Summary
Lipofilik boya FM1-43 maruz kalan hücrelerin canlı görüntüleme gözenek oluşturucu toksinler plazma membran kaldırılır hangi kinetiği tam belirlenmesini sağlar. Bu Ca 2 + gereksinimleri, sfingomiyelinaz ve plazma membranı onarım diğer faktörler değerlendirmek için kullanılabilecek bir hassas bir deneydir.
Abstract
Plazma zarı yaralanması sık görülen bir olaydır, ve yaralar hızla hücresel hayatta kalmasını sağlamak için tamir edilmesi gerekir. Ca 2 + akını ~ 30 saniye içinde, plazma zarı üzerinde mekanik yaraların onarım tetikleyen anahtar bir sinyal bir olaydır. Son çalışmalar, memeli hücreleri aynı zamanda gözenek endositoz ardından lizozomal enzim asit sfingomiyelinaz ekzositozu içeren bir Ca2 +-bağlı işlemde toksinler oluşturan geçirgenleştirmeden sonra plazma zarı kapatın olduğunu ortaya koydu. Burada, söz konusu toksin streptolizin O ile geçirgen hücrelerin tekrar kapatılmasına Ca2 + akışı üzerinde de hızlı ve bağımlı olduğunu göstermek için kullanılan bir yöntem tarif eder. Deney tasarımı sağlar: yaralanma olayı senkronizasyon ve görüntüleme ile, plazma membran bütünlüğünü ve lipofilik boya FM1-43 hücre zarları ile ulaştığı ölçüde miktarının hücrelerin yeteneği kesin bir kinetik ölçümü. Bu canlı tahlil also Eksojen yeteneği hassas bir değerlendirmesi plazma membran onarım hücrelerinin yeteneğini yansıtan FM1-43 akışını engellemek için bu tür sfingomiyelinaz gibi çözülebilir faktörler ilave sağlar. Bu deney, bize, enzimin eklenmesi hücre dışı Ca2 + yokluğunda permeabilize hücrelerin doğru bağlantı teşvik tarihi sfingomiyelinaz, Ca2 +-bağımlı Ekzositoz aşağı hareket ilk kez göstermektedir bırakıldı.
Introduction
Bu mekanik yaralanma sonrası plazma zarı tamir bir Ca2 +-bağımlı bir işlem 1,2 olduğu yıllardır bilinmektedir. Daha sonraki çalışmalarda yara yoluyla Ca 2 + 3,4 akışı yeniden kapatılması için gerekli olan yaralanma yerinde okuyun, hücre içi veziküller ekzositozu bir güçlü işlemi tetikler gösterdi. Hücrelerin sitoplazması içine yüklenmiş bir floresan boya kaybı oranı tamir hızını değerlendirmek için kullanılır, ve yeniden mühürleme yaralanma sonrası 5 <30 sn içinde tamamlanmıştır sonucuna varılmıştır. İki model başlangıçta plazma zarı tamir ekzositozu için gereksinimi açıklamak için önerilmiştir: lezyonu boyunca Ca 2 + akını geniş bir "yama" oluşturan, hücre içi veziküllerin başlangıçta homotipik füzyon tetikler önerdi 1) "yama" modeli, bu olur daha sonra yara 6 ve zar adde önerilen 2) gerilim azaltma modeli tekrar kapatılması için, plazma zarına uygulanmasıyaranın çevresinde Ca 2 +-bağımlı Ekzositoz tarafından d çift-katlı 7 doğru bağlantı kolaylaştıran, plazma zarı gerilimi azaltacaktır. Plazma membranı tamir Ca 2 + tetiklenen Ekzositoz rolü ayrıca lizozomlar yaralı hücrelerindeki eksositosizini ve plazma membranı onarım kolaylaştıran bir Ca 2 + sensor molekülü, synaptotagmin VII, içerdiğini gösteren çalışmalar ile takviye edilmiş 8,9,10,11 .
