Summary
Lipophilic डाई FM1-43 के संपर्क में कोशिकाओं की लाइव इमेजिंग ताकना के गठन विषाक्त पदार्थों प्लाज्मा झिल्ली से हटा रहे हैं जिसके द्वारा कैनेटीक्स का सटीक निर्धारण की अनुमति देता. इस CA के लिए आवश्यकताओं 2 +, sphingomyelinase और प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत पर अन्य कारकों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक संवेदनशील परख है.
Abstract
प्लाज्मा झिल्ली चोट एक लगातार घटना है, और घाव तेजी से सेलुलर अस्तित्व को सुनिश्चित करने की मरम्मत किया जाना है. सीए 2 + की आमद 30 सेकंड ~ भीतर प्लाज्मा झिल्ली पर यांत्रिक घाव की मरम्मत हो सके कि एक महत्वपूर्ण संकेत घटना है. हाल के अध्ययनों स्तनधारी कोशिकाओं को भी ध्यान में लीन होना ताकना endocytosis द्वारा पीछा lysosomal एंजाइम एसिड sphingomyelinase की एक्सोसाइटोसिस शामिल है कि एक सीए 2 + निर्भर प्रक्रिया में विषाक्त पदार्थों के गठन के साथ permeabilization के बाद उनकी प्लाज्मा झिल्ली reseal कि पता चला. यहाँ, हम विष streptolysin हे द्वारा permeabilized कोशिकाओं की resealing सीए 2 + आमद पर भी तेजी और निर्भर है कि प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया पद्धति का वर्णन. परख डिजाइन की अनुमति देता चोट घटना के तुल्यकालन और इमेजिंग द्वारा प्लाज्मा झिल्ली अखंडता को बहाल करने और liphophilic डाई FM1-43 intracellular झिल्ली पहुंचता है जिसके द्वारा हद बढ़ाता कोशिकाओं की क्षमता का एक सटीक गतिज माप. इस लाइव परख ए एल एसओ exogenously की क्षमता का एक संवेदनशील आकलन उनके प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत के लिए कोशिकाओं की क्षमता को दर्शाती है, FM1-43 बाढ़ को बाधित करने के लिए इस तरह के sphingomyelinase के रूप में घुलनशील कारकों गयी अनुमति देता है. यह परख हमें एंजाइम की बाह्य अलावा सीए 2 + के अभाव में permeabilized कोशिकाओं की resealing को बढ़ावा देता है के बाद से sphingomyelinase, सीए 2 + निर्भर एक्सोसाइटोसिस के बहाव में कार्य करता है कि पहली बार के लिए दिखाने के लिए अनुमति दी.
Introduction
यह यांत्रिक चोट के बाद प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत एक सीए 2 + निर्भर प्रक्रिया 1,2 है कि कई दशकों के लिए जाना जाता रहा है. बाद में पढ़ाई घाव के माध्यम से सीए 2 + बाढ़ 3,4 resealing के लिए आवश्यक है, जो चोट के स्थल पर intracellular vesicles के एक्सोसाइटोसिस की एक जोरदार प्रक्रिया आरंभ करने वाली दिखाया. कोशिकाओं के cytoplasm में भरी हुई एक फ्लोरोसेंट रंजक के नुकसान की दर मरम्मत की गति का आकलन किया, और resealing चोट 5 के बाद <30 सेकंड के भीतर पूरा कर लिया गया है कि निष्कर्ष निकाला गया था. दो मॉडल शुरू में प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत में एक्सोसाइटोसिस के लिए आवश्यकता समझाने के लिए प्रस्तावित किया गया: घाव के माध्यम से सीए 2 + बाढ़ एक बड़ी "पैच" के गठन, intracellular vesicles के शुरू में homotypic संलयन हो सके कि जो सुझाव दिया है 1) "पैच" मॉडल, कि होगा फिर घाव 6 और कहा कि झिल्ली मिलाइए प्रस्तावित जो 2) तनाव में कमी मॉडल, reseal करने के प्लाज्मा झिल्ली को लागू किया जाघाव के आसपास के क्षेत्र में सीए 2 + निर्भर एक्सोसाइटोसिस द्वारा घ. bilayer 7 के resealing की सुविधा, प्लाज्मा झिल्ली तनाव को कम करेगा. प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत में सीए 2 + ट्रिगर एक्सोसाइटोसिस की भूमिका आगे लाइसोसोम घायल कोशिकाओं में उनके एक्सोसाइटोसिस और प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत की सुविधा है, जो एक सीए 2 + सेंसर अणु, synaptotagmin सातवीं होते दिखा रहा है कि अध्ययन के द्वारा बढ़ाया गया था 8,9,10,11 .
