Summary
Imagens ao vivo de células expostas ao corante lipofílico FM1-43 permite a determinação precisa da cinética pelo qual as toxinas formadoras de poros são removidas a partir da membrana plasmática. Este é um ensaio sensível, que pode ser usado para avaliar os requisitos para Ca 2 +, esfingomielinase e outros factores de reparação da membrana plasmática.
Abstract
Lesão da membrana plasmática é um evento freqüente e feridas têm de ser rapidamente reparado para garantir a sobrevivência celular. Influxo de Ca2 + é um evento chave de sinalização que desencadeia a reparação de feridas mecânicas na membrana de plasma no interior ~ 30 seg. Estudos recentes revelaram que as células de mamíferos também selar sua membrana plasmática após permeabilização com poros formando toxinas em um processo de 2 + dependentes de Ca que envolve a exocitose da esfingomielinase ácida enzima lisossomal seguido por poro endocitose. Aqui, nós descrevemos a metodologia utilizada para demonstrar que os fechos das células permeabilizadas pela toxina estreptolisina também é rápida e dependente de influxo de Ca2 +. O desenho do ensaio permite a sincronização do evento lesão e uma medição precisa da cinética da capacidade de células para restaurar a integridade da membrana plasmática por imagem e quantificar o grau pelo qual o corante liphophilic FM1-43 às membranas intracelulares. Este live als ensaioo permite uma avaliação da sensibilidade da capacidade de exogenamente adicionados factores solúveis, tais como a esf ingomielinase para inibir a FM1-43 afluxo, que reflecte a capacidade de células para reparar a sua membrana plasmática. Este ensaio permitiu demonstrar pela primeira vez que esfingomielinase actua a jusante de Ca 2 + dependente de exocitose, desde adição extracelular da enzima promove a re-selagem de células permeabilizadas, na ausência de Ca 2 +.
Introduction
Ele tem sido conhecido há várias décadas que o reparo da membrana plasmática após a lesão mecânica é um 1,2 Ca 2 + processo-dependente. Estudos posteriores mostraram que o influxo de Ca2 + através da ferida provoca um processo de vigorosa de exocitose de vesículas intracelulares no local da lesão, que é necessária para selar 3,4. A taxa de perda de um corante fluorescente carregados para o citoplasma das células foi usada para avaliar a velocidade de reparação, e concluiu que resselagem foi completada dentro de <30 seg após a lesão 5. Dois modelos foram inicialmente propostos para explicar a exigência de exocitose no reparo da membrana plasmática: 1) o modelo de "patch", que sugeriu que influxo de Ca2 + através da lesão desencadeia fusão inicialmente homotipica de vesículas intracelulares, formando um grande "patch" que faria em seguida, ser aplicado para a membrana plasmática para selar a ferida 6 e 2) o modelo de redução de tensão, que propôs que a membrana added por Ca 2 + dependente de exocitose na vizinhança da ferida iria reduzir a tensão da membrana plasmática, o que facilita a nova selagem da bicamada 7. O papel do Ca 2 +-exocitose desencadeado no reparo da membrana plasmática foi reforçada por estudos que mostram que os lisossomos contêm uma molécula de Ca 2 + sensor, sinaptotagmina VII, o que facilita a sua exocitose e reparo da membrana plasmática das células lesadas 8,9,10,11 .
No entanto, a evidência adicional indicou que exocitose por si só não foi suficiente para promover a reparação da membrana plasmática. Além lágrimas mecânicas na membrana do plasma, uma forma comum de lesão celular é a permeabilização de toxinas formadoras de poros produzidos por bactérias ou células imunitárias 12,13 14,15. Ao contrário de lágrimas mecânicos, proteínas formadoras de poros se inserir na membrana plasmática formando uma poro revestido a proteína estável, que não pode ser fechado de novo, simplesmente por aplicação de uma membrana de "remendo" ou por reduçãoção de tensão de membrana. Curiosamente, os estudos revelaram que as células de mamíferos têm um mecanismo eficaz para reparar a sua membrana de plasma após a permeabilização com proteínas formadoras de poros, e esse processo também requer a presença de extracelular de Ca 2 + 12. Esta descoberta levantou a questão de saber se a remoção transmembranar poros da superfície da célula, também é um processo rápido, tal como observado com feridas mecânicas 5. Surpreendentemente, os nossos estudos recentes mostraram que a nova selagem de células permeabilizadas com toxinas formadoras de poros tem propriedades muito semelhantes às da reparação de feridas mecânicas: o processo requer extracelular de Ca 2 +, e é completado dentro de ~ 30 segundos. Investigando esse processo com mais detalhes, que recentemente descobriu que, além de Ca 2 + exocitose regulada de lisossomos, reparo da membrana plasmática envolve uma forma rápida de endocitose, que é desencadeada pela liberação da enzima esfingomielinase ácida lisossomal (ASM) e é essencial não só para poe remoção dos poros transmembranares, mas também para a reparação de feridas mecânicos 16.
