disse analyser var kvalitative snarere end kvantitative, og ikke give præcise oplysninger om kinetikken af reparation mekanisme. Cellernes evne til at genforsegle deres plasmamembranen efter disse former for skade blev målt ved tilstedeværelse eller fravær af sporstoffer tilsættes til den ekstracellulære væske i cytoplasmaet, penetration af membran uigennemtrængelige farvestoffer, tab af cytosoliske enzymer, ATP-niveauet, eller langvarig cellulær overlevelse. Selv om flere af disse analyser kan udføres kvantitativt en væsentlig hindring i disse studier var svært ved at synkronisere såret begivenhed, mens man hurtigt kan vurdere kinetik genforsegling på enkelt celle niveau.
Udviklingen og anvendelsen af UV-laser skade af muskelfibre Follogift ved påvisning af tilstrømningen af den lipofile farvestof FM1-43 var et stort fremskridt i disse studier 17,20. I stedet for den brutto skade til hele cellepopulation ved skrabning eller lignende mekaniske midler til skade, disse analyser indført en mere veldefineret måde at såre celler, der er tilladt enkelt celle analyse. Imidlertid forblev flere problemer i sådanne assays. Størrelsen af laser-inducerede læsioner er store og helt variabel afhængig af laser intensitet, og meget forskellig art end de former for membran skader, der opstår under fysiologiske betingelser. Et andet problem er, at kun en celle eller muskelfiber kan såret ad gangen ved hjælp mikroskop-associeret lasere, reducere antallet af genlukning begivenheder, der kan følges, og dermed den statistiske signifikans af resultaterne. Disse problemer med reproducerbarhed og prøveudtagning stærkt reduceret nytten af laser skade som en metode til at undersøge mekanismerne i plasmamembranen reparation.
To løse disse problemer, vi udviklet en ny live-cell imaging assay til præcist at måle reparation kinetik plasma membran læsioner forårsaget af bakterielle poredannende toksiner. Dette er en form for skade, der forekommer hyppigt i naturen, fordi mange mikrober besidder mange toksiner, der er i stand til permeabilisering membranen af eukaryote celler. Dette assay kan præcist synkroniseret ved præ-inkubering af cellerne med toksinet ved lave temperaturer, og tillader et stort antal celler i en mikroskopisk område, der skal analyseres for tilstrømning af FM1-43, idet temperaturen forøges til udløse poredannelse.
Den nøjagtige synkronisering af pore-dannelse opnås med dette assay tillader reproducerbare målinger af plasmamembranen reparation kinetik, som kan kvantificeres samtidig i flere individuelle celler i det mikroskopiske område. En vigtig teknisk faktor i disse assays er kvaliteten af mikroskopet objektivlinsen skal anvendes til billeddannelse. Than 40X NA 1.3 (Nikon) mål anvendes i vores assays giver mulighed for en tilstrækkelig prøveudtagning af celler i en population uden at miste billedopløsning. Skifte til en 10X målsætning ville tillade et større udsnit af den celle befolkning, men den beslutning, der er opnået, er utilstrækkelig for korrekt kvantificering af intracellulær FM1-43. Et afgørende skridt for denne live cell imaging-analysen er brugen af PerfectFocus eller en lignende anordning til at korrigere for termisk drift. Vores procedure kræver forudgående binding af bakteriel poredannende toksin til celler på is, og derefter flytte temperaturen hurtigt til 37 ° C i levende celler. Denne justering temperatur vil medføre aksiale fokus udsving i perioden billede erhvervelse, og skal korrigeres. PerfectFocus eller en lignende anordning vil rette dette problem tillader levende celler af en udvalgt fokusplan over længere tid, således at præcis kvantificering af plasmamembranen reparation kinetik.
En nøgle tilsuccesen med denne analyse er at altid titer forskellige koncentrationer af præ-dannende toksin at bestemme repareres og ikke-repareres doser, da det kan variere for hver batch af toksin anvendes. Aktiviteten af mange giftstoffer, og SLO i særdeleshed, er temperaturfølsom og flere fryse-tø cykler er til skade for dets aktivitet. Men titreringer sammen i hvert forsøg tillader den korrekte toksin dosis bestemmes præcist på kun et par minutter af time-lapse billeddannelse.
