Summary
Formación de imágenes en vivo de las células expuestas a la colorante lipófilo FM1-43 permite la determinación precisa de la cinética por el cual las toxinas formadoras de poros son retirados de la membrana plasmática. Este es un ensayo sensible que puede ser utilizado para evaluar las necesidades del Ca 2 +, esfingomielinasa y otros factores en la reparación de la membrana de plasma.
Abstract
Lesión de la membrana de plasma es un evento frecuente, y las heridas que ser reparado rápidamente para asegurar la supervivencia celular. La afluencia de Ca 2 + es un evento de señalización clave que desencadena la reparación de heridas mecánicas en la membrana plasmática dentro de ~ 30 seg. Estudios recientes revelaron que las células de mamíferos también vuelven a sellar su membrana plasmática después de la permeabilización con formador de poros toxinas en un proceso de 2 +-dependiente de Ca que implica la exocitosis de la esfingomielinasa ácida enzima lisosomal seguido por endocitosis de poro. Aquí se describe la metodología utilizada para demostrar que el resellado de las células permeabilizadas por la toxina estreptolisina O también es rápida y dependiente de Ca 2 + afluencia. El diseño del ensayo permite la sincronización del evento lesión y una medición cinética precisa de la capacidad de las células para restaurar la integridad de la membrana de plasma mediante formación de imágenes y la cuantificación de la medida por la que el colorante liphophilic FM1-43 llega a las membranas intracelulares. Este vivo als ensayoO permite una evaluación sensible de la capacidad de exógenamente añadido factores solubles tales como la esfingomielinasa para inhibir FM1-43 afluencia, que refleja la capacidad de las células para reparar su membrana plasmática. Este ensayo nos permitió demostrar por primera vez que la esfingomielinasa actúa aguas abajo de Ca 2 +-dependiente de la exocitosis, ya que la adición de la enzima extracelular promueve resellado de las células permeabilizadas en ausencia de Ca 2 +.
Introduction
Se ha sabido durante varias décadas que reparación de la membrana de plasma después de la lesión mecánica es un 1,2 Ca 2 +-dependiente proceso. Estudios posteriores mostraron que el Ca 2 + afluencia a través de la herida desencadena un proceso vigoroso de la exocitosis de las vesículas intracelulares en el sitio de la lesión, que se requiere para volver a sellar 3,4. Se utilizó la tasa de pérdida de un colorante fluorescente cargado en el citoplasma de las células para evaluar la velocidad de la reparación, y llegó a la conclusión de que el resellado se completó dentro de <30 seg después de la lesión 5. Dos modelos fueron propuestos inicialmente para explicar la necesidad de la exocitosis en la reparación de la membrana plasmática: 1) el modelo de "parche", lo que sugiere que el Ca 2 + afluencia través de la lesión desencadena la fusión inicialmente homotípica de vesículas intracelulares, formando un "parche" de gran tamaño que haría a continuación, ser aplicada a la membrana plasmática para volver a sellar la herida 6 y 2) el modelo de reducción de la tensión, que propuso que la membrana Added por Ca 2 +-dependiente de la exocitosis en las proximidades de la herida reduciría de plasma tensión de la membrana, facilitando de resellado de la bicapa de 7. El papel de la Ca 2 +-desencadenó la exocitosis en la reparación de la membrana plasmática se ve reforzada por estudios que muestran que los lisosomas contienen una molécula de Ca 2 + sensor, sinaptotagmina VII, lo que facilita su exocitosis y reparación de la membrana plasmática de las células lesionadas 8,9,10,11 .
