Summary
Echtzeit-Bildgebung von Zellen mit dem lipophilen Farbstoff FM1-43 ausgesetzt ermöglicht eine präzise Bestimmung der Kinetik durch die porenbildende Toxine sind von der Plasmamembran entfernt. Dies ist ein empfindlicher Test, der verwendet werden kann, um Anforderungen für die Ca 2 +, Sphingomyelinase und anderen Faktoren auf die Plasmamembran Reparatur zu beurteilen.
Abstract
Plasma-Membran-Verletzung ist ein häufiges Ereignis, und Wunden müssen schnell repariert, um zelluläre Überleben zu gewährleisten. Einstrom von Ca 2 + ist ein Schlüsselsignalisierungsereignis, das die Reparatur von mechanischen Verletzungen an der Plasmamembran innerhalb von ~ 30 s auslöst. Jüngste Studien zeigten, dass Säugerzellen ihrer Plasmamembran nach Permeabilisierung mit porenbildenden Toxinen in einem Ca 2 +-abhängigen Prozess, der Exozytose des lysosomalen Enzyms saure Sphingomyelinase, gefolgt von Poren Endocytose beinhaltet auch wieder zu verschließen. Hier beschreiben wir die Methodik, um zu zeigen, dass das Wiederverschließen der Zellen durch das Toxin Streptolysin O permeabilisiert ist auch eine schnelle und abhängig von Ca 2 +-Einstrom. Der Assay-Design ermöglicht die Synchronisation der Verletzungsanlaß und eine genaue kinetische Messung der Fähigkeit von Zellen, Plasmamembranintegrität von Abbildungs wiederherzustellen und Quantifizieren des Ausmaßes, mit dem die lipophilen Farbstoff FM1-43 intrazellulären Membranen erreicht. Diese Live-Test ALSo ermöglicht eine sensible Bewertung der Fähigkeit von exogen zugesetzten löslichen Faktoren wie Sphingomyelinase FM1-43 Einstrom hemmen, was auf die Fähigkeit von Zellen, die Plasmamembran zu reparieren. Dieser Assay erlaubt uns zum ersten Mal zeigen, dass Sphingomyelinase wirkt abwärts von Ca 2 +-abhängigen Exozytose, da extrazelluläre Zugabe des Enzyms fördert Wiederverschließen der Zellen in der Abwesenheit von Ca 2 + durchlässig gemacht.
Introduction
Es ist seit mehreren Jahrzehnten bekannt, dass die Plasmamembran-Reparatur nach mechanischen Verletzungen ist ein Ca 2 +-abhängigen Prozess 1,2. Spätere Studien zeigten, dass Ca 2 +-Einstrom durch die Wunde löst eine kräftige Prozess der Exozytose von intrazellulären Vesikeln an der Stelle der Verletzung, die zum Wiederverschließen 3,4 erforderlich ist. Die Verlustrate der Fluoreszenzfarbstoff in das Zytoplasma der Zellen geladen wurde verwendet, um die Geschwindigkeit der Reparatur zu beurteilen und festgestellt, dass Wiederverschließen wurde innerhalb von <30 sec nach der Verletzung 5 abgeschlossen. Zwei Modelle wurden zunächst vorgeschlagen, die Voraussetzung für die Exozytose in Plasmamembran-Reparatur zu erklären: 1) die "Patch"-Modell, das vorgeschlagen, dass Ca 2 +-Einstrom durch die Läsion löst zunächst homotypischen Fusion von intrazellulären Vesikeln, bilden eine große "Patch" Das wäre dann in die Plasmamembran aufgebracht, um die Wunde 6 und 2) die Spannungsreduzierung Modell, das die Membran adde vorgeschlagen werden verschließendurch Ca 2 +-abhängige Exocytose in der Nähe der Wunde d würde Plasmamembranspannung zu verringern und erleichtert Wiederverschließen der Doppelschicht 7. Die Rolle von Ca 2 + ausgelöste Exocytose in der Plasmamembranreparatur wurde durch Studien, die zeigen, dass Lysosomen enthalten eine Ca 2 +-Sensormolekül, synaptotagmin VII, die Exocytose und deren Plasmamembran Reparatur erleichtert verletzten Zellen verstärkt 8,9,10,11 .