Para determinar a cinética de relacração celular após permeabilização com proteínas formadoras de poros, em nosso laboratório, adaptado de uma metodologia de imagens ao vivo que tinha sido usado anteriormente para avaliar a nova selagem de fibras musculares isoladas ferido a laser 17. Este ensaio baseia-se nas propriedades do corante lipofílico FM1-43, que se intercala estavelmente no folheto exterior de bicamadas lipídicas aumento na intensidade de fluorescência. Quando a bicamada da membrana do plasma é interrompido ganhos corante extracelular acesso às membranas intracelulares, fornecendo um ensaio sensível para detecção de lesões da membrana plasmática e reparar 18,16,19,20. Para adaptar este ensaio para a avaliação de resselagem célula após permeabilização com proteínas formadoras de poros, se as células pré-incubadas a 4 ° C com a toxina bacteriana estreptolisina O (SLO), que se liga ao colesterol da membrana 21. Célula Synchronouspermeabilização pode, então, ser facilmente conseguido movendo as células de gelo para aquecer meio de uma fase de microscópio aquecida, a qual ativa a oligomerização e as alterações na conformação que leva à formação de poros transmembranares. Uma vantagem desta abordagem, ao longo dos ensaios publicados anteriormente usando o ferimento a laser, é de que um maior número de células podem ser analisadas simultaneamente num campo microscópico, proporcionando uma melhor amostragem da população de células. Dadas as semelhanças entre o processo de mecanicistas resselagem celular observada após a lesão mecânica e permeabilização com toxinas formadoras de poros, o ensaio aqui descrito proporciona um método muito versátil e eficiente para factores envolvidos no processo fundamental de reparação da membrana plasmática de dissecação. Como exemplo, mostra-se que é possível utilizar este ensaio para identificar os passos de Ca 2 + dependente e independente do processo de reparação.
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Protocol
1. Transcricional silenciamento de ASM
- Semente de 1,5 x 10 5 células HeLa em 2 ml de DMEM meio de crescimento (DMEM de alto teor de glucose com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 1% de Penn-Strep) em pratos de fundo 35 milímetros de vidro (MatTek) e incubar durante a noite a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2.
- No dia seguinte, aspirado de fora os meios de crescimento e substituí-la com 2 ml de DMEM reduzida meio de soro (DMEM com 4% de FBS), pelo menos 1 hr antes de adicionar a mistura de transfecção siRNA.
- Prepare quatro tubos para a mistura de oligo transfecção siRNA. Em tubos A e C, adicionar 250 uL de Optimem soro reduzida e 4 ul de Lipofectamina RNAiMax, por 35 milímetros prato a ser transfectada. No tubo B, adicionar 250 mL de Optimem reduzido soro e 8 mL (160 pmol) de controle de conteúdo GC médio oligo (Controle siRNA), por 35 milímetros prato a ser transfectadas. Em tubo D, adicionar 250 mL de Optimem reduzido soro e 8 mL (160 pmol) de SMPD1 oligo (siASM), por 35 milímetros prato to ser transfectados. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 5 min.
- Combinar os tubos A e B para formar o complexo de transfecção para o Controle de siRNA, e tubos de C e D para o ASM siRNA. Incubar as reacções à temperatura ambiente durante 20 min.