Sin embargo, la evidencia adicional ha indicado que la exocitosis por sí sola no era suficiente para promover la reparación de la membrana de plasma. Además de lágrimas mecánicas en la membrana plasmática, una forma frecuente de lesión de las células es la permeabilización por las toxinas formadoras de poros producidos por bacterias o células inmunes 12,13 14,15. A diferencia de las lágrimas mecánicas, proteínas formadoras de poros se insertan en la membrana plasmática que forma un poro estable, proteína forrado de que no se puede volver a cerrarse simplemente mediante la aplicación de un "parche" de la membrana o por reduccióning tensión de la membrana. Curiosamente, los estudios revelaron que las células de mamífero tienen un mecanismo eficiente para reparar su membrana plasmática después de la permeabilización con proteínas formadoras de poros, y este proceso también requiere la presencia de Ca2 + extracelular 12. Este hallazgo plantea la cuestión de si la supresión de poro transmembrana de la superficie celular era también un proceso rápido, como se observa con heridas mecánicas 5. Sorprendentemente, nuestros estudios recientes revelaron que el resellado de las células permeabilizadas con toxinas formadoras de poros tiene propiedades muy similares a la reparación de heridas mecánicas: el proceso requiere extracelular de Ca 2 +, y se completa dentro de ~ 30 seg. La investigación de este proceso con más detalle, recientemente hemos aprendido que, además de Ca 2 +-exocitosis regulada de los lisosomas, reparación de la membrana plasmática implica una forma rápida de la endocitosis, que se activa por la liberación de la enzima lisosomal esfingomielinasa ácida (ASM) y es esencial no sólo para the eliminación de poros transmembrana, sino también para la reparación de heridas mecánicas 16.
Para determinar la cinética de resellado celular después de la permeabilización con proteínas formadoras de poros, en nuestro laboratorio hemos adaptado una metodología de formación de imágenes en vivo que se había utilizado previamente para evaluar el resellado de las fibras musculares aisladas de láser-heridos 17. Este ensayo se basa en las propiedades del colorante lipófilo FM1-43, que se intercala de manera estable en el prospecto exterior de las bicapas de lípidos que aumentan en intensidad de fluorescencia. Cuando la membrana bicapa de plasma se interrumpe ganancias de tinte extracelular acceso a membranas intracelulares, proporcionando un ensayo sensible para detectar lesión de la membrana plasmática y reparar 18,16,19,20. Para adaptar este ensayo para la evaluación de resellado celular después de la permeabilización con proteínas formadoras de poros, que las células pre-incubaron a 4 ° C con la toxina bacteriana estreptolisina O (SLO), que se une al colesterol de la membrana 21. Celular síncronopermeabilización puede entonces lograrse fácilmente moviendo las células de hielo para calentar medio en una platina de microscopio calentado, que activa la oligomerización y cambio en la conformación que conduce a la formación de poros transmembrana. Una ventaja de este enfoque, en los ensayos previamente publicados utilizando heridas láser, es que un mayor número de células puede analizarse simultáneamente en un campo microscópico, proporcionando una mejor toma de muestras de la población celular. Dadas las similitudes mecánicas entre el proceso de resellado de células visto después de la lesión mecánica y la permeabilización con toxinas formadoras de poros, el ensayo como se describe aquí proporciona un método muy versátil y potente para factores implicados en el proceso fundamental de la reparación de la membrana de plasma de disección. Como un ejemplo, se muestra que es posible usar este ensayo para identificar los pasos de Ca 2 + dependientes e independientes del proceso de reparación.
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Protocol
1. Transcripcional silenciamiento de la ASM
- Semilla de 1,5 x 10 5 células HeLa en 2 ml de medio de crecimiento DMEM (DMEM alto en glucosa con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina, 1% de Penn-Strep) en platos inferior 35 mm de vidrio (MatTek) y incubar durante la noche a 37 ° C en el 5% de CO 2 incubadora.
- Al día siguiente, aspirado fuera de los medios de crecimiento y reemplazarlo con 2 ml de DMEM medio de suero reducido (DMEM con FBS al 4%), al menos 1 hora antes de añadir la mezcla de transfección de ARNsi.
- Prepare 4 tubos para la mezcla de transfección siRNA oligo. En los tubos A y C, añadir 250 l de Optimem reducida suero y 4 l de Lipofectamine RNAiMax, por 35 mm de plato a ser transfectadas. En el tubo B, añadir 250 l de Optimem reducen el suero y 8 l (160 pmoles) de control de contenido GC medio oligo (Control siRNA), por placa de 35 mm a transfectar. En el tubo D, añadir 250 l de Optimem reducen el suero y 8 l (160 pmoles) de SMPD1 oligo (siasmo), por placa de 35 mm to ser transfectadas. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 5 min.
- Combinar los tubos A y B para formar el complejo de transfección de ARNsi de control, y los tubos C y D para el ASM ARNsi. Se incuban las reacciones a temperatura ambiente durante 20 min.
