Summary
Imagerie en temps réel des cellules exposées au colorant lipophile FM1-43 permet une détermination précise de la cinétique par lequel les toxines formant des pores sont enlevés de la membrane plasmique. Il s'agit d'un test sensible qui peut être utilisée pour évaluer les exigences de Ca 2 +, la sphingomyélinase, et d'autres facteurs de réparation de la membrane plasmatique.
Abstract
Blessures de la membrane plasmatique est un événement fréquent, et les plaies doivent être réparés rapidement pour assurer la survie cellulaire. Influx de Ca 2 + est un événement de signalisation clé qui déclenche la réparation de plaies mécaniques de la membrane de plasma à l'intérieur ~ 30 sec. Des études récentes ont révélé que les cellules de mammifères reboucher aussi leur membrane plasmique après perméabilisation de formation de pores toxines dans un processus 2 +-dépendante Ca implique que l'exocytose de la sphingomyélinase acide enzyme lysosomale suivie pores endocytose. Ici, nous décrivons la méthodologie utilisée pour démontrer que la refermeture de cellules perméabilisées par la toxine Streptolysine O est aussi rapide et dépend influx de Ca2 +. Le design de dosage permet la synchronisation de l'événement de blessure et une mesure cinétique précise de la capacité des cellules à restaurer l'intégrité de membrane plasmique par l'imagerie et la quantification de la mesure dans laquelle le colorant lipophile FM1-43 atteint les membranes intracellulaires. Ce concert als essaio sensible permet une évaluation de la capacité des facteurs solubles ajouté de manière exogène, tels que la sphingomyélinase pour inhiber l'influx FM1-43, ce qui reflète la capacité des cellules à réparer leur membrane plasmique. Ce test a permis de montrer pour la première fois que la sphingomyélinase agit en aval de Ca 2 +-dépendante exocytose, puisque l'addition de l'enzyme extracellulaire favorise la refermeture de cellules perméabilisées en l'absence de Ca 2 +.
Introduction
Il est connu depuis plusieurs décennies que la réparation de la membrane plasmatique après une lésion mécanique est un 1,2 Ca 2 + de procédé dépendantes. Des études ultérieures ont montré que l'influx de Ca2 + à travers la plaie déclenche un processus dynamique de l'exocytose de vésicules intracellulaires au niveau du site de lésion, qui est nécessaire pour resceller 3,4. Le taux de perte d'un colorant fluorescent chargé dans le cytoplasme des cellules a été utilisé pour évaluer la vitesse de réparation, et a conclu que rescellement a été achevée à l'intérieur de <30 s après la lésion 5. Deux modèles ont d'abord été proposés pour expliquer la nécessité d'exocytose dans la réparation de la membrane plasmique: 1) le modèle de «patch», ce qui suggère que influx de Ca2 + à travers la lésion déclenche fusion initialement homotypique des vésicules intracellulaires, formant un grand "patch" qui serait ensuite être appliquée sur la membrane plasmique de refermer la plaie 6 et 2) le modèle de réduction de la tension, qui a proposé que la membrane Added par Ca 2 +-dépendante exocytose dans le voisinage de la blessure serait de réduire la tension de la membrane plasmatique, ce qui facilite refermeture de la double couche 7. Le rôle de Ca 2 + exocytose déclenchée dans le plasma réparation de la membrane a été renforcée par des études montrant que les lysosomes contiennent une molécule Ca 2 + du capteur, synaptotagmine VII, ce qui facilite leur exocytose et plasma réparation de la membrane dans les cellules lésées 8,9,10,11 .
Toutefois, une preuve supplémentaire a indiqué que l'exocytose seul n'était pas suffisant pour promouvoir plasma réparation de la membrane. En plus de larmes mécanique sur la membrane plasmique, une forme fréquente de lésion cellulaire est la perméabilisation par les toxines formant des pores produits par des bactéries ou des cellules immunitaires 12,13 14,15. Contrairement aux déchirures mécaniques, des protéines formant des pores s'insèrent sur la membrane plasmique de formage, une protéine de pore bordée stable qui ne peut être refermé simplement en appliquant une membrane "patch" ou par réductionment la tension de la membrane. Curieusement, des études ont révélé que les cellules de mammifères possèdent un mécanisme efficace pour la réparation de leur membrane plasmique après perméabilisation avec des protéines formant des pores, ce procédé nécessite également la présence de Ca 2 + extracellulaire 12. Cette découverte a soulevé la question de savoir si le retrait transmembranaire des pores de la surface de la cellule a également été un processus rapide, comme on l'observe avec des blessures mécaniques 5. De manière surprenante, les études récentes ont révélé que la refermeture de cellules perméabilisées avec des toxines formant des pores a des propriétés très similaires à la réparation des plaies mécaniques: le procédé nécessite le Ca2 + extracellulaire, et est achevée dans ~ 30 sec. Enquêter sur ce processus plus en détail, nous avons récemment appris que, en plus de Ca 2 exocytose + réglementés des lysosomes, la réparation de la membrane plasmique implique une forme rapide de l'endocytose, qui est déclenchée par la libération de l'enzyme lysosomale sphingomyelinase acide (ASM) et est essentiel non seulement pour ee retrait de pores transmembranaires, mais également pour la réparation de plaies mécaniques 16.