- Adicionar as misturas de reacção a transfecção de controlo siRNA e ASM siRNA lentamente, gota a gota, para os respectivos pratos de fundo de 35 mm de vidro e incubar a 37 ° C / 5% de CO 2. Às 24 horas após a transfecção, aspirar delicadamente fora da mídia e substitua-o por meio de crescimento fresco DMEM. Para eficiente knockdown ASM, os pratos devem ser ainda incubada a 37 ° C / 5% de CO 2 durante cerca de 31 horas (total de 55 horas) antes de imagens em tempo real.
2. Preparação de Reagentes para Live Microscopia
- Prepara-se uma solução de toxina recombinante formador de poros estreptolisina O (SLO), a uma concentração de 100 ng / mL em PBS frio 1x sem Ca 2 + e Mg 2 +. A SLO utilizado nestes ensaios é um constitutivelmutante y activo cisteína que não requer agentes para reduzir a actividade, gentilmente fornecido pelo Dr. Rod Tweten, University of Oklahoma. A toxina foi expressa em E. coli BL21 DE3 e purificado sob condições nativas, como descrito previamente 16.
- Preparar a solução de estoque FM1-43: Ressuspender FM1-43 em pó liofilizado em DMSO para criar uma solução de 25 mM.
- Preparar a solução de A: Diluir a solução estoque FM1-43 em DMEM frio com Ca 2 + para uma concentração final de 4 | iM (1,5 ml são necessários por MatTek prato) e armazenar em gelo até ser necessária.
- Prepare a Solução B: Diluir a solução estoque FM1-43 em DMEM frio, sem Ca 2 + e 10 mM de EGTA (Ca 2 +-DMEM livre) para uma concentração final de 4 | iM (1,5 ml necessários por MatTek prato) e armazenar em gelo até necessário.
- Pré-quente (37 ° C) 1 ml de solução A e solução B, em tubos de Eppendorf.
- Mantenha em soluções de gelo de DMEM com Ca 2 + e Cum DMEM 2 sem +.
3. Imagens de células vivas de FM1-43 Influx em SLO tratadas e células não tratadas
- Encher um recipiente metálico raso de tamanho médio com gelo moído, invertê-lo num recipiente de vidro grande com gelo, e adicionar gelo adicional deixando apenas a superfície do fundo do recipiente de metal exposto. Coloque uma toalha de papel molhado na parte inferior metal exposto para permitir a transferência, mesmo térmica.
- Pegue um tratado com siRNA controle prato MatTek (Amostra 1) e coloque-a sobre o papel toalha molhada fria. Gentilmente aspirar fora todas as mídias e lavar 3x com frio Ca 2 + livre DMEM. Após a última lavagem, aspirar fora todas as mídias no prato.
- Para imagem associada à célula FM1-43 em células sem SLO ferida (Exemplo 1) na presença de Ca2 +, adicionar 180 mL de solução fria B para a lamela de vidro do centro do prato de fundo de 35 mm de vidro e incubar durante 5 min em gelo (Tabela 1). Coloque MatTek prato na plataforma de um microscópio confocal de aquecida a 37 ° C e equipado com uma câmara ambiental (o qual mantém a temperatura, a humidade e os níveis de CO 2). Encontre o campo de células que será fotografada olhando através de um 1,3 objetiva de 40X NA (Nikon). Se estiver disponível, ligue PerfectFocus ou um dispositivo semelhante para corrigir a deriva térmica.
- Adicionar 1 ml de solução A pré-aquecido suavemente para o lado do prato de 35 mm e substituir tampa do compartimento do meio ambiente (Tabela 1).
- Adquirir imagens para 4 min a 1 frame a cada 3 s usando software de imagem apropriado (Volocity no sistema de microscopia confocal disco giratório UltraView Vox Perkin Elmer). Excitação de FM1-43 é realizada com uma linha de laser 488 nm, utilizando um filtro dicróico com uma banda de passagem de 488 nm e de emissão de discriminação é conseguido através do uso de um filtro de emissão de 527 (W55). Níveis de potência do laser e sensibilidade da câmara são definidas para atingir exposições de imagem de 100 ms.
- Repita os passos 3.2 a 3.6 para detectar FM1-43 em células de controlo tratadas com siRNA sem ferimento SLO (Amostra 2), na ausência de Ca2 +, excepto que devem ser adicionadas no passo 3.5 Solução B (Tabela 1).