हालांकि, अतिरिक्त सबूत अकेले एक्सोसाइटोसिस प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त नहीं था कि संकेत दिया है. प्लाज्मा झिल्ली पर यांत्रिक आँसू के अलावा, सेल चोट के एक लगातार फॉर्म बैक्टीरिया 12,13 या प्रतिरक्षा कोशिकाओं 14,15 द्वारा उत्पादित ताकना के गठन विषाक्त पदार्थों से permeabilization है. यांत्रिक आँसू के विपरीत, ताकना गठन प्रोटीन प्लाज्मा झिल्ली एक झिल्ली "पैच" लगाने से या reduc द्वारा बस resealed नहीं किया जा सकता कि एक स्थिर, प्रोटीन लाइन ताकना बनाने पर खुद को डालनेझिल्ली तनाव आईएनजी. दिलचस्प, पढ़ाई स्तनधारी कोशिकाओं ताकना गठन प्रोटीन के साथ permeabilization के बाद उनकी प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत के लिए एक कुशल व्यवस्था है, और इस प्रक्रिया को भी बाह्य सीए 2 + 12 की उपस्थिति की आवश्यकता है कि पता चला. यांत्रिक घाव 5 के साथ मनाया के रूप में यह निष्कर्ष कोशिका की सतह से transmembrane ताकना हटाने की भी एक तेजी से प्रक्रिया था का सवाल उठाया. प्रक्रिया सीए 2 + कोशिकी की आवश्यकता है, और 30 सेकंड ~ के भीतर पूरा हो गया है: हैरानी की बात है, हमारे हाल के अध्ययनों से ताकना के गठन विषाक्त पदार्थों के साथ permeabilized कोशिकाओं की resealing यांत्रिक घाव की मरम्मत करने के लिए बहुत समान गुण है कि पता चला. अधिक विस्तार से इस प्रक्रिया की जांच कर रही है, हम हाल ही में लाइसोसोम के सीए 2 + विनियमित एक्सोसाइटोसिस के अलावा, प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत एसिड sphingomyelinase (एएसएम) एंजाइम lysosomal की रिहाई से चालू होने और आवश्यक है, जो endocytosis की एक तेजी से फार्म, शामिल है कि सीखा न केवल वीं के लिएtransmembrane pores के ई हटाने, लेकिन यह भी यांत्रिक घाव 16 की मरम्मत के लिए.
ताकना गठन प्रोटीन के साथ permeabilization के बाद सेल resealing के कैनेटीक्स का निर्धारण करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला में हम लेजर घायल पृथक मांसपेशी फाइबर की 17 resealing का आकलन करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया था कि एक लाइव इमेजिंग पद्धति को रूपांतरित किया. यह परख stably प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि हो रही लिपिड bilayers के बाहरी पत्रक में intercalates जो lipophilic डाई FM1-43, के गुणों पर निर्भर करता है. प्लाज्मा झिल्ली bilayer प्लाज्मा झिल्ली चोट का पता लगाने और 18,16,19,20 की मरम्मत के लिए एक संवेदनशील परख प्रदान करने, intracellular झिल्ली को बाह्य डाई लाभ का उपयोग बाधित है. ताकना गठन प्रोटीन के साथ permeabilization के बाद सेल resealing के आकलन के लिए इस परख अनुकूलन करने के लिए, हम झिल्ली कोलेस्ट्रॉल 21 को बांधता है, जो जीवाणु विष streptolysin हे (SLO), के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं पूर्व incubated. तुल्यकालिक सेलpermeabilization तो आसानी से ताकना गठन transmembrane की ओर जाता है कि रचना में oligomerization और बदलाव को सक्रिय करता है जो एक गर्म खुर्दबीन मंच, मध्यम गर्म करने के लिए बर्फ से कोशिकाओं को ले जाकर प्राप्त किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण का एक लाभ यह लेजर लोग घायल हो गए का उपयोग पहले प्रकाशित assays से अधिक, कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या सेल की आबादी का बेहतर नमूना उपलब्ध कराने, एक सूक्ष्म क्षेत्र में एक साथ विश्लेषण किया जा सकता है. ताकना के गठन विषाक्त पदार्थों के साथ यांत्रिक चोट और permeabilization के बाद देखा सेल resealing प्रक्रिया के बीच यंत्रवत समानता को देखते हुए, हम यहाँ वर्णन परख प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत की मौलिक प्रक्रिया में शामिल घटकों विदारक के लिए एक बहुत बहुमुखी और शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है. एक उदाहरण के रूप में, हम यह सुधार प्रक्रिया के सीए 2 + निर्भर और स्वतंत्र चरणों की पहचान करने के लिए इस परख का उपयोग संभव है कि दिखा.
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Protocol
1. एएसएम के transcriptional मुंह बंद
- बीज 1.5 x 10 DMEM विकास मीडिया के 2 मिलीलीटर में 5 HELA कोशिकाओं 35 मिमी गिलास नीचे व्यंजन पर (MatTek) (DMEM उच्च 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी एल glutamine, 1% पेन-Strep साथ ग्लूकोज) और एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं.
- अगले दिन, विकास मीडिया बंद महाप्राण और siRNA अभिकर्मक मिश्रण जोड़ने से पहले 2 मिलीलीटर DMEM कम सीरम मध्यम (4% FBS के साथ DMEM), कम से कम 1 घंटा के साथ बदलें.