Ancak, ek delil yalnız ekzositozu plazma zarı tamir teşvik için yeterli olmadığını belirtti. Plazma membranı üzerinde mekanik gözyaşı ek olarak, hücre hasarı sık rastlanan bir şekilde bakteri 12,13 veya 14,15 bağışıklık hücreleri tarafından üretilen gözenek oluşturucu toksinler tarafından permeabilizasyon olduğunu. Mekanik gözyaşı farklı olarak, gözenek oluşturucu proteinler, plazma membranı, bir membran "yama" uygulanarak veya reduc basitçe kapatılmalı edilemez bir kararlı, protein kaplı gözenek oluşturucu kendilerini eklemekmembran gerilimi ing. İlgi çekici çalışmalar memeli hücreleri gözenek oluşturucu proteinler ile geçirgenleştirmeden sonra plazma membran onarım için etkili bir mekanizma var, bu işlem, aynı zamanda, hücre dışı Ca2 +, 12 mevcudiyetini gerektirdiğini gösterdi. Mekanik yaralar 5 ile gözlemlediği gibi, bu bulgu, hücre yüzeyinde zar gözenek kaldırılması da hızlı bir süreç olup olmadığı sorusunu gündeme. Işlem Ca 2 + hücre dışı gerektirir ve ~ 30 saniye içinde tamamlanır: Şaşırtıcı bir şekilde, bizim son çalışmalar, gözenek oluşturucu toksinlerle permeabilize hücrelerin tekrar kapatılmasına mekanik deliklerinin onarımında çok benzer özelliklere sahip olduğunu ortaya koydu. Daha ayrıntılı olarak, bu işlem incelenmesi, son zamanlarda lizozomların Ca2 + ile düzenlenen Ekzositoz ek olarak, plazma zarı tamir asit sfingomiyelinaz (ASM), lisosomal enzim salınması tarafından tetiklenen ve esastır endositoz hızlı bir form içerir öğrendik sadece thzar gözeneklerinin e çıkarılması değil, aynı zamanda mekanik yaralar 16 tamiri için.
Gözenek oluşturucu proteinler ile geçirgenleştirmeden sonra hücre yeniden birleştirilmesine kinetiklerini belirlemek için laboratuarımızda biz lazer yaralı izole kas liflerinin 17 doğru bağlantı değerlendirmek için daha önce kullanılmış olan bir canlı görüntüleme yöntemi uyarlanmıştır. Bu deney, stabil şekilde floresan yoğunluğunda artan lipid iki katmanlı dış sayfada içine intercalates lipofilik boya FM1-43, özelliklerine dayanır. Plazma membranı iki tabakalı plazma zarı hasarı tespit etmek ve 18,16,19,20 onarmak için hassas bir tahlil sağlayarak, hücre içi membranlara hücre dışı boya erişir bozulduğu zaman. Gözenek oluşturucu proteinler ile geçirgenleştirmeden sonra hücre yeniden birleştirilmesine değerlendirilmesi için bu tahlil uyarlamak için, membran kolesterolünün 21 bağlanan bakteriyel toksin streptolizin O (SLO) ile 4 ° C'de hücreler önceden inkübe edilmiştir. Senkron hücrepermeabilizasyon sonra kolayca gözenek oluşumuna neden transmembran konformasyonda oligomerizasyonu ve değişim aktive ısıtılmış bir mikroskop aşamasında, orta ısınmaya buz hücreleri hareket ile elde edilebilir. Bu yaklaşımın bir avantajı, lazer yaralama ile daha önce yayınlanmış çalışmalar boyunca, daha büyük bir hücre sayısı, hücre popülasyonunun daha iyi örnekleme sağlayan, mikroskobik alan eş zamanlı olarak analiz edilebilir olmasıdır. Gözenek oluşturucu toksinler ile mekanik yaralanma ve geçirgenleştirmeden sonra görülen hücre mühürleme işlemi arasındaki mekanik benzerlikler göz önüne alındığında, biz burada açıklamak tahlil plazma zarı onarım temel sürecine dahil faktörleri diseksiyon için çok yönlü ve güçlü bir yöntem sağlar. Bir örnek olarak, bu onarım sürecinin Ca 2 + bağımlı ve bağımsız adımları belirlemek için bu tahlil kullanmak mümkün olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. ASM Transkripsiyonal suskunluğu
- Tohum 1.5 x 10 DMEM büyüme ortamı içinde 2 ml 5 HeLa hücreleri, 35 mm 'lik cam taban yemekler (MatTek) (DMEM yüksek,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin,% 1 Penn-Strep ile glikoz) ve % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
- Ertesi gün, büyüme ortamı aspire ve siRNA transfeksiyon karışımı ilave edilmeden önce 2 ml DMEM düşük serum ortamında (% 4 FBS DMEM), en az 1 saat ile değiştirin.