- Para medir a FM1-43 fluxo em células tratadas com siRNA de controlo feridos com SLO quer na presença (Exemplo 3) ou ausência de Ca2 + (Exemplo 4), adicionar 180 mL de solução fria B contendo SLO para a lamela de vidro do centro 35 mm prato fundo de vidro e incubar por 5 min no gelo como no passo 3.3. Repita os passos 3,2 por 3,6; ajustar adicionando ou Solução A Solução B ou no passo 3.5 (Tabela 1).
- Para determinar o papel da ASM no reparo da membrana plasmática, repita os passos 3,2-3,6 usando células tratadas com siRNA ASM para todas as condições (amostras 5-8) (Tabela 1).
- Para determinar o papel de esfingomielinase extracelular recombinante (SM) nacinética de reparação da membrana plasmática (reflectidos pela inibição em FM1-43 afluxo) (Exemplos 9-10), SM é adicionado (0-50 mU), quer da solução A ou solução B na etapa 3.5 e, em seguida, adicionado às células durante células vivas imagiologia de um volume total de 1 ml (Tabela 1).
4. Quantificação de FM1-43 em células Afluxo
- Após os filmes tenham sido adquiridos, medir a intensidade de fluorescência intracelular de FM1-43 usando o software de análise de imagem (Volocity Suite, PerkinElmer). Desenhar uma região de interesse na região citosólica de cada célula no campo e aplicar as ferramentas de software para determinar a FM1-43 intensidade média de fluorescência ao longo de todos os quadros de vídeo.
- Para ajustar as variações na inicial FM1-43 coloração, os dados para cada vídeo é expresso como vezes de aumento na intensidade de fluorescência ao longo do tempo, e representada para cada condição diferente. O vezes de aumento na fluorescência de cada ponto de tempo individual porcélula é calculada como F T / F 0, onde T é F a fluorescência média no ponto de tempo específico, e F 0 é a fluorescência média em t = 0 (Figuras 1-2).
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Representative Results
Baixas concentrações de reparo da membrana plasmática bacteriana esfingomielinase (SM) de resgate em células empobrecido em esfingomielinase ácida lisossomal.
Usando o ensaio de imagiologia FM1-43, que mostraram previamente que as células deficientes para a enzima lisossomal ASM e expostas a SLO ferindo na presença de Ca2 + têm um defeito membrana plasmática é resgatado pela adição extracelular da enzima humana recombinante 19. Desde o ASM lisossomal humana tem um pH óptimo baixo, nós investigamos se resselagem pode também ser restaurada adicionando SM purificada a partir de Bacillus cereus (Sigma), que é totalmente activa a pH neutro. Como mostrado anteriormente, as células tratadas com siRNA de controlo ou oligos ASM siRNA e expostas a SLO, na ausência de Ca2 + (condições não permissivas para reparação), foram igualmente permeabilizadas, mostrando que a depleção de ASM não interfere com a sensibilidade à toxina (Figura 1A ). Curiosamente, um resgate o plenof a capacidade das células com deficiência de ASM para selar após exposição a SLO foi observada com concentrações baixas de SM, 5 e 7,5 mU / ml (Figura 1B). À medida que a concentração de enzima adicionada ao meio aumentou, houve uma perda gradual no fenótipo salvamento - células expostas a 10 mU / ml, apenas bloqueou parcialmente o fluxo de FM1-43 após exposição a SLO, e células expostas a 50 mU / ml mostrou um padrão de corante influxo forte, o que reflecte um defeito de resselagem completa semelhante à observada em células esgotadas-ASM (Figuras 1B e 1C). Este resultado sugere que a remoção endocítico de SLO poros é estreitamente regulada pelos níveis de ceramida gerados na membrana plasmática por SM - acima de um certo nível, o processo não ocorre normalmente, e as células não pode remover as lesões.
Além esfingomielinase ignora a exigência de Ca 2 + no reparo da membrana plasmática.