- SiRNA oligo अभिकर्मक मिश्रण के लिए 4 ट्यूबों तैयार. ट्यूब ए और सी में ट्रांसफ़ेक्ट हो 35 मिमी पकवान प्रति, 250 μl Optimem कम सीरम और 4 μl Lipofectamine RNAiMax जोड़ें. ट्यूब में बी, Optimem के 250 μl ट्रांसफ़ेक्ट हो 35 मिमी पकवान प्रति, नियंत्रण मध्यम जीसी सामग्री oligo (नियंत्रण siRNA) के सीरम और 8 μl (160 pmoles) कम जोड़ें. ट्यूब डी में जोड़ने Optimem के 250 μl 35 मिमी पकवान टी प्रति, SMPD1 oligo (siASM) के सीरम और 8 μl (160 pmoles) कमओ ट्रांसफ़ेक्ट किया. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब सेते हैं.
- अभिकर्मक नियंत्रण siRNA के लिए जटिल है, और एएसएम siRNA के लिए ट्यूब सी और डी के लिए फार्म ट्यूब ए और बी का मिश्रण. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रियाओं सेते हैं.
- संबंधित 35 मिमी गिलास नीचे बर्तन में नियंत्रण siRNA और एएसएम siRNA अभिकर्मक प्रतिक्रिया धीरे धीरे मिश्रण, dropwise, जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर सेते हैं. 24 घंटा बाद अभिकर्मक पर, धीरे मीडिया से दूर aspirate और ताजा DMEM विकास मीडिया के साथ की जगह. कुशल एएसएम पछाड़ना के लिए, व्यंजन आगे रहते इमेजिंग से पहले के बारे में 31 घंटे (कुल 55 घंटा) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर incubated किया जाना चाहिए.
2. लाइव माइक्रोस्कोपी के लिए अभिकर्मकों की तैयारी
- सीए 2 + और 2 मिलीग्राम + बिना ठंड 1x पीबीएस में 100 एनजी / μl की एकाग्रता में पुनः संयोजक ताकना के गठन विष Streptolysin हे (SLO) का एक समाधान तैयार करें. इन assays में इस्तेमाल SLO एक constitutivel हैकृपया डॉ. रॉड Tweten, ओकलाहोमा विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान की गतिविधि के लिए एजेंटों को कम करने की आवश्यकता नहीं है कि y सक्रिय सिस्टीन उत्परिवर्ती,. विष ई. में व्यक्त की गई थी कोली BL21 DE3 और पहले 16 में वर्णित के रूप में, देशी परिस्थितियों में शुद्ध किया.
- FM1-43 शेयर समाधान तैयार: DMSO में Resuspend FM1-43 lyophilized पाउडर एक 25 मिमी समाधान बनाने के लिए.
- समाधान एक तैयार: 4 माइक्रोन (1.5 मिलीलीटर MatTek पकवान प्रति की जरूरत है) की अंतिम एकाग्रता के लिए सीए 2 + के साथ ठंड DMEM में FM1-43 शेयर समाधान पतला और जब तक जरूरत बर्फ पर दुकान.
- समाधान बी तैयार: 4 माइक्रोन (MatTek पकवान प्रति जरूरत 1.5 एमएल) की एक अंतिम एकाग्रता के लिए सीए 2 + और 10 मिमी EGTA (सीए 2 + मुक्त DMEM) के बिना ठंड DMEM में FM1-43 शेयर समाधान पतला और जब तक बर्फ पर स्टोर जरूरत.
- पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) Eppendorf ट्यूबों में समाधान एक और समाधान बी के 1 मिलीलीटर aliquots.
- सीए 2 +, और सी के साथ DMEM के बर्फ समाधान पर रखें2 + मुक्त DMEM.
3. FM1-43 इलाज SLO में बाढ़ और अनुपचारित कोशिकाओं का लाइव सेल इमेजिंग
- , कुचल बर्फ के साथ एक मध्यम आकार उथले धातु कंटेनर भरें बर्फ के साथ एक बड़ा ग्लास कंटेनर में यह पलटना, और उजागर धातु के कंटेनर के केवल नीचे की सतह छोड़ने अतिरिक्त बर्फ जोड़ें. यहां तक कि थर्मल हस्तांतरण के लिए अनुमति देने के लिए उजागर धातु तल पर एक गीला कागज तौलिया रखें.
- एक नियंत्रण siRNA इलाज MatTek पकवान (1 नमूना) ले लो और ठंड गीला कागज तौलिया पर जगह है. धीरे सभी मीडिया बंद aspirate और ठंड सीए 2 + मुक्त DMEM के साथ 3x धो लो. पिछले धोने के बाद, पकवान में सभी मीडिया बंद aspirate.