Allerdings hat zusätzliche Beweise zeigten, dass Exozytose allein war nicht ausreichend, um die Reparatur der Plasmamembran zu fördern. Neben mechanischen Tränen auf der Plasmamembran, ist eine häufige Form von Zellschädigung Permeabilisierung von durch Bakterien oder Immunzellen 12,13 14,15 hergestellt porenbildenden Toxinen. Im Gegensatz zu mechanischen Tränen, porenbildende Proteine, fügen sich auf der Plasmamembran, eine stabile, Protein-Pore gesäumt, die nicht einfach durch die Anwendung einer Membran "Patch" oder durch Reduktion wieder verschlossen werden könnenten Membranspannung. Interessanterweise Studien zeigten, dass Säugerzellen mit einem effektiven Mechanismus, um die Plasmamembran nach Permeabilisierung mit porenbildende Proteine zu reparieren, und dieses Verfahren erfordert ebenfalls die Gegenwart von extrazellulärem Ca 2 + 12. Dieser Befund warf die Frage auf, ob Transmembranporen Entfernung von der Zelloberfläche war auch ein schneller Prozess, wie bei mechanischen Wunden 5 beobachtet. Überraschenderweise zeigte unsere jüngste Studien, daß das Wiederverschließen der Zellen, die mit porenbildenden Toxinen permeabilisiert hat sehr ähnliche Eigenschaften wie die Reparatur von mechanischen Wunden: erfordert das Verfahren der extrazellulären Ca 2 +, und wird innerhalb von ~ 30 sec abgeschlossen. Die Untersuchung dieses Prozesses näher wir vor kurzem erfahren, dass zusätzlich zu den Ca 2 +-regulierte Exozytose von Lysosomen, Plasmamembran Reparatur beinhaltet eine schnelle Form der Endozytose, die durch die Freisetzung von lysosomalen Enzym ausgelöst wird, saure Sphingomyelinase (ASM) und ist essentiell nicht nur für the Entfernen der Transmembranporen, aber auch für die Reparatur von mechanischen Verletzungen 16.
Um die Kinetik der Zellwiederverschließen nach Permeabilisierung mit porenbildenden Proteinen zu bestimmen, die wir in unserem Labor eine Echtzeit-Bildgebung geeignet Methodik, die zuvor verwendet worden war, um Wiederverschließen der Laser verletzt isolierte Muskelfasern 17 beurteilen. Dieser Assay beruht auf Eigenschaften der lipophilen Farbstoff FM1-43, die stabil interkaliert in die äußere Seite der Lipiddoppelschichten Erhöhung der Fluoreszenzintensität. Wenn der Plasmamembran-Doppelschicht extrazellulären Farbstoff erhält Zugang zu intrazellulären Membranen gestört, die ein empfindliches Assay Plasmamembran Verletzungen erkennen und reparieren 18,16,19,20. Um diesen Test zur Beurteilung der Zellwiederverschließen nach Permeabilisierung mit porenbildende Proteine anzupassen, wir vorinkubierten Zellen bei 4 ° C mit dem bakteriellen Toxin Streptolysin O (SLO), welche an Membrancholesterin 21 bindet. Synchron-ZellePermeabilisierung kann dann leicht durch Bewegen der Zellen vom Medium, um Eis in einem erwärmten Mikroskoptisch, der die Oligomerisation und Änderung der Konformation, die den Transmembranporenbildung führt aktiviert erwärmen erreicht werden. Ein Vorteil dieser Vorgehensweise gegenüber den bisher veröffentlichten Untersuchungen mit Laser Verwundung ist, dass eine größere Anzahl von Zellen gleichzeitig in einem mikroskopischen Feld analysiert werden, eine bessere Abtastung der Zellpopulation. Angesichts der Gemeinsamkeiten zwischen der Zellwiederverschließen Prozess nach mechanischen Verletzungen und Permeabilisierung mit porenbildende Toxine zu sehen ist, der Test beschreiben wir hier eine sehr vielseitige und leistungsstarke Methode zum Präparieren Faktoren in der grundlegenden Verfahren der Plasmamembran-Reparatur beteiligt. Als Beispiel zeigen wir, dass es möglich ist, diesen Test zu verwenden, um Ca 2 +-abhängigen und unabhängigen Schritten des Reparaturvorgangs zu identifizieren.
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Protocol
1. Transkriptions Silencing von ASM
- Samen 1,5 x 10 5 HeLa-Zellen in 2 ml DMEM Wachstumsmedium (DMEM mit hohem Glucose mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1% Penn-Strep) auf 35 mm Glasbodenschalen (MatTek) und Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Inkubator.