Notavelmente, a adição de bactérias SM para células permeabilizadas por SLO na ausência de Ca2 + (normalmente uma condição que não permite que a nova selagem da célula) também resgatado reparação da membrana plasmática. Como visto em células expostas à toxina de formação de poros, na presença de Ca2 + (Figuras 1B e 1C), apenas baixas concentrações de SM foram eficazes no bloqueio da entrada de FM1-43 (Figura 2A e 2B). Estes resultados indicam que as funções de esfingomielinase jusante do Ca 2 + dependente passo de reparação da membrana plasmática. Este achado é totalmente consistente com o nosso modelo anteriormente proposto, que postula que Ca 2 + que flui através dos poros transmembrana desencadeia a exocitose de lisossomos e liberação ASM, que corta sphingomyelin no folheto externo da membrana plasmática, gerando ceramida e promover a remoção dos poros por endocitose 22 , 19. O facto de que a adição de purificado SM contorna a necessidade de Ca 2 + fortemente reforçars o ponto de vista de que, sob condições fisiológicas, Ca 2 + exocitose regulada de lisossomas é a fonte de actividade de esfingomielinase necessária para promover a endocitose.
Figura 1. Bacillus cereus esfingomielinase (SM) pode complementar o defeito de reparação da membrana plasmática das células silenciados para expressão de esfingomielinase ácida (ASM) ferido pela formação de poros estreptolisina O toxina (SLO). Células HeLa tratadas com siRNA de controlo ou ASM siRNA oligos ficaram feridos na ausência ou presença de Ca 2 + e influxo do corante lipofílico FM1-43 foi fotografada em um quadro / 3 s por 4 min. FM1-43 fluorescência intracelular foi quantificada utilizando software de Volocity e expresso como vezes de aumento na intensidade de fluorescência ao longo do tempo. (A) Em a ausência de Ca 2 +, ambos Controlo siRNA e células tratadas com siRNA ASM foram permeabilizadas por SLO. 18-27 células foram analisadas em cada condição,. Barras de erro correspondem à média + / - SEM (B) Na presença de Ca2 +, células tratadas com siRNA de controlo foram capazes de selar a membrana plasmática e parar o influxo de corante, enquanto células tratadas com ASM siRNA não conseguiu selar. Além disso, na presença de Ca2 +, a adição exógena de doses baixas de esfingomielinase complementa o defeito da membrana plasmática de células tratadas com siRNA ASM. 18-62 células foram analisadas em cada condição, as barras de erros correspondem a média + / - SEM (C) seleccionado intervalos de tempo do filme analisados em B.. Bares, 9 mM. Clique aqui para ver maior figura .
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Figura 2. Além esfingomielinase contorna a necessidade de Ca 2 + na reparação da membrana plasmática. Células HeLa tratadas com siRNA de controlo foram feridas com SLO na ausência de Ca2 +, o afluxo de o corante lipofílico FM1-43 foi representada por imagem no quadro 1/3 seg para 4 min. FM1-43 fluorescência intracelular foi quantificada utilizando software de Volocity e expresso como vezes de aumento na intensidade de fluorescência ao longo do tempo. (A) A falta de membrana plasmática de resselagem normalmente observada em células lesadas com SLO na ausência de Ca2 + é invertida pela adição exógena de baixas doses de esfingomielinase. 18-31 células foram analisadas em cada condição, as barras de erros correspondem a média + / - SEM (B) seleccionado intervalos de tempo do filme analisados em um.. Bares, 9 mM."target =" _blank g2large.jpg "> Clique aqui para ver maior figura.
Figura 3. Procedimento cronograma. Timeline para as etapas experimentais envolvidos no procedimento. Clique aqui para ver maior figura .
| Ca2 +-condição | Condição livre de Ca2 + | SLO toxina | Solução Quente A | Quente Solução B | Esfingomielinase | Procedimento Passo |
| + | - | - | + | - | - | 3.2 |
| - | + | - | - | + | - | 3.7 |
| + | - | + | + | - | - | 3.8 |
| - | + | + | - | + | - | 3.8 |
| + | - | - | + | - | - | 3,9 |
| - | + | - | - | + | - | 3,9 |
| + | - | + | + | - | - | 3,9 |
| - | + | + | - | + | - | 3,9 |
| - | + | + | - | + | + | 3.10 |
| + | - | + | + | - | + | 3.10 |
Tabela 1. Composição das soluções utilizadas no procedimento experimental. Amostras, como descrito no procedimento são listados em filas. Colunas denotar a presença (+) ou ausência (-) do componente denominado (oligo, Ca 2 + ou Ca2 + livre médio, SLO, Solução A ou B, esfingomielinase). São indicadas as etapas experimentais em que estas amostras são utilizados pela primeira vez para imagens de células vivas no Procedimento Seção 3.