- SiRNA oligo transfeksiyon karışımı boyunca 4 tüpleri hazırlayın. Tüpler A ve C olarak, transfekte edilecek 35 mm tabak başına 250 ul Optimem indirgenmiş serumu ve 4 ul Lipofektamin RNAiMax ekleyin. Tüp B içinde, Optimem 250 ul transfekte edilecek 35 mm tabak başına, kontrol ortamı GC içeriği oligo (Kontrol siRNA) ve serum ve 8 ul (160 pmol), indirgenmiş ekleyin. Tüp D eklemek Optimem 250 ul 35 mm çanak t başına SMPD1 oligo (siASM) ait serum ve 8 ul (160 pmol) azaldıo transfekte edilebilir. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Transfeksiyon için kontrol siRNA kompleksi ve ASM siRNA tüpler C ve D tüpleri oluşturulması için A ve B bir araya getirin. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe reaksiyonları.
- Ilgili 35 mm cam alt yemekleri içine Kontrol siRNA ve ASM siRNA transfeksiyon reaksiyon yavaş yavaş karışımlarını, damla damla ekleyin ve 37 ° C /% 5 CO 2 inkübe. 24 saat sonrası transfeksiyon, hafifçe medya aspire ve taze DMEM büyüme medya ile değiştirin. Verimli ASM demonte için, yemekleri daha canlı görüntüleme önce yaklaşık 31 saat (toplam 55 saat) için 37 ° C /% 5 CO 2 inkübe edilmelidir.
2. Canlı Mikroskopi Ayıraçların hazırlanması
- Ca 2 + ve Mg2 + olmaksızın soğuk 1 x PBS içinde 100 ng / ul 'lik bir konsantrasyonda yeniden birleştirici gözenek oluşturucu toksin streptolizin O (SLO) içinde bir çözeltisi hazırlandı. Bu deneylerde kullanılan SLO bir constitutivel olduğukibarca Dr Rod Tweten, Oklahoma Üniversitesi tarafından sunulan aktivitesi için indirgeme maddeleri gerektirmeyen y aktif sistein mutant. Toksin E'de ifade edildi E. coli BL21 DE3 ve daha önce tarif edildiği gibi 16, yerel koşullar altında arıtıldı.
- FM1-43 stok solüsyonu hazırlayın: DMSO içinde süspanse FM1-43 liyofilize toz 25 mM çözüm oluşturmak için.
- Çözelti A hazırlayın: 4 uM (1.5 mi MatTek tabak başına gerekli olan) bir son konsantrasyona kadar Ca 2 + soğuk DMEM FM1-43 stok çözeltisi seyreltilir ve gerektiği kadar buz üzerinde depolanır.
- Çözelti B hazırlayın: 4 uM (MatTek tabak başına gerekli 1.5 mi) bir son konsantrasyona kadar Ca 2 + ve 10 mM EGTA (Ca 2 + içermeyen DMEM) olmadan soğuk DMEM FM1-43 stok çözelti sulandırarak kadar buz üzerinde saklamak gerekli.
- Pre-ılık (37 ° C) Eppendorf tüpleri içinde çözüm A ve Çözelti B'nin 1 ml'lik eş payları.
- Ca 2 + ve C ile DMEM buz çözümler tutun2 + içermeyen DMEM.
3. FM1-43 Tedavi SLO içine Akın ve Tedavi edilmeyen Hücreler Canlı Hücre Görüntüleme
- , Buz parçaları ile orta boy bir sığ metal kap doldurun buz ile büyük bir cam kap içine ters çevirin ve maruz kalan metal kabın, sadece alt yüzeyini terk ilave buz ilave edin. Hatta termal transfer izin vermek için açıkta kalan metal alt ıslak kağıt havlu yerleştirin.
- Bir kontrol siRNA tedavi MatTek çanak (Numune 1) alın ve soğuk ıslak kağıt havlu yerleştirin. Yavaşça tüm medya aspire ve soğuk Ca 2 + ücretsiz DMEM ile 3x yıkayın. Son yıkamadan sonra, çanak tüm medya aspire.
- To görüntü hücreye birleşik FM1-43 no SLO yaralama Ca 2 mevcudiyetinde (Örnek 1) ile hücrelerde +, 35 mm 'lik cam taban çanak merkez cam lamel soğuk Çözelti B'nin 180 ul ekleyin ve 5 için inkübe dakika buz üzerinde (Tablo 1). 37 ° C'ye kadar ısıtıldı ve (sıcaklık, nem ve CO2 seviyeleri muhafaza) bir çevre bölmesi ile donatılmış bir konfokal mikroskop sahnede MatTek çanak yerleştirin. 40X NA 1.3 objektif (Nikon) bakarak görüntülenmiş olacak hücre alanını bulun. Varsa, termal sürüklenme düzeltmek için PerfectFocus veya benzer bir cihaz üzerinde açın.