- Añadir las mezclas de reacción de transfección siRNA control y ASM siRNA lentamente, gota a gota, en los platos de fondo de 35 mm de vidrio respectivas y se incuba a 37 ° C / 5% CO 2. A las 24 h después de la transfección, aspirar suavemente de los medios de comunicación y reemplazar con medio de cultivo fresco DMEM. Para knockdown ASM eficiente, los platos deben ser incubadas a 37 ° C / 5% CO 2 durante aproximadamente 31 horas (total 55 horas) antes de imágenes en directo.
2. Preparación de los reactivos para Live Microscopía
- Preparar una solución de toxina de formación de poros recombinante estreptolisina O (SLO) a una concentración de 100 ng / l en frío 1x PBS sin Ca2 + y Mg2 +. La SLO utilizado en estos ensayos es un constitutively mutantes cisteína activa que no requiere agentes para reducir la actividad, proporcionado amablemente por Dr. Rod Tweten de la Universidad de Oklahoma. La toxina se expresó en E. coli BL21 DE3 y se purificó en condiciones nativas, como se ha descrito previamente 16.
- Preparar la solución de stock FM1-43: Resuspender FM1-43 polvo liofilizado en DMSO para crear una solución 25 mM.
- Preparar Solución A: Se diluye la solución madre FM1-43 en DMEM frío con Ca 2 + a una concentración final de 4 mM (se necesitan 1,5 ml por plato de MatTek) y almacenar en hielo hasta que se necesite.
- Preparar la solución B: Diluir la solución madre FM1-43 en DMEM frío sin Ca mM de EGTA 2 + y 10 (Ca 2 +-DMEM libre) a una concentración final de 4 M (1,5 ml necesarios por plato MatTek) y almacenar en hielo hasta necesaria.
- Pre-caliente (37 ° C) alícuotas de 1 ml de Solución A y Solución B en tubos Eppendorf.
- Mantenga las soluciones de hielo de DMEM con Ca 2 +, y Cun DMEM 2 + libre.
3. Imágenes de células vivas de FM1-43 La afluencia en SLO células tratadas y no tratadas
- Llenar un tamaño medio contenedor de metal poco profunda con hielo picado, invertir en un recipiente de vidrio grande con hielo, y añadir hielo adicional dejando sólo la superficie del fondo del recipiente metálico expuesto. Coloque una toalla de papel húmeda en la parte inferior de metal expuesto para permitir la transferencia térmica uniforme.
- Tome un plato MatTek tratados con siRNA control (muestra 1) y colóquela sobre la toalla de papel húmeda y fría. Se aspira suavemente fuera todos los medios y lavar 3 veces con frío Ca 2 + libre de DMEM. Después del último lavado, aspirado de todos los medios de comunicación en el plato.
- Para la imagen asociada a la célula FM1-43 en las células no herida con SLO (Muestra 1) en la presencia de Ca 2 +, añadir 180 l de solución fría B al cubreobjetos de vidrio centro de la placa inferior de 35 mm de vidrio y se incuba durante 5 min en hielo (Tabla 1). Coloque el plato MatTek en el escenario de un microscopio confocal calentado a 37 ° C y equipado con una cámara ambiental (que mantiene la temperatura, humedad y niveles de CO 2). Encontrar el campo de las células que serán fotografiadas mirando a través de un 40X NA 1.3 objetiva (Nikon). Si está disponible, active PerfectFocus o un dispositivo similar para corregir la deriva térmica.
- Añadir 1 ml de solución A precalentado suavemente a un lado de la placa de 35-mm y reemplace la tapa de la cámara ambiental (Tabla 1).
- Adquirir imágenes de 4 min a 1 fotograma cada 3 s utilizando el software de imagen apropiada (Volocity en el sistema de hilatura de microscopía confocal de disco UltraView Vox Perkin Elmer). La excitación de FM1-43 se lleva a cabo con una línea de láser de 488 nm utilizando un filtro dicroico con un paso de banda de 488 nm, y la discriminación de emisiones se logra a través del uso de un filtro 527 (W55) de emisión. Niveles de potencia láser y sensibilidad de la cámara se ajustan para lograr la exposición de imagen de 100 ms.
- Repita los pasos 3.2 a 3.6 para detectar FM1-43 en las células tratadas con siRNA control sin herir SLO (muestra 2) en ausencia de Ca 2 +, excepto que en el paso 3.5 Solución B debe añadirse (Tabla 1).