- Am folgenden Tag, absaugen dem Wachstumsmedium und ersetzen Sie es mit 2 ml DMEM reduziert Serummedium (DMEM mit 4% FBS), mindestens 1 Stunde vor der Zugabe der siRNA-Transfektion Mischung.
- Bereiten 4 Röhren für die siRNA-Transfektion Oligo-Mischung. In Röhren A und C, fügen Sie 250 ul Optimem reduziert Serum und 4 ul Lipofectamine RNAiMax, pro 35 mm-Schale transfiziert werden. In Rohr B, fügen Sie 250 ul Optimem reduziert Serum und 8 ul (160 pmol) des Steuermedium GC-Gehalt Oligo (Control siRNA), pro 35 mm-Schale transfiziert werden. In Rohr D, fügen Sie 250 ul Optimem reduziert Serum und 8 ul (160 pmol) des SMPD1 Oligo (tern), pro 35 mm-Schale to transfiziert werden. Die Röhrchen bei Raumtemperatur für 5 min inkubiert.
- Kombinieren Rohre A und B, um die Transfektion Komplex für Kontroll-siRNA und Rohre C und D für die ASM siRNA zu bilden. Inkubiere die Reaktion bei Raumtemperatur für 20 min.
- Fügen Sie die Kontrolle siRNA und siRNA-Transfektion ASM Reaktionsmischungen langsam tropfenweise in die jeweiligen 35-mm-Glasboden Gerichte und bei 37 ° C / 5% CO 2. Bei 24 Stunden nach der Transfektion sanft absaugen Medien und ersetzen mit frischem DMEM Wachstumsmedien. Für eine effiziente ASM Knockdown, die Gerichte sollten weiter bei 37 ° C / 5% CO 2 für ca. 31 h (insgesamt 55 Stunden) vor dem Live-Bildgebung inkubiert werden.
2. Vorbereitung der Reagenzien für Live-Mikroskopie
- Eine Lösung von rekombinantem porenbildenden Toxin Streptolysin O (SLO) bei einer Konzentration von 100 ng / ul in kaltem 1x PBS ohne Ca 2 + und Mg 2 +. Die in diesen Tests verwendeten SLO ist constitutively aktiven Cystein-Mutante, die nicht erfordert Reduktionsmittel für Aktivität, freundlicherweise von Dr. Rod Tweten, University of Oklahoma ist. Das Toxin wurde in E. ausgedrückt coli BL21 DE3 und unter nativen Bedingungen gereinigt, wie zuvor 16 beschrieben.
- Bereiten Sie den FM1-43 Stammlösung resuspendieren FM1-43 gefriergetrocknetes Pulver in DMSO, um eine 25 mM Lösung zu schaffen.
- Bereiten Lösung A: Verdünnen Sie die FM1-43-Stammlösung in kaltem DMEM mit Ca 2 + bis zu einer endgültigen Konzentration von 4 uM (1,5 ml pro MatTek Gericht erforderlich) zur Lagerung auf Eis, bis sie benötigt.
- Bereiten Lösung B: Verdünnen Sie die FM1-43-Stammlösung in kaltem DMEM ohne Ca 2 + und 10 mM EGTA (Ca 2 +-freiem DMEM) in einer Endkonzentration von 4 uM (1,5 ml, die pro MatTek Gericht) und speichern auf Eis, bis benötigt.
- Pre-warm (37 ° C) Je 1 ml Lösung A und Lösung B in Eppendorf-Röhrchen.
- Halten auf Eis Lösungen von DMEM mit Ca 2 + und Ca 2 +-freiem DMEM.
3. Live Cell Imaging von FM1-43 Influx in SLO behandelten und unbehandelten Zellen
- Füllen Sie eine mittelgroße flache Metallbehälter mit Crushed Ice, kehren sie in einem großen Glasbehälter mit Eis, und zusätzliche Eis nur die Bodenfläche des Metallbehälters ausgesetzt verlassen. Legen Sie ein nasses Papiertuch auf dem freiliegenden Metallboden für gleichmäßigen Wärmefluss zu ermöglichen.
- Nehmen Sie eine Kontroll-siRNA-behandelten MatTek Gericht (Probe 1) und legen Sie sie auf dem kalten nassen Papiertuch. Vorsichtig absaugen alle Medien und 3x waschen mit kaltem Ca 2 +-freiem DMEM. Nach dem letzten Wasch, absaugen alle Medien in die Schüssel.