- करने के लिए छवि सेल जुड़े FM1-43 कोई SLO लोग घायल हो गए 2 सीए की उपस्थिति में (1 नमूना) के साथ कोशिकाओं में +, 35 मिमी गिलास नीचे डिश के केंद्र गिलास coverslip को ठंड समाधान बी के 180 μl जोड़ने और 5 के लिए सेते मिनट बर्फ पर (1 टेबल). 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म और (तापमान, आर्द्रता और सीओ 2 का स्तर बनाए रखता है) एक पर्यावरण कक्ष के साथ सुसज्जित एक confocal खुर्दबीन के मंच पर MatTek पकवान. एक 40X NA 1.3 उद्देश्य (Nikon) के माध्यम से देख imaged किया जाएगा कि कोशिकाओं के क्षेत्र का पता लगाएं. यदि उपलब्ध हो, थर्मल बहाव के लिए सही करने के लिए PerfectFocus या इसी तरह के एक उपकरण चालू करें.
- धीरे 35 मिमी पकवान की ओर करने के लिए prewarmed समाधान एक के 1 मिलीलीटर जोड़ें और पर्यावरण कक्ष (तालिका 1) के कवर की जगह.
- (UltraView स्वर Perkin एल्मर कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी प्रणाली में Volocity) उपयुक्त इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग हर 3 सेकंड 1 फ्रेम में 4 मिनट के लिए छवियों मोल. FM1-43 की उत्तेजना एक 488 एनएम बैंड पास से एक dichroic फिल्टर का उपयोग कर एक 488 एनएम लेजर लाइन के साथ पूरा किया है, और उत्सर्जन भेदभाव एक 527 (W55) उत्सर्जन फिल्टर के उपयोग के माध्यम से हासिल की है. लेजर सत्ता के स्तर और कैमरा संवेदनशीलता 100 मिसे की छवि जोखिम को प्राप्त करने के लिए सेट कर रहे हैं.
- दोहराएँ 3.2-3.6 कि 3.5 कदम समाधान बी में (तालिका 1) के साथ जोड़ा जाना चाहिए, सिवाय सीए 2 + के अभाव में कोई SLO लोग घायल हो गए (नमूना 2) के साथ नियंत्रण siRNA इलाज कोशिकाओं में FM1-43 का पता लगाने के लिए कदम.
- उपस्थिति (3 नमूना) या सीए 2 + की अनुपस्थिति (नमूना 4), के केंद्र गिलास coverslip को SLO युक्त ठंड समाधान बी के 180 μl जोड़ने में या तो SLO से घायल नियंत्रण siRNA इलाज कोशिकाओं में FM1-43 बाढ़ को मापने के लिए 35 मिमी गिलास नीचे पकवान और 3.3 कदम के रूप में बर्फ पर 5 मिनट के लिए सेते हैं. दोहराएँ 3.6 के माध्यम से 3.2 कदमों; 3.5 कदम (1 टेबल) पर समाधान एक या समाधान बी या तो जोड़ने समायोजित करें.
- प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत में एएसएम की भूमिका निर्धारित करने के लिए, दोहराने सभी शर्तों (नमूने 5-8) (तालिका 1) के लिए एएसएम siRNA इलाज कोशिकाओं का उपयोग 3.2-3.6 कदम.
- पर कोशिकी पुनः संयोजक sphingomyelinase (एस) की भूमिका निर्धारित करने के लिए(FM1-43 बाढ़ में अवरोध से परिलक्षित) प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत के कैनेटीक्स (नमूने 9-10), एसएम गयी 3.5 चरण में (0-50 μU) का समाधान एक या समाधान बी और फिर जीवित कोशिका के दौरान कोशिकाओं को जोड़ा जाता है 1 मिलीलीटर (1 टेबल) की कुल मात्रा में इमेजिंग.
4. कोशिकाओं में FM1-43 बाढ़ की मात्रा का ठहराव
- फिल्मों का अधिग्रहण किए जाने के बाद, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (Volocity सुइट, PerkinElmer) का उपयोग FM1-43 के intracellular प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने. क्षेत्र में प्रत्येक कक्ष के साइटोसोलिक क्षेत्र में ब्याज की एक क्षेत्र ड्रा और वीडियो के सभी तख्ते भर मतलब FM1-43 प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण करने के लिए सॉफ्टवेयर उपकरण लागू होते हैं.
- प्रारंभिक FM1-43 धुंधला में बदलाव के लिए समायोजित करने के लिए, प्रत्येक वीडियो के लिए डेटा समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता में गुना वृद्धि के रूप में व्यक्त किया है, और एक अलग हालत के लिए साजिश रची है. प्रति प्रत्येक व्यक्ति timepoint के प्रतिदीप्ति में गुना वृद्धिसेल एफ टी विशिष्ट timepoint पर मतलब प्रतिदीप्ति है जहां एफ टी / एफ 0, के रूप में गणना, और एफ 0 टी 0 = (आंकड़े 1-2) पर मतलब प्रतिदीप्ति है.
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Representative Results
Lysosomal एसिड sphingomyelinase में समाप्त कोशिकाओं में बैक्टीरियल sphingomyelinase (एस) बचाव प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत की कम सांद्रता.