- Para medir FM1-43 afluencia en las células tratadas con ARNsi de control heridos con SLO ya sea en la presencia (muestra 3) o ausencia de Ca 2 + (Muestra 4), añadir 180 l de solución fría de SLO B que contiene al cubreobjetos de vidrio centro de la 35 mm de plato con fondo de cristal y se incuba durante 5 min en hielo como en el paso 3.3. Repetir los pasos 3.2 a 3.6; ajustar la adición de cualquiera de las soluciones A o la solución B en el paso 3.5 (Tabla 1).
- Para determinar el papel de la ASM en reparación de la membrana de plasma, repita los pasos 3.2 a 3.6 usando células siRNA tratados con ASM para todas las condiciones (Muestras 5-8) (Tabla 1).
- Para determinar el papel de la esfingomielinasa recombinante extracelular (SM) en lacinética de la reparación de la membrana plasmática (reflejados por la inhibición de FM1-43 afluencia) (muestras 9-10), se añade SM (0-50 mU) a cualquier solución A o la solución B en el paso 3.5 y luego añadieron a las células durante la células vivas formación de imágenes en un volumen total de 1 ml (Tabla 1).
4. Cuantificación de FM1-43 Afluencia en células
- Después de las películas han sido adquiridos, medir la intensidad de la fluorescencia intracelular de FM1-43 utilizando el software de análisis de imágenes (Volocity Suite, PerkinElmer). Dibujar una región de interés en la región citosólica de cada celda en el campo y aplicar las herramientas de software para determinar la intensidad de fluorescencia FM1-43 media a lo largo de todos los fotogramas de vídeo.
- Para ajustar las variaciones en el FM1-43 tinción inicial, los datos de cada vídeo se expresan como aumento veces en la intensidad de la fluorescencia con el tiempo, y se representaron gráficamente para cada condición diferente. El aumento de veces en la fluorescencia de cada punto de tiempo individual porde células se calcula como F V / F 0, donde F T es la fluorescencia media en el punto de tiempo específico, y F 0 es la fluorescencia media en el momento t = 0 (figuras 1-2).
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Representative Results
Las bajas concentraciones de reparación de la membrana plasmática esfingomielinasa (SM) de rescate de bacterias en las células agotadas en esfingomielinasa ácida lisosomal.
Usando el ensayo de formación de imágenes FM1-43, que anteriormente mostró que las células deficientes para el ASM enzima lisosomal y expuestos a SLO hiriendo en la presencia de Ca 2 + tienen un defecto de membrana plasmática es rescatado por adición extracelular de la enzima humana recombinante 19. Desde el ASM lisosomal humana tiene un óptimo de pH bajo, se investigó si resellado también podría ser restaurada la adición de SM purificada a partir de Bacillus cereus (Sigma), que es completamente activa a pH neutro. Como se indica anteriormente, las células tratadas con ARNsi de control o los oligos ASM siRNA y expuestos a SLO en ausencia de Ca 2 + (condiciones no permisivas para la reparación) se permeabilizaron igualmente, que muestra que el agotamiento ASM no interfiera con la sensibilidad a la toxina (Figura 1A ). Curiosamente, una o rescate completof la capacidad de las células-ASM deficiente para volver a sellar después de la exposición al SLO se observó con concentraciones bajas de SM, 5 y 7,5 mU / ml (Figura 1B). A medida que aumentaba la concentración de enzima se añade al medio, hubo una pérdida gradual en el fenotipo de rescate - células expuestas a 10 mU / ml, sólo parcialmente bloqueada la afluencia de FM1-43 después de la exposición al SLO, y las células expuestas a 50 mU / ml mostraron un fuerte patrón de tinte de afluencia, lo que refleja un defecto de resellado completa similar a la observada en las células ASM-empobrecido (figuras 1B y 1C). Este resultado sugiere que la eliminación endocítica de SLO poros está estrechamente regulada por los niveles de ceramida generados en la membrana plasmática por SM - por encima de un cierto nivel el proceso no se produce normalmente, y las células no puede eliminar las lesiones.
Además esfingomielinasa no pasa por la exigencia de Ca 2 + en la reparación de la membrana plasmática.