- Yavaşça 35 mm'lik çanak tarafına önceden ısıtılmış Çözüm A 1 ml ilave edilir ve çevre odası (Tablo 1) ve kapağı yerine takın.
- (Ultraview Vox Perkin Elmer dönen disk konfokal mikroskopi sisteminde Volocity) uygun görüntüleme yazılımı kullanarak her 3 saniyede 1 kare 4 dakika boyunca görüntü kazanır. FM1-43 Eksitasyon 488 nm bant geçişi ile, bir dikroik filtre kullanılarak bir 488 nm lazer hattı ile gerçekleştirilir ve emisyon ayrımcılık 527 (W55) emisyon filtre kullanımı yoluyla elde edilir. Lazer güç seviyeleri ve kamera duyarlılık 100 milisaniye görüntü pozlama elde etmek için ayarlanır.
- Tekrar 3,2-3,6 bu adım 3,5 Solution B (Tablo 1) ilave edilmelidir dışında, Ca 2 + yokluğunda hiçbir SLO yaralama (Numune 2) ile kontrol siRNA ile muamele edilmiş hücrelerde FM1-43 tespit için yineleyin.
- Mevcudiyetinde (Örnek 3) veya Ca 2 + yokluğu (Örnek 4), merkez cam lamel SLO ihtiva eden soğuk Çözelti B'nin 180 ul ekle ya SLO yaralandı kontrol siRNA ile muamele edilmiş hücrelere FM1-43 akını ölçmek 35 mm'lik cam alt çanak ve aşama 3.3 'de olduğu gibi, buz üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin. Tekrar 3.6 ile 3.2 adım, basamak 3,5 (Tablo 1) Çözüm A veya B Çözüm ya ekleyerek ayarlayın.
- Plazma zarı tamir ASM rolünü belirlemek için, tekrar tüm koşullar (Örnekler 5-8) (Tablo 1) ASM siRNA'nın muamele hücreleri kullanılarak 3,2-3,6 adımları.
- Üzerinde dışı rekombinant sfingomiyelinaz (SM) rolünü belirlemek için(FM1-43 akını inhibisyonu ile gösterilmiştir), plazma membran onarım kinetiği (Örnekler 9-10), SM ilave aşama 3,5 (0-50 μU) için çözelti A ya da B solüsyonu ve daha sonra canlı hücre sırasında hücrelere ilave edilir 1 ml (Tablo 1) bir toplam hacim içinde görüntüleme.
4. Hücreler içine FM1-43 Akın miktar tayini
- Filmler elde edilmiştir sonra, görüntü analiz yazılımı (Volocity Suite, PerkinElmer) kullanılarak FM1-43 hücre içi floresan yoğunluğunu ölçmek. Alanında her hücrenin sitozolik bölgede ilgi bir bölgeye çekmek ve video tüm çerçeveler boyunca ortalama FM1-43 floresan yoğunluğunu belirlemek için yazılım araçları geçerlidir.
- Başlangıç FM1-43 boyama farklılaşmaların ayarlamak için, her bir görüntü için veri zaman, flüoresan yoğunluğundaki kat artış olarak ifade edilir ve her biri farklı bir durum için grafiğe geçirilmiştir. Her bir zaman noktasında her bir bölgesinin floresansta kat artışF T hücre spesifik bir zaman noktasında ortalama floresan olan T F / F 0 olarak hesaplanan, F ve 0, t = 0 (Şekiller 1-2) de ortalama floresan olmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lizozomal asit sfingomiyelinaz tükenmiş hücrelerde bakteriyel sfingomiyelinaz (SM) kurtarma plazma zarı onarımı düşük konsantrasyonları.