FM1-43 इमेजिंग परख का उपयोग करना, हम पहले से सीए 2 + की उपस्थिति में घायल हो गए lysosomal एंजाइम एएसएम के लिए की कमी और slo के संपर्क में कोशिकाओं एक प्लाज्मा झिल्ली दोष पुनः संयोजक मानव एंजाइम 19 के बाह्य इसके द्वारा बचाया जाता है पता चला है कि. मानव lysosomal एएसएम एक कम पीएच इष्टतम है के बाद से, हम resealing भी तटस्थ पीएच में पूरी तरह से सक्रिय है जो बेसिलस cereus (सिग्मा), से शुद्ध एस.एम. जोड़ने बहाल किया जा सकता है कि क्या जांच की. 2 सीए के अभाव में नियंत्रण siRNA या एएसएम siRNA oligos के साथ इलाज किया और slo के संपर्क में के रूप में पहले से पता चला, कोशिकाओं + (मरम्मत के लिए अनुमोदक नहीं शर्तों) समान रूप से है कि एएसएम कमी विष (चित्रा 1 ए को संवेदनशीलता के साथ हस्तक्षेप नहीं करता दिखा, permeabilized गया ). दिलचस्प है, एक पूर्ण बचाव ओच SLO से संपर्क के बाद reseal करने एएसएम की कमी कोशिकाओं की क्षमता कम एसएम, 5 की सांद्रता और 7.5 μU / एमएल (चित्रा 1 बी) के साथ मनाया गया. के माध्यम से जोड़ा एंजाइम एकाग्रता में वृद्धि हुई, बचाव phenotype में एक क्रमिक नुकसान था - 10 μU / एमएल के संपर्क में कोशिकाओं केवल आंशिक रूप से SLO से संपर्क के बाद FM1-43 की आमद अवरुद्ध है, और 50 μU / एमएल के संपर्क में कोशिकाओं से पता चला एएसएम समाप्त कोशिकाओं (आंकड़े 1 बी और 1 सी) में मनाया समान एक पूर्ण resealing दोष दर्शाती एक मजबूत डाई तांता पैटर्न,. प्रक्रिया सामान्य रूप से उत्पन्न नहीं होती है एक निश्चित स्तर से ऊपर है, और कोशिकाओं घावों को दूर नहीं कर सकते हैं - यह परिणाम SLO की endocytic हटाने कसकर एसएम द्वारा प्लाज्मा झिल्ली में उत्पन्न ceramide स्तर से नियंत्रित किया जाता है pores कि पता चलता है.
Sphingomyelinase अलावा प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत में सीए 2 + के लिए आवश्यकता नजरअंदाज.
बैक्टीरियल एस की उल्लेखनीय है, इसके अलावासीए 2 + भी बचाया प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत (सेल resealing की अनुमति नहीं है कि सामान्य रूप से एक शर्त) के अभाव में SLO से permeabilized कोशिकाओं को एम. + (आंकड़े 1 बी और 1 सी), एस एम की ही कम मात्रा FM1-43 की आमद रोकने में प्रभावी रहे थे 2 सीए की उपस्थिति में ताकना के गठन विष के संपर्क में कोशिकाओं के रूप में देखा (2A चित्रा और 2 बी). इन परिणामों से संकेत मिलता है कि प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत की सीए 2 + निर्भर कदम के बहाव sphingomyelinase कार्य करता है. यह निष्कर्ष लाइसोसोम और एएसएम रिहाई के एक्सोसाइटोसिस चलाता सीए 2 + transmembrane छिद्रों के माध्यम से बह तत्वों कि जो हमारे पहले से प्रस्तावित मॉडल, के साथ पूरी तरह से संगत है, जो प्लाज्मा झिल्ली की बाहरी पत्रक, पैदा ceramide और endocytosis 22 से बढ़ावा देने ताकना हटाने पर cleaves sphingomyelin , 19. शुद्ध एसएम के अलावा सीए 2 + जोरदार सुदृढ़ के लिए की जरूरत को नजरअंदाज तथ्य यह है किशारीरिक शर्तों के तहत सीए लाइसोसोम के 2 + विनियमित एक्सोसाइटोसिस endocytosis को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक sphingomyelinase गतिविधि का स्रोत है कि देखने.