Sorprendentemente, la adición de S bacterianaM a las células permeabilizadas por SLO en ausencia de Ca 2 + (normalmente una condición que no permite volver a sellar de células) también rescatado reparación de la membrana de plasma. Como se ve en las células expuestas a la toxina de formación de poros en la presencia de Ca 2 + (Figuras 1B y 1C), sólo bajas concentraciones de SM fueron eficaces en el bloqueo de afluencia de FM1-43 (Figura 2A y 2B). Estos resultados indican que las funciones de esfingomielinasa aguas abajo de la etapa de +-dependiente de Ca 2 de reparación de la membrana de plasma. Este hallazgo es plenamente compatible con nuestro modelo propuesto anteriormente, que postula que el Ca 2 + que fluye a través de poros transmembrana desencadena la exocitosis de lisosomas y liberación ASM, que escinde la esfingomielina en la cara externa de la membrana plasmática, lo que genera la ceramida y la promoción de la eliminación de los poros por endocitosis 22 , 19. El hecho de que la adición de SM purificado evita la necesidad de Ca 2 + fuertemente refuerzans la opinión de que bajo condiciones fisiológicas Ca 2 exocitosis regulada-+ de los lisosomas es la fuente de la actividad de la esfingomielinasa requerido para promover la endocitosis.
Figura 1. Esfingomielinasa Bacillus cereus (SM) puede complementar el defecto de reparación de la membrana plasmática de las células silenciados para la expresión de la esfingomielinasa ácida (ASM) heridos por la toxina formadora de poros estreptolisina O (SLO). Células HeLa tratadas con ARNsi de control o ASM siRNA oligos resultaron heridos en la ausencia o presencia de Ca 2 + y la afluencia del colorante lipófilo FM1-43 fue fotografiada en 1 cuadro / 3 s durante 4 min. FM1-43 fluorescencia intracelular se cuantificó utilizando el software Volocity y se expresó como incremento veces en la intensidad de la fluorescencia con el tiempo. (A) En ausencia de Ca 2 +, tanto de control de siRNA y las células tratadas con ARNsi ASM se permeabilizaron por SLO. Se analizaron 18-27 células en cada condición;. Barras de error corresponden a la media + / - SEM (B) En presencia de Ca 2 +, las células tratadas con ARNsi de control fueron capaces de volver a sellar su membrana plasmática y dejar de teñir afluencia, mientras las células tratadas con ASM siRNA no lograron cerrar de nuevo. Además, en la presencia de Ca 2 +, la adición exógena de las dosis bajas de la esfingomielinasa complementa el defecto de la membrana plasmática de las células tratadas con ARNsi ASM. Se analizaron 18-62 células en cada condición; barras de error corresponden a la media + / - SEM (C) seleccionado marcos de tiempo de la película analizado en B.. Bares, 9 m. Haz click aquí para ver más grande la figura .
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Figura 2. Además esfingomielinasa no pasa por el requisito de Ca 2 + en reparación de la membrana de plasma. Células HeLa tratadas con ARNsi de control fueron heridos con SLO en ausencia de Ca 2 + y la afluencia de colorante lipófilo FM1-43 fue fotografiada en 1 marco / 3 s durante 4 min. FM1-43 fluorescencia intracelular se cuantificó utilizando el software Volocity y se expresó como incremento veces en la intensidad de la fluorescencia con el tiempo. (A) La falta de la membrana plasmática de resellado normalmente se ve en las células lesionadas con SLO en ausencia de Ca 2 + se invierte mediante la adición exógena de dosis bajas de esfingomielinasa. Se analizaron 18-31 células en cada condición; barras de error corresponden a la media + / - SEM (B) seleccionado marcos de tiempo de la película analizó en un.. Bares, 9 m.g2large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver más grande la figura.
Figura 3. Línea de tiempo interno. Cronograma para las medidas experimentales que intervienen en el procedimiento. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
| Ca2 +-condición | Condiciones Ca2 + libre | Toxina SLO | Solución A Warm | Solución Warm B | Esfingomielinasa | Procedimiento Paso |
| + | - | - | + | - | - | 3.2 |
| - | + | - | - | + | - | 3.7 |
| + | - | + | + | - | - | 3.8 |
| - | + | + | - | + | - | 3.8 |
| + | - | - | + | - | - | 3.9 |
| - | + | - | - | + | - | 3.9 |
| + | - | + | + | - | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | + | 3.10 |
| + | - | + | + | - | + | 3.10 |
Tabla 1. Composición de las soluciones utilizadas en el procedimiento experimental. Muestras como se describe en el procedimiento se enumeran en filas. Las columnas indican la presencia (+) o ausencia (-) de la componente con nombre (oligo, Ca 2 + o Ca 2 +-medio libre, SLO, Solución A o B, esfingomielinasa). Las medidas experimentales en los que estas muestras se utilizaron por primera vez para imágenes de células vivas en el Procedimiento de la Sección 3 se indican.