FM1-43 görüntüleme deneyi kullanılarak, daha önce Ca 2 + mevcudiyetinde yaralama lizozomal enzim ASM eksikliği olan ve SLO maruz kalan hücreler, plazma zarı kusur yeniden birleştirici insan enzimi 19 hücre dışı eklenmesiyle kurtarılır sahip olduğunu göstermiştir. İnsan ASM lızozomal düşük bir pH optimumuna sahip olduğu için, biz yeniden mühürleme aynı zamanda, nötr pH değerinde tam olarak aktif olan Bacillus cereus (Sigma), saflaştırılan SM ekleyerek restore edilebilir olup olmadığı araştırıldı. Ca 2 yokluğunda kontrol siRNA veya ASM oligo siRNA ile muamele edilmiş ve SLO maruz Daha önce gösterildiği gibi, hücreler + (onarımı için geçirgen olmayan koşullar) eşit olduğu ASM tükenmesi toksin (Şekil 1A duyarlılık ile karışmaz gösteren, geçirgenleştirildi .) İlginçtir, tam bir kurtarma of SLO maruz kaldıktan sonra tekrar kapatılması için ASM-yetersizliğine sahip hücrelerin yeteneği düşük SM, 5 konsantrasyonları ve 7.5 μU / ml (Şekil 1 B) ile gözlenmiştir. Ortama ilave enzim konsantrasyonu arttıkça, kurtarma fenotipinde kademeli kaybı vardı - 10 μU / ml maruz kalan hücreler, sadece kısmen SLO maruz kaldıktan sonra FM1-43 akını engellenmiş ve 50 μU / ml maruz kalan hücreleri gösterdi ASM-tükenmiş hücreleri (Şekil 1B ve 1C) gözlenene benzer tam bir yeniden yalıtım kusuru yansıtır, güçlü bir boya akışı model. Süreci normalde oluşmaz belli bir seviyenin üzerinde ve hücreler lezyonları silemezsiniz - Bu sonuç SLO endositik çıkarılması sıkı SM tarafından plazma zarı üretilen seramid düzeylerinin tarafından düzenlenir gözenekler olduğunu göstermektedir.
Sfingomiyelinaz ilave plazma zarı onarımı Ca 2 + için gereksinimi atlar.
Bakteriyel S Dikkate değer, katılmaCa 2 + da kurtarılan plazma zarı tamir (hücre ile tekrar kapatılmasına izin vermez, normal bir durum) yokluğunda SLO ile geçirgen hücrelere M. + (Şekil 1B ve 1C), SM, sadece düşük konsantrasyonlarda FM1-43 akın bloke edilmesinde etkili olan Ca 2 varlığında, gözenek oluşturucu toksine maruz hücrelerinde görüldüğü gibi (Şekil 2A ve 2B). Bu sonuçlar göstermektedir ki plazma zarı tamir Ca 2 +-bağımlı aşamasının alt sfingomiyelinaz fonksiyonları. Bu bulgu, lizozomlar ve ASM açıklaması, eksositosizini tetikler Ca 2 + zar gözeneklerinden akan önermeleri bizim önceden önerilen model ile tamamen tutarlı olduğu plazma zarının dış broşürü, üreten seramid ve endositoz 22 tarafından teşvik gözenek kaldırılması üzerine parçalayarak sfingomyelin 19. Saflaştırılmış SM ilavesi Ca 2 + güçlü güçlendirmek için ihtiyaç atlar olmasıfizyolojik koşullar altında Ca lizozomların 2 + düzenlenmiş ekzositozu endositoz teşvik etmek için gerekli olan sfingomiyelinaz faaliyetinin kaynağı olduğunu s görünüşüdür.