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Discussion
Estudos anteriores sobre o prejuízo e membrana plasmática reparo mecânico contou com diversos mecanismos de células ferindo, desde soltando pérolas de vidro, micropipetting, corte, arranhão ou raspagem. A leitura de todos estes ensaios foi qualitativa do que quantitativa, e não dar informações precisas sobre a cinética do mecanismo de reparo. A capacidade das células para voltar a selar a sua membrana de plasma após estas formas de lesão foi medida através da presença ou ausência de marcadores adicionados ao fluido extracelular no citoplasma, a penetração dos corantes de membrana impermeável, perda de enzimas citosólicas, os níveis de ATP, ou a longo prazo sobrevivência celular. Embora vários desses ensaios podem ser realizados quantitativamente, um obstáculo importante nestes estudos foi a dificuldade na sincronização do evento ferindo, enquanto rapidamente avaliar a cinética de resselagem ao nível da célula individual.
O desenvolvimento eo uso de lesão UV laser de fibras musculares seguincasar pela detecção do influxo do corante lipofílico FM1-43 foi um grande avanço nesses estudos 17,20. Em vez de o dano bruto infligido à população inteira de células por raspagem ou por processo mecânico semelhante de lesões, estes ensaios introduziu uma forma mais definida para ferir as células que permitiram análise única célula. No entanto, vários problemas permaneceram em tais ensaios. O tamanho das lesões induzidas por laser é grande e bastante variável, dependendo da intensidade do laser, e de natureza muito diferente do que as formas de lesão de membrana que ocorrem durante as condições fisiológicas. Um outro problema é que uma única célula ou de fibra muscular pode ser ferida de cada vez usando laser associada a microscopia, a redução do número de eventos de resselagem que pode ser seguido, e, assim, a significância estatística dos resultados. Estes problemas com a reprodutibilidade e amostragem reduzida consideravelmente a utilidade da lesão a laser como um método para investigar os mecanismos de reparação da membrana plasmática.
To abordar estas questões, foi desenvolvido um novo ensaio imagens de células vivas para medir com precisão a cinética de reparo de lesões da membrana plasmática causadas por toxinas que formam poros bacterianas. Esta é uma forma de lesão que ocorre frequentemente na natureza, uma vez que muitos microorganismos possuem inúmeras toxinas que são capazes de permeabilização da membrana de células eucarióticas. Este ensaio pode ser precisamente sincronizado por pré-incubação das células com a toxina a baixas temperaturas, e permite que um grande número de células num campo microscópico para ser analisada por influxo de FM1-43, medida que a temperatura é aumentada para desencadear a formação de poros.
A sincronização precisa de poro-formação obtido com este ensaio permite medições reprodutíveis da cinética de reparação da membrana plasmática, o qual pode ser quantificada em simultâneo em várias células individuais dentro do campo do microscópio. Um factor importante na técnica estes ensaios é a qualidade da lente objectiva de microscópio para ser usado para geração de imagens. Tele 40X NA 1.3 (Nikon) objectivo usado nos nossos ensaios permite uma amostragem suficiente de células de uma população, sem perder a resolução da imagem. Mudar para uma objetiva de 10X permitiria uma maior amostragem da população de células, mas a resolução que é alcançado é insuficiente para a quantificação adequada do intracelular FM1-43. Um passo crítico para este ensaio imagem de células vivas é a utilização de PerfectFocus ou um dispositivo semelhante para corrigir desvio térmico. O nosso procedimento requer pré-ligação da toxina bacteriana de formação de poros para as células sobre gelo e, em seguida, mudando a temperatura rapidamente a 37 ° C para a imagem de células vivas. Este ajuste de temperatura vai causar flutuações foco axiais durante o período de aquisição de imagem, e deve ser corrigido. PerfectFocus ou um dispositivo semelhante irá corrigir este problema, permitindo imagens de células vivas de um plano focal seleccionada durante longos períodos de tempo, permitindo, assim, a quantificação precisa da cinética de reparação da membrana plasmática.