- Um Bildzellassoziierte FM1-43-Zellen ohne SLO Verwundung (Probe 1) in Gegenwart von Ca 2 +, 180 &mgr; l hinzugefügt kalten Lösung B zum Zentrum Deckglas der Bodenschale 35 mm Glas und Inkubation für 5 min auf Eis (Tabelle 1). Platzieren MatTek Schale auf der Bühne eines konfokalen Mikroskops auf 37 ° C erhitzt und mit einer Klimakammer (die Temperatur, Feuchtigkeit und CO 2-Gehalt beibehalten wird) ausgestattet. Finden Sie den Bereich der Zellen, der abgebildet werden soll der Blick durch ein 40x NA 1.3 Objektiv (Nikon). Falls vorhanden, schalten Sie PerfectFocus oder einem ähnlichen Gerät, um die thermische Drift zu korrigieren.
- 1 ml der vorgewärmten Lösung A sanft auf die Seite der 35-mm-Schale und Deckel ersetzen, der Umweltkammer (Tabelle 1).
- Erwerben Sie Bilder für 4 min bei 1 Frame alle 3 Sek. mit entsprechenden Bildbearbeitungssoftware (Volocity in der Ultraview Vox Perkin Elmer Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie-System). Anregung der FM1-43 mit einem 488-nm-Laserlinie unter Verwendung eines dichroitischen Filters mit einem 488 nm Bandpassgeführt und Emissions Diskriminierung wird durch die Verwendung eines 527 (W55) Emissionsfilter erreicht. Laserleistungsniveaus und die ISO-Empfindlichkeit eingestellt, Bildaufnahmen von 100 ms zu erreichen.
- Die Schritte 3.2 bis 3.6 FM1-43 Kontroll-siRNA-behandelten Zellen in Abwesenheit von Ca 2 + zu erfassen ohne SLO Verwundung (Probe 2), mit der Ausnahme, daß im Schritt 3.5 die Lösung B hinzugefügt werden soll (Tabelle 1).
- Um FM1-43-Einstrom in Steuer siRNA-behandelten Zellen mit SLO entweder in Gegenwart (Probe 3) oder Abwesenheit von Ca 2 + (Probe 4), fügen Sie 180 ul der kalten Lösung B enthält SLO zum Zentrum Deckglas der Verwundeten zu messen 35-mm-Glasbodenschale und Inkubation für 5 min auf Eis, wie in Schritt 3.3. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.6; einstellen Zugabe entweder Lösung A oder Lösung B in Schritt 3.5 (Tabelle 1).
- Um die Rolle von ASM in der Plasmamembran Reparatur, wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,6 mit ASM siRNA-behandelten Zellen für alle Bedingungen (Proben 5-8) (Tabelle 1).
- Um die Rolle von extrazellulärem rekombinanten Sphingomyelinase (SM) auf derKinetik der Plasmamembran Reparatur (reflektiert durch die Hemmung in FM1-43 Zustrom) (Proben 9-10), wird SM aufgenommen (0-50 uU) entweder Lösung A oder Lösung B in Schritt 3.5 und dann während der Live-Zelle hinzugefügt, um Zellen Imaging in einem Gesamtvolumen von 1 ml (Tabelle 1).
4. Quantifizierung von FM1-43-Einstrom in Zellen
- Nach Filmen erworben wurden, messen die intrazelluläre Fluoreszenzintensität von FM1-43 unter Verwendung von Bildanalyse-Software (Volocity Suite, PerkinElmer). Zeichnen eines Bereichs von Interesse in der zytosolischen Bereich jeder Zelle in dem Feld und Anwendung der Softwaretools, um die mittlere FM1-43-Fluoreszenzintensität in allen Frames der Video bestimmen.
- Um Schwankungen in der Ausgangs FM1-43-Färbung einzustellen, werden die Daten für jede Video fachen Anstieg in der Fluoreszenzintensität über die Zeit ausgedrückt, aufgetragen und für jeden unterschiedlichen Zustand. Die Zunahme in der Fluoreszenz der einzelnen Zeitpunkt proZelle als F T / F 0, wobei F T die mittlere Fluoreszenz im festen Zeitpunkt berechnet wird, und f 0 die mittlere Fluoreszenz zum Zeitpunkt t = 0 (Fig. 1-2).