चित्रा 1. बेसिलस cereus sphingomyelinase (एस) ताकना के गठन विष streptolysin हे (SLO). नियंत्रण siRNA या एएसएम siRNA के साथ इलाज HELA कोशिकाओं oligos से घायल एसिड sphingomyelinase (एएसएम) की अभिव्यक्ति के लिए खामोश कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत दोष पूरक कर सकते हैं सीए 2 + और FM1-43 4 मिनट के लिए 1 फ्रेम / 3 सेकंड में उतारी थी lipophilic डाई की आमद की अनुपस्थिति या उपस्थिति में घायल हो गए थे. FM1-43 intracellular प्रतिदीप्ति Volocity सॉफ्टवेयर का उपयोग मात्रा और समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता में गुना वृद्धि के रूप में व्यक्त की गई थी. (ए) में सीए 2 + का अभाव, नियंत्रण siRNA और एएसएम siRNA इलाज कोशिकाओं दोनों SLO से permeabilized थे. 18-27 कोशिकाओं हर हालत में विश्लेषण किया गया;. त्रुटि सलाखों मतलब + / के अनुरूप - सीए 2 + की उपस्थिति में SEM (बी), नियंत्रण siRNA के साथ इलाज किया कोशिकाओं, उनकी प्लाज्मा झिल्ली reseal और बाढ़ डाई को रोकने में सक्षम थे, जबकि एएसएम siRNA साथ इलाज किया कोशिकाओं reseal करने में विफल रहा. इसके अतिरिक्त सीए 2 + की उपस्थिति में, sphingomyelinase की कम खुराक की एक्सोजेनस अलावा एएसएम siRNA इलाज कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली दोष पूरक. 18-62 कोशिकाओं हर हालत में विश्लेषण किया गया, त्रुटि सलाखों मतलब + / के अनुरूप - SEM (सी) बी में विश्लेषण फिल्म के समय फ्रेम चयनित.. बार्स, 9 माइक्रोन. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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चित्रा 2. Sphingomyelinase अलावा. नियंत्रण siRNA के साथ इलाज HELA कोशिकाओं 2 + और lipophilic डाई FM1-43 की आमद 4 के लिए 1 फ्रेम / 3 सेकंड में उतारी थी सीए की अनुपस्थिति में SLO से घायल हो गए प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत में सीए 2 + के लिए आवश्यकता नजरअंदाज मि. FM1-43 intracellular प्रतिदीप्ति Volocity सॉफ्टवेयर का उपयोग मात्रा और समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता में गुना वृद्धि के रूप में व्यक्त किया. (ए) प्लाज्मा झिल्ली की कमी आम तौर पर सीए की अनुपस्थिति में SLO से घायल कोशिकाओं में देखा resealing गया था 2 + एक्सोजेनस अलावा द्वारा उलट है sphingomyelinase की की खुराक कम. 18-31 कोशिकाओं हर हालत में विश्लेषण किया गया, त्रुटि सलाखों मतलब + / के अनुरूप - SEM (बी) के एक विश्लेषण में फिल्म के समय फ्रेम चयनित.. बार्स, 9 माइक्रोन.g2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. प्रक्रिया में शामिल प्रयोगात्मक चरणों के लिए प्रक्रिया समय. समय. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
| सीए 2 + हालत | सीए 2 + मुक्त हालत | SLO विष | गर्म समाधान एक | गर्म समाधान बी | Sphingomyelinase | कदम प्रक्रिया |
| + | - | - | + | - | - | 3.2 |
| - | + | - | - | + | - | 3.7 |
| + | - | + | + | - | - | 3.8 |
| - | + | + | - | + | - | 3.8 |
| + | - | - | + | - | - | 3.9 |
| - | + | - | - | + | - | 3.9 |
| + | - | + | + | - | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | + | 3.10 |
| + | - | + | + | - | + | 3.10 |
तालिका 1. प्रक्रिया में वर्णित के रूप में प्रयोगात्मक प्रक्रिया में इस्तेमाल किया समाधान की संरचना है. नमूने पंक्तियों में सूचीबद्ध हैं. नामित घटक (oligo, सीए 2 + या सीए 2 + मुक्त मध्यम, SLO, समाधान एक या बी, sphingomyelinase) का (-) कॉलम उपस्थिति (+) या अनुपस्थिति निरूपित. इन नमूनों पहली प्रक्रिया धारा 3 में लाइव सेल इमेजिंग के लिए उपयोग किया जाता है, जिसमें प्रायोगिक कदमों संकेत कर रहे हैं.
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Discussion
यांत्रिक चोट और प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत पर पहले के अध्ययनों कांच के मोती, micropipetting, बाल काटना, scratching या scraping छोड़ने से लेकर, घायल कोशिकाओं के विभिन्न तंत्र पर भरोसा किया. इन सभी assays के readout के बजाय मात्रात्मक से गुणात्मक था, और मरम्मत तंत्र के कैनेटीक्स पर सटीक जानकारी नहीं दी. चोट के इन रूपों के बाद उनकी प्लाज्मा झिल्ली reseal कोशिकाओं की क्षमता झिल्ली अभेद्य रंजक, साइटोसोलिक एंजाइम, एटीपी के स्तर, या लंबी अवधि के नुकसान की कोशिका द्रव्य, प्रवेश में बाह्य तरल पदार्थ में जोड़ा tracers की उपस्थिति या अनुपस्थिति से मापा गया था सेलुलर अस्तित्व. इन assays के कई मात्रात्मक प्रदर्शन किया जा सकता है तेजी से एकल कोशिका के स्तर पर resealing के कैनेटीक्स का आकलन है, जबकि इन अध्ययनों में एक प्रमुख बाधा है, घायल हो गए घटना को सिंक्रनाइज़ करने में कठिनाई था.