Uma chave para ao sucesso deste ensaio é sempre título diferentes concentrações de toxina pré-formação para determinar doses reparáveis e não reparáveis, uma vez que isto pode variar para cada lote de toxina usado. A actividade de muitas toxinas, e de SLO em particular, é sensível à temperatura e de múltiplos ciclos de congelação-descongela são prejudiciais para a sua actividade. No entanto, titulações efectuadas em paralelo com cada experimento permitem a dose toxina correta a ser precisamente determinada em apenas alguns minutos de imagens de lapso de tempo.
Este ensaio baseia-se na detecção de fluorescência intracelular suficiente FM1-43 após a lesão da membrana plasmática. Isto pode ser limitante, sob certas condições. Depois de inserir em membranas formas SLO poros com um diâmetro de cerca de 30 nm, permitindo robusta influxo de Ca2 + e uma resposta de reparação da membrana do plasma rápida em células eucarióticas. No entanto, a formação de poros-toxinas que se formam lesões mais pequenas, tais como aerolysin e lysenin que têm diâmetros de poros de cerca1-3 nm 23-25 maio não ser adequada para este ensaio, uma vez que pode resultar em insuficiência Ca 2 + e FM1-43 influxo.
Mesmo usando uma toxina que gera grandes poros, como SLO, é importante ter em mente que este ensaio de imagens não permite a quantificação absoluta da intensidade de fluorescência, mas sim de fluorescência relativa. Assim, é crítico que a imagem é realizada dentro da gama dinâmica intrascene da câmara digital. Uma vez que a intensidade de fluorescência é afectada pela energia do laser, tempo de exposição, e o ganho da câmara, que é importante para definir estes três parâmetros no início de cada experiência, através da realização de imagiologia preliminar de células tratadas com a FM1-43 e SLO em ambos reparação e não -reparação condições (Ca 2 + ou Ca 2 + médio-free). Isto permite que a escolha de configurações de aquisição de imagem que permitem a detecção de fluorescência no tempo zero (antes disso SLO), mas não resultam na saturação de detector (como determinada por software de leitura) na extremidade de aquisição em condições não-reparação.
Utilizando este ensaio, que foram capazes de demonstrar que os poros SLO são removidas a partir da membrana plasmática de células de mamífero, em menos de 30 segundos, o que demonstra que este processo tem uma rápida cinética semelhante para a reparação de feridas mecânicos 16. Estudos posteriores mostraram que a enzima lisossomal ASM é necessário para a reparação da membrana de plasma, e é capaz de restaurar a resselagem, quando adicionados a células extracelularmente ASM-19 deficiente. No presente estudo, aproveitou a sensibilidade do ensaio influxo FM1-43 para mostrar, pela primeira vez, que o reparo da membrana plasmática também pode ocorrer na ausência de Ca 2 + extracelular. A exposição de células feridos a esfingomielinase recombinante foi suficiente para promover selar em células permeabilizadas por SLO em Ca 2 + meio livre, uma condição que normalmente não permissivo para o reparo da membrana plasmática. Curiosamente, compleção da capacidade de reparação de membrana de plasma não foi observada depois de exposição a concentrações elevadas de esfingomielinase, sugerindo que a quantidade de ceramida gerada por esta enzima no folheto exterior da membrana plasmática é um determinante importante do processo de remoção da lesão. Esta descoberta demonstra que o Ca2 + é necessária para desencadear o passo lisossomal exocitose, mas não é necessária para a endocitose induzida por esfingomielinase que é responsável pela internalização da ferida.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R37 AI34867 e R01 GM064625 a NWA Agradecemos ao Dr. R. Tweten da Universidade de Oklahoma para a expressão plasmídeo SLO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
| FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
| Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
| Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
| SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
| Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
| Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
| 35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
| Material | |||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
| Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
| Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
| Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber | |
References
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