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Representative Results
Niedrige Konzentrationen von bakteriellen Sphingomyelinase (SM) Rettungsplasmamembran-Reparatur in Zellen in lysosomalen sauren Sphingomyelinase erschöpft.
Verwendung der FM1-43 Abbildungsassay wir früher gezeigt, dass Zellen defizient für das lysosomale Enzym ASM und SLO ausgesetzt Verwundung in Gegenwart von Ca 2 + über einen Plasmamembran-Defekt wird durch extrazelluläre Zugabe des rekombinanten menschlichen Enzyms 19 gerettet. Da das humane lysosomale ASM hat einen niedrigen pH-Optimum, untersuchten wir, ob Wiederverschließen kann auch wiederhergestellt SM Zugabe von Bacillus cereus (Sigma), die bei neutralem pH-Wert voll aktiv ist, gereinigt werden. Wie zuvor dargestellt ist, Zellen mit Kontroll-siRNA oder ASM siRNA Oligos behandelt und in Abwesenheit von Ca 2 + SLO ausgesetzt (Bedingungen nicht permissiv für Reparatur) wurden ebenso permeabilisiert, die zeigen, dass ASM Verarmungs nicht mit Empfindlichkeit gegenüber dem Toxin (1A interferieren ). Interessant ist, dass eine vollständige Rettung of die Fähigkeit des ASM-defizienten Zellen nach der Exposition gegenüber SLO verschließen mit niedrigen Konzentrationen von SM, 5 und 7,5 &mgr; U / ml (Fig. 1B) beobachtet. Da die Enzymkonzentration zu dem Medium gegeben erhöht, gab es einen allmählichen Verlust in der Rettungs-Phänotyp - Zellen 10 &mgr; U / ml ausgesetzt nur teilweise blockiert den Zustrom von FM1-43 nach Exposition mit SLO, und Zellen, die 50 &mgr; U / ml ausgesetzt waren, zeigten ein starker Zustrom Farbstoffmuster, was auf eine vollständige Wiederverschließen Defekt ähnlich der in ASM verarmten Zellen (Fig. 1B und 1C) beobachtet. Dieses Ergebnis legt nahe, dass endocytic Entfernung von SLO Poren fest durch den Ceramidspiegel an der Plasmamembran von SM erzeugt geregelt - über einem bestimmten Niveau der Prozess tritt normalerweise nicht auf, und die Zellen können die Läsionen nicht entfernen.
Sphingomyelinase hinaus umgeht das Erfordernis für Ca 2 + in der Plasmamembran zu reparieren.
Bemerkenswert ist, neben der bakteriellen SM-Zellen durch SLO in Abwesenheit von Ca 2 + (in der Regel ein Zustand, der nicht zulässt, dass Zellwiederverschließen) auch gerettet Plasmamembran Reparatur permeabilisiert. (2A und 2B), wie in Zellen, die porenbildende Toxin in Gegenwart von Ca 2 + ausgesetzt gesehen (Fig. 1B und 1C), waren nur geringe Konzentrationen von SM bei der Blockierung Zustrom von FM1-43. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Sphingomyelinase Funktionen abwärts des Ca 2 +-abhängigen Schritt der Plasmamembran zu reparieren. Dieser Befund steht in vollem Einklang mit unserer bisher vorgeschlagenen Modell, das besagt, dass Ca 2 + durch Trans Poren fließt löst Exozytose von Lysosomen und ASM Mitteilung, die spaltet Sphingomyelin auf der äußeren Blatt der Plasmamembran, die Erzeugung und die Förderung der Ceramid Poren Entfernung durch Endozytose 22 , 19. Die Tatsache, dass die Zugabe von gereinigtem SM umgeht die Notwendigkeit für Ca 2 + stark verstärkens die Ansicht, daß unter physiologischen Bedingungen Ca 2 +-regulierte Exozytose von Lysosomen ist die Quelle der Sphingomyelinase-Aktivität erforderlich ist, um Endozytose fördern.