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Discussion
Los primeros estudios sobre el daño y la membrana plasmática de reparación mecánica se basó en diversos mecanismos de las células hiriendo, que van desde dejar caer bolas de cristal, micropipeteo, esquila, rayaduras o arañazos. La lectura de todos estos ensayos fue de tipo cualitativo más que cuantitativo, y no dio información precisa sobre la cinética del mecanismo de reparación. La capacidad de las células para volver a sellar su membrana plasmática después de estas formas de lesión se midió por la presencia o ausencia de adición de marcadores para el fluido extracelular en el citoplasma, la penetración de colorantes impermeables de la membrana, la pérdida de enzimas citosólicas, los niveles de ATP, o a largo plazo la supervivencia celular. Aunque varios de estos ensayos se pueden realizar cuantitativamente, un obstáculo importante en estos estudios fue la dificultad de sincronizar el evento hiriendo, mientras que la evaluación rápida de la cinética de resellado en el nivel de células individuales.
El desarrollo y uso de la lesión UV-láser de fibras musculares Folloconducido por la detección de la afluencia de la colorante lipófilo FM1-43 fue un avance importante en estos estudios 17,20. En lugar del daño infligido bruto a toda la población de células mediante raspado o medios mecánicos similares de lesiones, estos ensayos introdujeron una manera más definida a la herida células que permitieron el análisis de células individuales. Sin embargo, varios problemas se mantuvieron en tales ensayos. El tamaño de las lesiones inducidas por láser es grande y muy variable dependiendo de la intensidad del láser, y muy diferente en la naturaleza de las formas de lesión de la membrana que se producen durante condiciones fisiológicas. Otro problema es que una sola célula o fibra muscular pueden ser heridos a la vez que utilizan rayos láser microscopio asociada, lo que reduce el número de resellado eventos que se pueden seguir, y por lo tanto la significación estadística de los resultados. Estos problemas con la reproducibilidad y de muestreo reducido en gran medida la utilidad de la lesión láser como un método para investigar los mecanismos de reparación de la membrana de plasma.
To resolver estos problemas, hemos desarrollado un nuevo ensayo de imágenes de células vivas para medir con precisión la cinética de reparación de lesiones en las membranas plasmáticas de las causadas por toxinas formadoras de poros bacterianas. Esta es una forma de lesión que se produce frecuentemente en la naturaleza, ya que muchos microbios poseen numerosas toxinas que son capaces de permeabilizar la membrana de las células eucariotas. Este ensayo se puede sincronizar con precisión por la pre-incubación de las células con la toxina a temperaturas bajas, y permite un gran número de células en un campo microscópico a ser analizada para afluencia de FM1-43, a medida que aumenta la temperatura para provocar la formación de poros.
La sincronización precisa de poro-formación alcanzado con este ensayo permite mediciones reproducibles de la cinética de reparación de la membrana de plasma, que se pueden cuantificar simultáneamente en varias células individuales dentro del campo microscópico. Un factor importante técnica en estos ensayos es la calidad de la lente objetivo del microscopio que se utiliza para la imagen. Tél 40X NA 1,3 (Nikon) objetivo usado en nuestros ensayos permite un muestreo suficiente de células en una población sin perder resolución de imagen. El cambio a un objetivo de 10X permitiría una muestra más grande de la población de células, pero la resolución que se logra es insuficiente para la cuantificación adecuada de intracelular FM1-43. Un paso crítico para este ensayo imágenes de células vivas es el uso de PerfectFocus o un dispositivo similar para corregir la deriva térmica. Nuestro procedimiento requiere pre-unión de la toxina bacteriana de formación de poros a las células en hielo y luego cambiando la temperatura rápidamente a 37 ° C para imágenes de células vivas. Este ajuste de la temperatura hará que las fluctuaciones de enfoque axiales durante el período de adquisición de imágenes, y debe ser corregido. PerfectFocus o un dispositivo similar se corregir este problema permitiendo imágenes de células vivas de un plano focal seleccionada durante largos períodos de tiempo, lo que permite la cuantificación precisa de la cinética de reparación de la membrana de plasma.
