Live-Imaging-Assay für die Bewertung der Rollen von Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sphingomyelinase und in der Reparatur von Pore Toxin-bildenden Wunden

Zusammenfassung

Echtzeit-Bildgebung von Zellen mit dem lipophilen Farbstoff FM1-43 ausgesetzt ermöglicht eine präzise Bestimmung der Kinetik durch die porenbildende Toxine sind von der Plasmamembran entfernt. Dies ist ein empfindlicher Test, der verwendet werden kann, um Anforderungen für die Ca ^{2 +,} Sphingomyelinase und anderen Faktoren auf die Plasmamembran Reparatur zu beurteilen.

Zusammenfassung

Plasma-Membran-Verletzung ist ein häufiges Ereignis, und Wunden müssen schnell repariert, um zelluläre Überleben zu gewährleisten. Einstrom von Ca ^{2 +} ist ein Schlüsselsignalisierungsereignis, das die Reparatur von mechanischen Verletzungen an der Plasmamembran innerhalb von ~ 30 s auslöst. Jüngste Studien zeigten, dass Säugerzellen ihrer Plasmamembran nach Permeabilisierung mit porenbildenden Toxinen in einem Ca ^{2 +-abhängigen} Prozess, der Exozytose des lysosomalen Enzyms saure Sphingomyelinase, gefolgt von Poren Endocytose beinhaltet auch wieder zu verschließen. Hier beschreiben wir die Methodik, um zu zeigen, dass das Wiederverschließen der Zellen durch das Toxin Streptolysin O permeabilisiert ist auch eine schnelle und abhängig von Ca ^{2 +-Einstrom.} Der Assay-Design ermöglicht die Synchronisation der Verletzungsanlaß und eine genaue kinetische Messung der Fähigkeit von Zellen, Plasmamembranintegrität von Abbildungs ​​wiederherzustellen und Quantifizieren des Ausmaßes, mit dem die lipophilen Farbstoff FM1-43 intrazellulären Membranen erreicht. Diese Live-Test ALSo ermöglicht eine sensible Bewertung der Fähigkeit von exogen zugesetzten löslichen Faktoren wie Sphingomyelinase FM1-43 Einstrom hemmen, was auf die Fähigkeit von Zellen, die Plasmamembran zu reparieren. Dieser Assay erlaubt uns zum ersten Mal zeigen, dass Sphingomyelinase wirkt abwärts von Ca ^{2 +-abhängigen} Exozytose, da extrazelluläre Zugabe des Enzyms fördert Wiederverschließen der Zellen in der Abwesenheit von Ca ^{2 +} durchlässig gemacht.

Einleitung

Es ist seit mehreren Jahrzehnten bekannt, dass die Plasmamembran-Reparatur nach mechanischen Verletzungen ist ein Ca ^{2 +-abhängigen} Prozess ^1,2. Spätere Studien zeigten, dass Ca ^{2 +-Einstrom} durch die Wunde löst eine kräftige Prozess der Exozytose von intrazellulären Vesikeln an der Stelle der Verletzung, die zum Wiederverschließen ^3,4 erforderlich ist. Die Verlustrate der Fluoreszenzfarbstoff in das Zytoplasma der Zellen geladen wurde verwendet, um die Geschwindigkeit der Reparatur zu beurteilen und festgestellt, dass Wiederverschließen wurde innerhalb von <30 sec nach der Verletzung ⁵ abgeschlossen. Zwei Modell....

Protokoll

1. Transkriptions Silencing von ASM

1. Samen 1,5 x 10 ⁵ HeLa-Zellen in 2 ml DMEM Wachstumsmedium (DMEM mit hohem Glucose mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1% Penn-Strep) auf 35 mm Glasbodenschalen (MatTek) und Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in einem 5% CO _2-Inkubator.
2. Am folgenden Tag, absaugen dem Wachstumsmedium und ersetzen Sie es mit 2 ml DMEM reduziert Serummedium (DMEM mit 4% FBS), mindestens 1 Stunde vor der Zugabe der siRNA-Transfektion Mischung.
3. Bereiten 4 Röhren für die siRNA-Transfektion Oligo-Mischung. In Röhren A und C, fügen Sie 250 ul Optimem reduziert Serum und 4 ul Lipofectamine RN....

Ergebnisse

Niedrige Konzentrationen von bakteriellen Sphingomyelinase (SM) Rettungsplasmamembran-Reparatur in Zellen in lysosomalen sauren Sphingomyelinase erschöpft.

Verwendung der FM1-43 Abbildungsassay wir früher gezeigt, dass Zellen defizient für das lysosomale Enzym ASM und SLO ausgesetzt Verwundung in Gegenwart von Ca ^{2 +} über einen Plasmamembran-Defekt wird durch extrazelluläre Zugabe des rekombinanten menschlichen Enzyms ¹⁹ gerettet. Da das humane lysosomale ASM hat einen nie.......

Diskussion

Frühere Studien über mechanische Verletzungen und Plasmamembran Reparatur verließ sich auf vielfältige Mechanismen der Zellen zu verletzen, die von Fallenglasperlen, Mikropipettiervorrichtung, Scheren, Kratzen oder Schaben. Das Auslesen von all diesen Tests war eher qualitative als quantitative und hat genaue Informationen über die Kinetik der Reparaturmechanismus nicht geben. Die Fähigkeit von Zellen, die Plasmamembran nach dieser Formen von Verletzungen verschließen wurde durch die Anwesenheit oder Abwesenheit von Tra.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenz
HeLa 229 Zelllinie	ATCC	CCL2-1
DMEM Invitrogen mit hohem Glukosegehalt		11965
DMEM mit hohem Glukosegehalt ohne Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem reduziertes Serum	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
Kontrollmedium GC-Gehalt RNAi Oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi Oligo	Invitrogen	HSS143988
Fötales Rinderserum Hitzeinaktivierte	Gemini-Bioproducts	100-106
Sphingomyelinase aus Bacillus cereus	Sigma	S7651
35 mm-Glasbodenschüsseln	MatTek	P35G-0-14
Material
Inverses Mikroskop	Nikon	Eclipse Ti
Kamera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Konfokales Spinning-Disk-Mikroskop	PerkinElmer	UltraViewVoX
Software-Analyse Software	PerkinElmer	Volocity Suite
Klimakammer	Pathologiegeräte	LiveCell System Kammer