Fig. 1 ist. Bacillus cereus Sphingomyelinase (SM) die Plasmamembran-Reparaturdefekt von Zellen für die Expression der sauren Sphingomyelinase (ASM) durch die porenbildende Toxin Streptolysin O (SLO). HeLa-Zellen, die mit Kontroll-siRNA oder ASM siRNA behandelt Oligos verwundet Schweigen ergänzen wurden in Abwesenheit oder Gegenwart von Ca 2 +-Einstrom und der lipophilen Farbstoff FM1-43 wurde bei 1 Bild / 3 Sek. 4 Minuten abgebildet verwundet. FM1-43 intrazelluläre Fluoreszenz wurde mit Volocity Software quantifiziert und ausgedrückt als fachen Anstieg in der Fluoreszenzintensität über die Zeit. (A) in die Abwesenheit von Ca 2 +, sowohl Kontroll-siRNA und ASM-siRNA-behandelten Zellen wurden durch SLO permeabilisiert. 18-27 Zellen wurden in jedem Zustand analysiert;. Fehlerbalken entsprechen dem Mittelwert + / - SEM (B) In Anwesenheit von Ca 2 + wurden die Zellen mit Control siRNA behandelt der Lage, ihre Plasmamembran wieder zu verschließen und zu stoppen Zustrom färben, während Zellen mit siRNA behandelt ASM nicht zu verschließen. Zusätzlich in Gegenwart von Ca 2 +, die exogene Zugabe von niedrigen Dosen von Sphingomyelinase ergänzt die Plasmamembran Defekt ASM siRNA-behandelten Zellen. 18 bis 62 Zellen wurden in jedem Zustand analysiert, Fehlerbalken entsprechen dem Mittelwert + / - SEM (C) Ausgewählte Zeitrahmen des Films in B analysiert.. Bars, 9 um. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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2. Sphingomyelinase hinaus umgeht das Erfordernis für Ca 2 + in der Plasmamembran zu reparieren. HeLa-Zellen, die mit Kontroll-siRNA behandelt wurden, mit SLO in Abwesenheit von Ca 2 +-Einstrom und der lipophilen Farbstoff FM1-43 wurde bei 1 Bild / 3 Sek. 4 abgebildet verwundet Minute FM1-43 intrazelluläre Fluoreszenz wurde mit Volocity Software quantifiziert und ausgedrückt als fachen Anstieg in der Fluoreszenzintensität über die Zeit. (A) Das Fehlen der Plasmamembran Wiederverschließen normalerweise in Zellen mit SLO verletzt in Abwesenheit von Ca 2 + gesehen wird durch die exogene Zugabe umgekehrt von niedrigen Dosen von Sphingomyelinase. 18-31 Zellen wurden in jedem Zustand analysiert, Fehlerbalken entsprechen dem Mittelwert + / - SEM (B) Ausgewählte Zeitrahmen des Films in A analysiert.. Bars, 9 um.g2large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.
3. Vorgehensweise Timeline. Zeitleiste für die experimentellen Schritte in dem Verfahren beteiligt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
| Ca2 +-Zustand | Ca2 +-freien Zustand | SLO-Toxin | Warm Lösung A | Warm Lösung B | Sphingomyelinase | Vorgehensweise Schritt |
| + | - | - | + | - | - | 3.2 |
| - | + | - | - | + | - | 3.7 |
| + | - | + | + | - | - | 3.8 |
| - | + | + | - | + | - | 3.8 |
| + | - | - | + | - | - | 3.9 |
| - | + | - | - | + | - | 3.9 |
| + | - | + | + | - | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | + | 3.10 |
| + | - | + | + | - | + | 3.10 |
Tabelle 1. Zusammensetzung der Lösungen für die Versuchsdurchführung eingesetzt. Proben, wie in dem Verfahren beschrieben werden, die in Zeilen aufgelistet. Spalten zeigen die Gegenwart (+) oder Abwesenheit (-) von der genannten Komponente (Oligo, Ca 2 + oder Ca 2 +-freien Medium, SLO, Lösung A oder B, Sphingomyelinase). Die experimentellen Schritte, in denen diese Proben werden zunächst für Live-Cell-Imaging in der Vorgehensweise Abschnitt 3 verwendet werden angezeigt.
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Discussion
Frühere Studien über mechanische Verletzungen und Plasmamembran Reparatur verließ sich auf vielfältige Mechanismen der Zellen zu verletzen, die von Fallenglasperlen, Mikropipettiervorrichtung, Scheren, Kratzen oder Schaben. Das Auslesen von all diesen Tests war eher qualitative als quantitative und hat genaue Informationen über die Kinetik der Reparaturmechanismus nicht geben. Die Fähigkeit von Zellen, die Plasmamembran nach dieser Formen von Verletzungen verschließen wurde durch die Anwesenheit oder Abwesenheit von Tracer an die extrazelluläre Flüssigkeit in das Zytoplasma, das Eindringen der Membran undurchlässig Farbstoffe, Verlust der cytosolischen Enzyme ATP-Spiegel, oder langfristigen Mehr gemessen Zellüberlebens. Obwohl mehrere dieser Assays quantitativ durchgeführt werden, ein großes Hindernis in diesen Studien war die Schwierigkeit, die Synchronisation der Verwundung Veranstaltung, während rasch die Beurteilung der Kinetik der Wiederverschließen auf Einzelzellebene.