Şekil 1. Bacillus cereus sfingomiyelinaz (SM) gözenek oluşturucu toksin streptolizin O (SLO). Kontrol siRNA veya ASM siRNA ile muamele edilmiş HeLa hücreleri oligolar ile yaralandı asit sfingomiyelinaz (ASM) ekspresyonu için susturulmuş hücrelerin plazma zarı tamir bozukluğunu tamamlayabilir ki bu Ca 2 + ve FM1-43 4 dakika boyunca 1 kare / 3 sn görüntülenmiştir lipofilik boya akını yokluğunda ya da mevcudiyetinde yaralandı. FM1-43 hücre içi floresan Volocity yazılımı kullanılarak ölçülür ve zaman içinde flüoresan yoğunluğundaki kat artış olarak ifade edildi. (A) In Ca 2 + yokluğu, kontrol siRNA ve ASM siRNA ile muamele edilmiş hücreler, her iki SLO ile geçirgenleştirildi. 18-27 hücreler her bir durumda analiz edildi. Hata çubukları, ortalama + / tekabül - Ca 2 + varlığında SEM (B), kontrol siRNA ile muamele edilmiş hücreler, plazma membranı kapatın ve boya akışını durdurmak mümkün iken ASM siRNA ile muamele edilmiş hücreler, yeniden mühürlemek için başarısız oldu. Buna ek olarak Ca 2 + varlığında, sfingomiyelinaz düşük dozlarda eksojen ek ASM siRNA ile muamele edilmiş hücrelerin plazma zarı kusur tamamlar. 18-62 hücreler her bir durumda analiz edildi, hata çubukları, ortalamanın + / tekabül - SEM (C) B analiz filmin zaman çerçevesi seçilir.. Barlar, 9 mm. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
g "alt =" Şekil 2 "fo: İçerik-width =" 3.25in "fo: src =" / files/ftp_upload/50531/50531fig2highres.jpg "/>
Şekil 2. Sfingomiyelinaz ek. Kontrol siRNA ile muamele edilmiş HeLa hücreleri, 2 + ve lipofilik boya FM1-43 akışı için 4 1 kare / 3 sn görüntülenmiştir Ca yokluğunda SLO ile yaralandı plazma membran onarım Ca2 + için gereklilik atlar min. FM1-43 hücre içi floresan Volocity yazılımı kullanılarak ölçülür ve zaman içinde flüoresan yoğunluğundaki kat artış olarak ifade edilir. (A) plazma zarının olmaması normal olarak Ca yokluğunda SLO ile yaralandı hücrelerde görülen yeniden mühürleme, 2 + eksojen ilave edilmesi ile tersine çevrilir sfingomiyelinaz düşük doz. 18-31 hücreler her bir durumda analiz edildi, hata çubukları, ortalamanın + / tekabül - SEM (B) bir analiz filmin zaman çerçevesi seçilir.. Barlar, 9 mm.g2large.jpg "target =" _blank "> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,. Prosedürüne dahil deneysel adımlar için Prosedürü zaman çizelgesi. Timeline. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
| Ca2 +-durum | Ca2 +-serbest durumda | SLO toksin | Sıcak çözelti A | Sıcak Çözelti B | Sfingomiyelinaz | Yordam Adım |
| + | - | - | + | - | - | 3.2 |
| - | + | - | - | + | - | 3.7 |
| + | - | + | + | - | - | 3.8 |
| - | + | + | - | + | - | 3.8 |
| + | - | - | + | - | - | 3.9 |
| - | + | - | - | + | - | 3.9 |
| + | - | + | + | - | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | + | 3.10 |
| + | - | + | + | - | + | 3.10 |
Tablo 1. Prosedürde tarif edildiği gibi deneysel prosedürde kullanılan çözeltilerin bileşimi. Numuneleri satır listelenmiştir. Adlandırılmış bileşen (oligo, Ca2 + veya Ca2 + içermeyen bir ortamda, SLO, çözelti A ya da B, sfingomiyelinaz) of (-) sütunlar varlığı (+) ya da yokluğunu göstermektedir. Bu örnekler ilk Prosedür Bölüm 3'te canlı hücre görüntüleme için kullanıldığı deneysel adım gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mekanik yaralanma ve plazma zarı onarımı ile ilgili önceki çalışmalar, cam boncuklar, micropipetting, kesme, tırmalama ya da kazıma bırakarak kadar, yaralama hücrelerin çeşitli mekanizmaları dayanıyordu. Tüm bu testlerin saati yerine nicel daha nitel olduğunu ve tamir mekanizması kinetikleri üzerinde kesin bir bilgi vermemiştir. Yaralanma bu formları sonra plazma zarı mühürlemek için hücrelerin yeteneği membran geçirgen olmayan boyalar, sitosolik enzim, ATP seviyeleri, ya da uzun vadede kaybı sitoplazma, penetrasyonu hücre dışı sıvı ilave izleyiciler varlığında veya olmaması kıstası ile ölçülmüştür hücresel hayatta. Bu tahlillerin çok nicel yapılabilir, ancak hızlı bir tek hücre düzeyinde yeniden mühürleme kinetiklerini değerlendirilirken, bu çalışmalarda önemli bir engel, yaralama olay senkronize zorluk oldu.