Una clave para lael éxito de este ensayo es siempre título de diferentes concentraciones de la toxina de pre-conformación para determinar las dosis reparables y no reparables, ya que esto puede variar para cada lote de toxina usado. La actividad de muchas toxinas, y de SLO, en particular, es sensible a la temperatura y múltiples de congelación-descongela ciclos son perjudiciales para su actividad. Sin embargo, las valoraciones realizadas al costado en cada experimento permiten la dosis correcta de toxinas que se determine con precisión en sólo unos pocos minutos de time-lapse.
Este ensayo se basa en la detección de la fluorescencia intracelular suficiente FM1-43 después de la lesión de la membrana plasmática. Esto puede ser limitante bajo ciertas condiciones. Después de insertar en las membranas de las formas de SLO poros con un diámetro de aproximadamente 30 nm, lo que permite robusto Ca 2 + afluencia y una respuesta rápida reparación de la membrana de plasma en células eucariotas. Sin embargo, las toxinas que se forman lesiones más pequeñas, tales como aerolisina y Lysenin que tienen diámetros de poro de aproximadamente de formación de poros1-3 nm may 23 a 25 no ser adecuado para este ensayo, ya que pueden dar lugar a insuficiencia de Ca 2 + y FM1-43 afluencia.
Incluso el uso de una toxina que genera poros grandes, tales como la SLO, es importante tener en cuenta que este ensayo de formación de imágenes no permite la cuantificación absoluta de la intensidad de fluorescencia, pero en lugar de fluorescencia relativa. Por lo tanto, es crítico que las imágenes se lleva a cabo dentro del rango dinámico intrascene de la cámara digital. Dado que la intensidad de fluorescencia se ve afectada por la potencia del láser, tiempo de exposición, y la ganancia de la cámara, es importante establecer estos tres parámetros en el comienzo de cada experimento, mediante la realización de imágenes preliminar de las células tratadas con el FM1-43 y de SLO en tanto la reparación y no -reparación condiciones (Ca 2 + o Ca 2 + libre de medianas). Esto permite la elección de la configuración de adquisición de imágenes que permiten la detección de fluorescencia a tiempo cero (antes de la adición de SLO) pero no conducen a una saturación del detector (como determINED por el software de lectura) en el extremo de adquisición en condiciones no de reparación.
Utilizando este ensayo, hemos sido capaces de demostrar que los poros de SLO se eliminan de la membrana plasmática de células de mamífero en menos de 30 segundos, lo que demuestra que este proceso tiene una rápida cinética similar a la reparación de heridas mecánicas 16. Estudios posteriores demostraron que se requiere la ASM enzima lisosomal para reparación de la membrana de plasma, y capaz de restaurar resellado cuando se añaden extracelularmente a células-ASM deficiente 19. En el presente estudio, nos aprovechamos de la sensibilidad del ensayo afluencia FM1-43 para mostrar, por primera vez, que la reparación de la membrana plasmática también puede ocurrir en ausencia de Ca2 + extracelular. La exposición de células heridos a esfingomielinasa recombinante fue suficiente para promover el resellado en células permeabilizadas por SLO en Ca 2 + medio libre, una condición que normalmente no permisivas para la reparación de la membrana plasmática. Curiosamente, compleción de la capacidad de reparación de la membrana de plasma no se observó después de la exposición a altas concentraciones de esfingomielinasa, lo que sugiere que la cantidad de ceramida generada por esta enzima en la cara externa de la membrana plasmática es un determinante importante del proceso de eliminación de la lesión. Este hallazgo demuestra que el Ca 2 + es necesario para activar el paso de la exocitosis lisosomal, pero no es necesario para la endocitosis inducida por esfingomielinasa-que es responsable de la internalización de la herida.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH R37 AI34867 y R01 GM064625 a NWA Agradecemos al Dr. R. Tweten de la Universidad de Oklahoma para el plásmido de expresión de SLO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
| FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
| Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
| Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
| SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
| Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
| Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
| 35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
| Material | |||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
| Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
| Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
| Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber | |
References
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