मांसपेशी फाइबर की यूवी लेजर चोट के विकास और उपयोग में follolipophilic डाई FM1-43 की आमद का पता लगाने के द्वारा शादी इन अध्ययनों 17,20 में एक प्रमुख अग्रिम था. इसके बजाय scraping या चोट के समान यांत्रिक तरीकों से पूरे सेल की आबादी के लिए प्रवृत्त सकल नुकसान का, इन assays एकल कक्ष विश्लेषण की अनुमति दी है कि कोशिकाओं के घाव के लिए एक अधिक परिभाषित रास्ते की शुरुआत की. हालांकि, कई समस्याओं ऐसे assays में बने रहे. लेजर प्रेरित घावों के आकार शारीरिक शर्तों के दौरान होने वाले झिल्ली चोट के रूपों की तुलना में बड़ा है और काफी चर लेजर तीव्रता पर निर्भर करता है, और प्रकृति में बहुत अलग है. एक अन्य समस्या यह केवल एक सेल या मांसपेशी फाइबर का पालन किया जा सकता है कि घटनाओं resealing की संख्या को कम करने, माइक्रोस्कोप से जुड़े लेसरों का उपयोग कर एक बार में घायल, और इस तरह के परिणामों के सांख्यिकीय महत्व किया जा सकता है. Reproducibility और नमूने के साथ इन समस्याओं को काफी प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत के तंत्र की जांच करने के लिए एक विधि के रूप में लेजर चोट की उपयोगिता कम कर दिया.
टीहे इन मुद्दों का समाधान, हम ठीक जीवाणु ताकना के गठन विषाक्त पदार्थों की वजह से प्लाज्मा झिल्ली घावों की मरम्मत कैनेटीक्स को मापने के लिए एक नया सेल रहते इमेजिंग परख विकसित की है. यह कई रोगाणुओं कोशिकाओं की झिल्ली permeabilizing में सक्षम हैं कि कई विषाक्त पदार्थों के अधिकारी है, क्योंकि प्रकृति में अक्सर होता है कि चोट का एक रूप है. तापमान ताकना गठन को गति प्रदान करने के लिए बढ़ जाती है के रूप में यह परख ठीक, कम तापमान पर विष के साथ कोशिकाओं पूर्व incubating द्वारा सिंक्रनाइज़, और एक सूक्ष्म क्षेत्र में कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या FM1-43 की आमद के लिए विश्लेषण किया जा करने की अनुमति देता हो सकता है.
इस परख के साथ प्राप्त ताकना गठन की सटीक तुल्यकालन सूक्ष्म क्षेत्र के भीतर कई व्यक्ति की कोशिकाओं में एक साथ quantitated किया जा सकता है जो प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत कैनेटीक्स, की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप की अनुमति देता है. इन assays में एक महत्वपूर्ण तकनीकी पहलू इमेजिंग के लिए प्रयोग की जाने वाली खुर्दबीन उद्देश्य लेंस की गुणवत्ता है. टीहमारे assays में इस्तेमाल किया वह 40X NA 1.3 (Nikon) उद्देश्य छवि संकल्प को खोने के बिना एक जनसंख्या में कोशिकाओं की एक पर्याप्त नमूना लेने के लिए अनुमति देता है. एक 10X उद्देश्य को स्विचिंग सेल की आबादी का एक बड़ा नमूना अनुमति है, लेकिन हासिल की है कि संकल्प intracellular FM1-43 की उचित मात्रा का ठहराव के लिए अपर्याप्त है होगा. इस लाइव सेल इमेजिंग परख के लिए एक महत्वपूर्ण कदम थर्मल बहाव के लिए सही करने के लिए PerfectFocus या एक इसी तरह के उपकरण का उपयोग है. हमारी प्रक्रिया बर्फ पर कोशिकाओं के लिए जीवाणु ताकना के गठन विष के पूर्व बाध्यकारी और फिर जीना सेल इमेजिंग के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए जल्दी से तापमान स्थानांतरण की आवश्यकता है. इस तापमान समायोजन छवि अधिग्रहण की अवधि के दौरान अक्षीय फोकस उतार चढ़ाव के कारण होगा, और सही किया जाना चाहिए. PerfectFocus या इसी तरह की एक युक्ति इस प्रकार प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत कैनेटीक्स की सटीक मात्रा का ठहराव की अनुमति, समय की विस्तारित अवधि के ऊपर एक चयनित फोकल हवाई जहाज़ का जीना सेल इमेजिंग की अनुमति इस समस्या को ठीक कर देंगे.