Die Entwicklung und der Einsatz von UV-Laser Schädigung der Muskelfasern foldurch den Nachweis der Zustrom der lipophilen Farbstoff FM1-43 heiraten war ein großer Fortschritt in diesen Studien 17,20. Anstelle des Brutto Schäden an der gesamten Zellpopulation durch Schaben oder ähnliche mechanische Verletzungen zugefügt, führte diese Tests eine definierte Weg, um Zellen, die Einzelzellanalyse erlaubt gewickelt. Jedoch blieb mehrere Probleme in solchen Assays. Die Größe des Laser-induzierten Läsionen ist groß und sehr variabel in Abhängigkeit von der Laserintensität und sehr unterschiedlicher Natur sind als die Formen der Membran Verletzungen, die während physiologischen Bedingungen auftreten. Ein weiteres Problem ist, dass nur eine Zelle oder Muskelfaser kann zu einem Zeitpunkt, der Mikroskop-assoziierten Laser, Verringerung der Zahl der Wiederverschließen Ereignisse, die verfolgt werden kann die statistische Signifikanz der Ergebnisse verwundet werden und so. Diese Probleme mit der Reproduzierbarkeit und Probenahme die Nützlichkeit der Laserschäden stark reduziert als eine Methode, die Mechanismen der Plasmamembran Reparatur zu untersuchen.
To diese Probleme anzugehen, haben wir eine neue Live-Cell-Imaging-Test, um genau die Reparatur Kinetik der Plasmamembran Läsionen durch bakterielle porenbildende Toxine verursacht messen. Dies ist eine Form der Schädigung, die häufig in der Natur vorkommt, da viele Mikroorganismen besitzen zahlreiche Giftstoffe, die in der Lage ist Permeabilisierung der Membran der eukaryontischen Zellen. Dieser Assay kann präzise durch Vorinkubation der Zellen mit dem Toxin bei niedrigen Temperaturen synchronisiert werden, und ermöglicht eine große Anzahl von Zellen in einem mikroskopischen Feld für Zustrom von FM1-43 analysiert werden, da die Temperatur erhöht wird, um die Porenbildung auslösen.
Die exakte Synchronisation Porenbildung mit diesem Assay erzielt erlaubt reproduzierbare Messungen der Plasmamembran Reparatur Kinetik, die gleichzeitig in mehreren einzelnen Zellen innerhalb des mikroskopischen Bereich quantifiziert werden können. Ein wichtiger technischer Faktor in diesen Assays ist die Qualität des Mikroskopobjektivlinse zur Bilderzeugung verwendet werden. Ter 40X NA 1.3 (Nikon) Ziel unserer Tests verwendet werden können für eine ausreichende Probenahme von Zellen in einer Population, ohne dass die Bildauflösung. Der Wechsel zu einem 10X-Objektiv einen größeren Stichproben der Zellpopulation zu ermöglichen, aber die Auflösung, die erreicht wird, nicht ausreichend für eine genaue Quantifizierung von intrazellulären FM1-43 ist. Ein entscheidender Schritt für diese lebenden Zellen-Assay ist die Verwendung von PerfectFocus oder einer ähnlichen Vorrichtung, um eine thermische Drift zu korrigieren. Unser Verfahren erfordert vorge Bindung von bakteriellen porenbildenden Toxins an Zellen auf Eis und dann Verschieben der Temperatur schnell auf 37 ° C für lebenden Zellen. Diese Temperatur Anpassung axialen Fokus Schwankungen während der Bildaufnahme Zeitraum verursachen, und muss korrigiert werden. PerfectFocus oder eine ähnliche Vorrichtung wird dieses Problem so lebenden Zellen eines ausgewählten Brennebene über längere Zeit zu korrigieren, so dass eine präzise Quantifizierung der Plasmamembran Reparatur Kinetik.