Kas liflerinin UV-lazer yaralanma gelişimi ve kullanımı Follolipofilik boya FM1-43 akını tespiti ile evlenmek bu çalışmalarda 17,20 büyük bir ilerleme oldu. Bunun yerine kazıma ya da yaralanma benzer mekanik araçlar ile tüm hücre popülasyonuna açtığı brüt hasar, bu deneyler, tek bir hücre analizi izin hücreler yara için daha belirgin bir şekilde ortaya. Bununla birlikte, çeşitli sorunlar bu tahlillerde kaldı. Lazer kaynaklı lezyonların boyut, fizyolojik koşullar sırasında meydana gelen membran yaralanma formları daha büyük ve oldukça değişken lazer yoğunluğuna bağlı olarak, ve doğada çok farklıdır. Başka bir problem, sadece tek bir hücre ya da kas lifi takip edilebilir etkinlik, yeniden kapama sayısını azaltarak, mikroskop ile ilişkili lazer kullanarak aynı anda yaralı ve böylece sonuçların istatistiksel anlamlılık edilebilir olmasıdır. Tekrarlanabilirlik ve örnekleme ile bu sorunları büyük ölçüde plazma zarı onarım mekanizmalarını araştırmak için bir yöntem olarak lazer yaralanma yararlılığını azalır.
To bu konuları ele, biz kesin bakteriyel gözenek oluşturucu toksinlerin neden plazma zarı lezyonların tamiri kinetik ölçmek için yeni bir canlı hücre görüntüleme testi geliştirdi. Bu, pek çok mikrop ökaryotik hücre zarının nüfuz edebilen çok sayıda toksinler sahip olmaları nedeniyle, doğal olarak sıklıkla ortaya çıkar yaralanma şeklidir. Sıcaklık gözenek oluşumunu tetiklemek için arttırıldıkça Bu deney, kesin bir ifadeyle, düşük sıcaklıklarda, toksin ile hücrelerin önceden inkübe edilmesi ile senkronize ve mikroskobik alanda hücrelerin çok sayıda FM1-43 akışı için analiz edilmesini sağlar edilebilir.
Bu tahlilde elde gözenek oluşumunun kesin senkronizasyon mikroskobik alan içinde çeşitli tek tek hücrelerin aynı anda miktarı belirlenebilir plazma zarı tamir kinetiği, tekrarlanabilir ölçümlerine izin verir. Bu deneylerde bir önemli teknik bir faktör görüntüleme için kullanılacak mikroskop objektif lens kalitesidir. TAnalizlerde kullanılan o 40X NA 1.3 (Nikon) amacı, görüntü çözünürlüğü kaybetmeden bir popülasyonda hücrelerin yeterli bir örnekleme sağlar. 10X objektif geçiş hücre nüfusun büyük bir örnekleme izin verir, ama elde edilir çözünürlük hücre içi FM1-43 uygun bir şekilde ölçülmesi için yetersiz olacaktır. Bu canlı hücre görüntüleme deneyi için kritik bir safha, ısıl sürüklenme düzeltmek için PerfectFocus veya benzer bir cihaz kullanılmasıdır. Bizim prosedür buz üzerinde hücrelere bakteriyel gözenek oluşturucu toksin önceden bağlanması ve daha sonra canlı hücre görüntüleme boyunca 37 ° C'ye kadar hızlı bir sıcaklık kayması gerekir. Bu sıcaklık ayarı görüntü toplama döneminde eksenel odak dalgalanmalara sebep olur, ve düzeltilmesi gerekir. PerfectFocus veya benzer bir cihaz böylece plazma zarı onarım kinetik hassas sayılmasına olanak tanıyan, uzun süre boyunca seçilen odak düzlemi canlı hücre görüntüleme sağlayan bu sorunu düzeltecektir.
Için bir anahtarBu deneyde başarısı, bu kullanılan toksin her parti için değişebilir çünkü her titre ön kalıplama toksin farklı konsantrasyonlarda, onarılabilir ve onarılamaz dozları belirlemek için etmektir. Özellikle bir çok toksin aktivitesi ve SLO, döngüleri aktivitesine için zararlı olan dondurularak çözülür ısıya hassas ve katıdır. Ancak her deneyde yanında gerçekleştirilen titrasyonlar doğru toksin dozu tam zaman atlamalı görüntüleme sadece birkaç dakika içinde tespit edilebilir izin verir.