Denne analyse er baseret på påvisning af tilstrækkelig intracellulær FM1-43 fluorescens efter plasmamembran skade. Dette kan være begrænsende under visse betingelser. Efter indsættelse i membraner SLO former porer med en diameter på omkring 30 nm, hvilket giver robust Ca2 + indstrømning og en hurtig plasmamembran reparation respons i eukaryote celler. Men poredannende toksiner, der danner mindre læsioner, såsom aerolysin og lysenin der har porediametre på ca1-3 nm 23-25 maj ikke være tilstrækkelig til denne analyse, da de kan resultere i utilstrækkelig Ca 2 + og FM1-43 tilstrømning.
Selv bruger et giftstof, der genererer store porer, såsom SLO, er det vigtigt at huske på, at denne imaging analysen ikke mulighed for absolut kvantificering af fluorescens intensitet, men snarere relative fluorescens. Det er således afgørende, at billeddannelse udføres inden intrascene dynamikområde af det digitale kamera. Da fluorescensintensitet påvirkes af laserenergi, eksponeringstid og kamera gain, er det vigtigt at indstille disse tre parametre ved begyndelsen af hvert eksperiment, ved at udføre en foreløbig billeddannelse af celler behandlet med FM1-43 og SLO i både reparation og ikke -reparation forhold (Ca 2 + eller Ca 2 +-fri medium). Dette giver mulighed for valg af Image Acquisition indstillinger, der giver fluorescens detektion ved tidspunkt nul (før SLO tilføjelse), men ikke resulterer i detektor mætning (som determined af software udlæsning) i slutningen af købet under ikke-reparation forhold.
Ved hjælp af denne analyse, var vi i stand til at påvise, at SLO porer fjernes fra plasmamembranen af pattedyrsceller i mindre end 30 sek, hvilket viser, at denne proces har en hurtig kinetik svarende til reparation af mekaniske sår 16. Efterfølgende undersøgelser viste, at det lysosomale enzym ASM er påkrævet for plasma membran reparation og i stand til at genoprette genlukning når det tilsættes ekstracellulært til ASM-mangel celler 19. I den foreliggende undersøgelse, tog vi fordel af følsomheden af FM1-43 tilstrømning assay til at vise for første gang, kan den plasmamembranen reparation også forekomme i fravær af ekstracellulær Ca2 +. Eksponering af sårede celler til rekombinant sphingomyelinase var tilstrækkelig til at fremme genlukning i celler permeabiliserede af SLO i Ca 2 + fri medium, en tilstand, der normalt ikke eftergivende for plasma membran reparation. Interessant kompleførelsen af plasmamembranen reparation kapacitet blev ikke observeret efter eksponering for høje koncentrationer af sphingomyelinase, hvilket tyder på, at mængden af ceramid genereres af dette enzym på den ydre blad af plasmamembranen er en vigtig determinant af læsionen fjernelsen. Dette resultat viser, at Ca2 + er nødvendig for at udløse den lysosomale exocytose trin, men er ikke nødvendig for sphingomyelinase-induceret endocytose, der er ansvarlig for, at såret internalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH R37 AI34867 og R01 GM064625 til NWA Vi takker Dr. R. Tweten fra University of Oklahoma for SLO ekspressionsplasmid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
| FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
| Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
| Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
| SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
| Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
| Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
| 35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
| Material | |||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
| Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
| Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
| Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber | |
References
- Heilbrunn, L. The dynamics of living protoplasm. , Academic Press. (1956).
- Chambers, R., Chambers, E. Explorations into the nature of the living cell. , Harvard University Press. (1961).
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263, 390-393 (1994).
- McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).
- Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Chakrabarti, S., et al. Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice. J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).
- Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. Pore formation: an ancient yet complex form of attack. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).
- Morgan, B. P., Campbell, A. K. The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium. Biochem. J. 231, 205-208 (1985).
- Keefe, D., et al. Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis. Immunity. 23, 249-262 (2005).
- Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).
- Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).
- Zha, X., et al. Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis. J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).
- Buckley, J. T. Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin. FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).
- Parker, M. W., et al. Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states. Nature. 367, 292-295 Forthcoming.
- Yamaji-Hasegawa, A., et al. Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin. J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).