करने के लिए एक प्रमुखइस परख की सफलता इस का इस्तेमाल विष के प्रत्येक बैच के लिए भिन्न हो सकते हैं के बाद से हमेशा अनुमापांक पूर्व गठन विष के विभिन्न सांद्रता, मरम्मत योग्य और गैर मरम्मत खुराक निर्धारित करने के लिए है. विशेष रूप से कई विषाक्त पदार्थों की गतिविधि, और slo की, चक्र अपनी गतिविधि के लिए हानिकारक हैं फ्रीज thaws तापमान संवेदनशील और कई है. हालांकि, प्रत्येक प्रयोग में साथ प्रदर्शन titrations सही विष खुराक ठीक समय चूक इमेजिंग के कुछ ही मिनट में निर्धारित करने की अनुमति दे.
यह परख प्लाज्मा झिल्ली की चोट के बाद पर्याप्त intracellular FM1-43 प्रतिदीप्ति का पता लगाने पर निर्भर करता है. यह कुछ शर्तों के तहत सीमित किया जा सकता है. झिल्ली SLO रूपों में डालने के बाद मजबूत सीए 2 + बाढ़ और कोशिकाओं में तेजी से प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत प्रतिक्रिया के लिए अनुमति देता है, के बारे में 30 एनएम के एक व्यास के साथ pores. हालांकि, के बारे में ताकना व्यास है कि इस तरह के aerolysin और lysenin के रूप में छोटे घावों, कि फार्म विषाक्त पदार्थों ताकना गठनवे अपर्याप्त सीए 2 + और FM1-43 बाढ़ में परिणाम मई के बाद से 1-3 एनएम 23-25 इस परख के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता.
यहां तक कि ऐसे SLO के रूप में बड़े pores उत्पन्न एक विष का उपयोग कर, यह इस इमेजिंग परख प्रतिदीप्ति तीव्रता का पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देते हैं, बल्कि रिश्तेदार प्रतिदीप्ति नहीं है कि मन में रखने के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, यह इमेजिंग डिजिटल कैमरा के intrascene गतिशील सीमा के भीतर किया जाता है कि महत्वपूर्ण है. प्रतिदीप्ति तीव्रता लेजर बिजली, जोखिम समय, और कैमरे के लाभ से प्रभावित है, यह मरम्मत और गैर दोनों में FM1-43 और slo के साथ इलाज किया कोशिकाओं की प्रारंभिक इमेजिंग प्रदर्शन से, प्रत्येक प्रयोग की शुरुआत में इन तीन मानकों सेट करने के लिए महत्वपूर्ण है मरम्मत शर्तों (सीए 2 + या सीए 2 + मुक्त माध्यम). यह अनुमति देता है बार शून्य पर प्रतिदीप्ति पता लगाने की अनुमति (SLO अलावा पहले), लेकिन (डिटेक्टर संतृप्ति में परिणाम नहीं है कि छवि अधिग्रहण सेटिंग्स का चुनाव determ के रूप मेंगैर मरम्मत की शर्तों के तहत अधिग्रहण के अंत में सॉफ्टवेयर readout) द्वारा ined.
इस परख का उपयोग करना, हम SLO pores इस प्रक्रिया यांत्रिक घाव 16 की मरम्मत करने के लिए इसी तरह की एक तेजी से कैनेटीक्स है, प्रदर्शन है कि कम से कम 30 सेकंड में स्तनधारी कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली से हटा रहे हैं कि प्रदर्शन कर रहे थे. बाद के अध्ययन lysosomal एंजाइम एएसएम प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत के लिए आवश्यक है, और एएसएम की कमी कोशिकाओं से 19 extracellularly गयी जब resealing बहाल करने में सक्षम है पता चला है. अध्ययन में मौजूद है, हम पहली बार के लिए, कि प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत भी बाह्य सीए 2 + के अभाव में हो सकता है, यह दिखाने के लिए FM1-43 तांता परख की संवेदनशीलता का फायदा उठाया. पुनः संयोजक sphingomyelinase को घायल कोशिकाओं का एक्सपोजर सीए 2 + मुक्त मध्यम, प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत के लिए सामान्य रूप से अनुमोदक नहीं एक हालत में SLO से permeabilized कोशिकाओं में resealing बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त था. दिलचस्प है, compleप्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत की क्षमता का विचार - प्रक्रिया प्लाज्मा झिल्ली की बाहरी पत्रक पर इस एंजाइम द्वारा उत्पन्न ceramide की राशि घाव को हटाने की प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है, सुझाव है कि sphingomyelinase की उच्च सांद्रता के प्रदर्शन के बाद नहीं देखा गया. यह निष्कर्ष सीए 2 + lysosomal एक्सोसाइटोसिस कदम को गति प्रदान करने के लिए आवश्यक है कि यह दर्शाता है, लेकिन घाव internalization के लिए जिम्मेदार है कि sphingomyelinase प्रेरित endocytosis के लिए आवश्यक नहीं है.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.
Acknowledgments
यह काम हम SLO प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के लिए ओकलाहोमा के विश्वविद्यालय से डॉ. आर Tweten धन्यवाद NWA के लिए एनआईएच अनुदान R37 AI34867 और R01 GM064625 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
| FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
| Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
| Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
| SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
| Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
| Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
| 35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
| Material | |||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
| Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
| Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
| Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber | |
References
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