Bu deney, plazma zarı yaralanma sonrası hücre içinde yeterli FM1-43 floresans algılama dayanır. Bu, belirli koşullar altında sınırlayıcı olabilir. Zarlar SLO formlarına taktıktan sonra güçlü bir Ca2 + akışı ve ökaryotik hücrelerde hızlı bir plazma membran onarım yanıtı sağlayan, yaklaşık 30 nm'lik bir çapa sahip gözenekler. Ancak, yaklaşık gözenek çapları örneğin aerolysin ve lysenin gibi küçük yaralar, toksinler gözenek oluşturucuOnlar yetersiz Ca 2 + ve FM1-43 akınına neden olabilir beri 1-3 nm 23-25 Bu deney için yeterli olmayabilir.
Hatta bu tür slo gibi büyük gözenekleri üreten bir toksin kullanarak, bu görüntüleme tahlil floresan şiddetinin mutlak ölçümü için izin değil, göreceli floresan olmadığını akılda tutmak önemlidir. Böylece, görüntüleme, dijital kamera intrascene dinamik aralığında gerçekleştirilir önemlidir. Floresan yoğunluğu lazer gücü, maruz kalma süresi, ve kamera kazanç etkilenir olduğundan, onarım ve olmayan hem de FM1-43 ve SLO ile muamele edilmiş hücrelerin ön görüntüleme gerçekleştirerek, her deney başlangıcında bu üç parametrelerini ayarlamak için önemlidir -onarım koşulları (Ca 2 + ve Ca 2 + içermeyen ortam). Bu sayede, sıfır zamanında floresans algılama sağlar (SLO ilave edilmeden önce), ancak (detektör doyma neden olmayan görüntü elde etme ayarları seçim unsurlar olaraknon-onarım koşulları altında satın alma sonunda yazılım okuma) tarafından ined.
Bu tahlili kullanarak, SLO gözenekler bu işlem, mekanik yaralar 16 tamir benzer bir hızlı olan bir kinetiğe sahiptir gösteren, en az 30 saniye içinde memeli hücrelerin plazma zarından kaldırılır olduğunu göstermek mümkün. Daha sonraki çalışmalar, lizozomal enzim ASM plazma membran onarım için gereklidir ve ASM-yetersizliğine sahip hücrelerin 19, hücre dışı ilave edildiğinde tekrar sızdırmaz hale geri yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada, ilk kez için, plazma zarı tamir da hücre dışı Ca2 + 'nın yokluğunda meydana gelebileceğine inanılır, göstermek için FM1-43 akışı deneyinin duyarlılığı yararlandı. Rekombinant sfingomiyelinaz için yaralı hücrelerin maruz Ca2 + içermeyen ortam, plazma membran onarım için normal olarak izin veren bir durumda SLO ile geçirgen hücrelerinde yeniden mühürleme teşvik etmek için yeterli olmuştur. İlginç bir şekilde, tamamlayıcıplazma zarı tamir kapasitesinin si, plazma membranının dış yaprakçıkta bu enzim tarafından üretilen seramid miktarı lezyon temizleme işleminin önemli bir belirleyicisi olduğunu düşündürmektedir sfingomiyelinaz yüksek konsantrasyonlarına maruz kaldıktan sonra gözlenmedi. Bu bulgu, Ca 2 + lizozomal ekzositozu adımı tetiklemek için gerekli olduğunu göstermektedir, ancak yara internalizasyonundan sorumlu olan sfingomiyelinaz kaynaklı endositoz için gerekli değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarları var beyan.
Acknowledgments
Bu çalışma Biz SLO ifade plazmid için Oklahoma Üniversitesi'nden Dr R. Tweten teşekkür NWA NIH hibe R37 ve R01 AI34867 GM064625 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
| FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
| Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
| Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
| SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
| Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
| Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
| 35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
| Material | |||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
| Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
| Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
| Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber | |
References
- Heilbrunn, L. The dynamics of living protoplasm. , Academic Press. (1956).
- Chambers, R., Chambers, E. Explorations into the nature of the living cell. , Harvard University Press. (1961).
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263, 390-393 (1994).
- McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).
- Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Chakrabarti, S., et al. Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice. J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).
- Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. Pore formation: an ancient yet complex form of attack. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).
- Morgan, B. P., Campbell, A. K. The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium. Biochem. J. 231, 205-208 (1985).
- Keefe, D., et al. Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis. Immunity. 23, 249-262 (2005).
- Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).
- Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).
- Zha, X., et al. Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis. J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).
- Buckley, J. T. Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin. FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).
- Parker, M. W., et al. Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states. Nature. 367, 292-295 Forthcoming.
- Yamaji-Hasegawa, A., et al. Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin. J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).