Ein Schlüssel zumDer Erfolg dieses Tests ist es, immer Titer unterschiedlichen Konzentrationen des Vorform Toxin reparierbare und nicht reparatur Dosen zu bestimmen, da diese für jede Charge von Toxin variieren. Die Aktivität der viele Giftstoffe und der SLO insbesondere ist temperaturempfindlich und mehrere Gefriert taut Zyklen sind schädlich für seine Tätigkeit. , Neben Titrationen in jedem Experiment durchgeführt, ermöglichen jedoch die richtige Dosis Gift genau in nur ein paar Minuten von Zeitraffer-Bildgebung bestimmt werden.
Dieser Test beruht auf dem Nachweis von ausreichender intrazellulärer FM1-43-Fluoreszenz nach der Plasmamembran Verletzung. Dies kann unter bestimmten Bedingungen einschränken. Nach dem Einsetzen in Membranen SLO Formen Poren mit einem Durchmesser von etwa 30 nm, was eine robuste Ca 2 +-Einstrom und eine schnelle Plasmamembran Reparaturreaktion in eukaryotischen Zellen. Jedoch porenbildenden Toxinen, die kleiner Läsionen, wie Aerolysin und lysenin, die Porendurchmesser von ungefähr haben bilden1-3 nm 23-25 Mai nicht angemessen, für diesen Test, da sie nicht ausreichend in Ca 2 + und FM1-43 Zustrom führen.
Selbst mit einem Toxin, das große Poren wie SLO erzeugt, ist es wichtig zu beachten, dass dieser Test nicht Bildgebung zur absoluten Quantifizierung der Fluoreszenzintensität zu ermöglichen, sondern relative Fluoreszenz. Somit ist es kritisch, daß innerhalb des Abbildungs intrascene Dynamikbereich der Kamera durchgeführt. Da die Fluoreszenzintensität durch Laserleistung, Belichtungszeit und Kameraverstärkung betroffen sind, ist es wichtig, diese drei Parameter zu Beginn eines jeden Versuchs, umgeben von vorher im Bildgebung von Zellen mit FM1-43 und SLO sowohl in der Reparatur und nicht behandelt Reparaturbedingungen (Ca 2 + oder Ca 2 +-freiem Medium). Dies ermöglicht die Wahl der Bildaufnahmeeinstellungen, die Fluoreszenz-Detektion erlauben zum Zeitpunkt Null (vor SLO-Zugabe), aber nicht in der Detektorsättigung führen (wie determper Software auslesen) am Ende der Erwerb unter nicht-Reparaturbedingungen INED.
Unter Verwendung dieses Tests konnten wir zeigen, daß SLO Poren sind von der Plasmamembran von Säugerzellen in weniger als 30 sec entfernt, was zeigt, dass dieses Verfahren eine schnelle Kinetik ähnlich der Reparatur von mechanischen Verletzungen 16. Nachfolgende Untersuchungen zeigten, dass das lysosomale Enzym ASM zur Plasmamembran Reparatur erforderlich ist, und zur Wiederherstellung Wiederverschließen, wenn extrazellulär ASM-defizienten Zellen 19 aufgenommen. In der vorliegenden Studie nutzten wir die Empfindlichkeit der FM1-43 Zustrom Test, um zu zeigen, zum ersten Mal, kann das Plasmamembran Reparatur auch in Abwesenheit von extrazellulärer Ca 2 + auftreten. Die Exposition von verwundeten Zellen rekombinante Sphingomyelinase war ausreichend, um zu fördern Wiederverschließen in Zellen durch SLO permeabilisiert in Ca 2 +-freiem Medium, ein Zustand, in der Regel nicht permissiv für Plasmamembran Reparatur. Interessanterweise ergänzenUmsetzung der Plasmamembran-Reparaturfähigkeit wurde nach Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von Sphingomyelinase beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Menge von Ceramid durch dieses Enzym auf dem äußeren Blatt der Plasmamembran erzeugt wird, eine wichtige Determinante der Läsion Entfernungsprozess. Dieser Befund zeigt, dass Ca 2 + ist notwendig, um die lysosomale Exozytose Schritt auslösen, ist aber nicht für die Sphingomyelinase-induzierte Endozytose, die für Wund Internalisierung verantwortlich ist erforderlich.
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Disclosures
Die Autoren erklären, sie haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse R37 und R01 AI34867 GM064625 zu NWA Wir danken Dr. R. Tweten von der Universität von Oklahoma für die SLO-Expressionsplasmid unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
| FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
| Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
| Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
| SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
| Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
| Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
| 35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
| Material | |||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
| Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
| Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
| Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber | |
References
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