Pour déterminer la cinétique de la refermeture après perméabilisation des cellules avec des protéines formant des pores, dans notre laboratoire, nous avons adapté une méthodologie d'imagerie en temps réel qui a été utilisée précédemment pour évaluer refermeture de fibres musculaires isolées laser blessé 17. Ce dosage repose sur les propriétés du colorant lipophile FM1-43, qui s'intercale de manière stable dans le feuillet externe de bicouches lipidiques augmentation de l'intensité de fluorescence. Lorsque le plasma membrane bicouche est perturbé gains de colorant extracellulaire accès à des membranes intracellulaires, en fournissant un dosage sensible pour détecter un dommage de la membrane plasmique et réparer 18,16,19,20. Afin d'adapter ce test pour l'évaluation de la refermeture après perméabilisation des cellules avec des protéines formant des pores, on les cellules pré-incubées à 4 ° C avec la toxine bactérienne streptolysine O (SLO), qui se lie à la membrane 21 de cholestérol. Cellule synchroneperméabilisation peut alors être facilement réalisé en déplaçant les cellules à partir de la glace se réchauffer milieu dans une platine de microscope chauffée, ce qui active l'oligomérisation et le changement de conformation qui conduit à la formation de pores transmembranaires. Un avantage de cette approche, au cours des essais publiés précédemment à l'aide de la blessure au laser, est qu'un grand nombre de cellules peuvent être analysées simultanément dans un champ microscopique, offrant un meilleur échantillonnage de la population de cellules. Compte tenu des similitudes entre le processus mécanistes de refermeture de la cellule vu après une blessure mécanique et perméabilisation des toxines formant des pores, le test que nous décrivons ici fournit une méthode très puissante et polyvalente pour des facteurs impliqués dans le processus fondamental de plasma réparation de la membrane de dissection. A titre d'exemple, on montre qu'il est possible d'utiliser ce dosage pour identifier les mesures de Ca2 + dépendants et indépendants du processus de réparation.
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Protocol
Une. Transcriptionnelle de l'ASM
- Graine de 1,5 x 10 5 cellules HeLa dans 2 ml de milieu de culture DMEM (DMEM riche en glucose avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, 1% de Penn-Strep) sur des plats de fond 35 mm en verre (MatTek) et incuber une nuit à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%.
- Le jour suivant, aspirer hors des milieux de croissance et de la remplacer par 2 ml du milieu DMEM réduite de sérum (DMEM avec du FBS à 4%), au moins 1 heure avant d'ajouter le mélange de transfection de siRNA.
- Préparer 4 tubes pour le mélange de transfection oligo siRNA. Dans les tubes A et C, ajouter 250 ul de Optimem sérum réduit et 4 ul de Lipofectamine RNAiMax, par boîte de 35 mm à transfecter. Dans le tube B, ajouter 250 ul de sérum Optimem réduits et 8 pi (160 pmol) de contrôle du contenu de GC moyen oligo (siRNA contrôle), par boîte de 35 mm à transfecter. Dans le tube D, ajouter 250 microlitres de sérum Optimem réduits et 8 pi (160 pmol) de SMPD1 oligo (siasme), par boîte de 35 mm to transfecter. Incuber les tubes à température ambiante pendant 5 min.
- Mélanger les tubes A et B pour former le complexe de transfection pour le contrôle des siRNA, et les tubes C et D pour l'ASM siRNA. Incuber les réactions à la température ambiante pendant 20 min.
- Ajouter les mélanges de réaction de transfection de siRNA contrôle et ASM siARN lentement, goutte à goutte, dans des plats de 35 mm de fond verre respectives et incuber à 37 ° C / 5% CO 2. À 24 h post-transfection, aspirer délicatement les médias et le remplacer par un milieu de croissance de DMEM frais. Pour ASM efficace knockdown, les plats doivent être encore incubées à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant environ 31 heures (total 55 heures) avant l'imagerie en direct.
2. Préparation des réactifs pour la microscopie en direct
- Préparer une solution de toxine formatrice de pores recombinant streptolysine O (SLO) à une concentration de 100 ng / ul dans du PBS froid 1x sans Ca 2 + et Mg 2 +. Le SLO utilisé dans ces essais est un constitutively mutant cystéine actif qui ne nécessite pas d'agents pour réduire l'activité, aimablement fourni par le Dr Rod Tweten, Université de l'Oklahoma. La toxine a été exprimée dans E. coli BL21 DE3 et purifiée dans des conditions natives, comme décrit précédemment 16.
- Préparer la solution mère FM1-43: Remettre en suspension FM1-43 poudre lyophilisée dans du DMSO pour créer une solution de 25 mM.
- Préparer la solution A: Diluer la solution mère FM1-43 dans du DMEM froid avec Ca 2 + à une concentration finale de 4 pm (1,5 ml sont nécessaires par boîte MatTek) et stocker sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.
- Préparer la solution B: Diluer la solution mère FM1-43 dans du DMEM froid sans Ca 2 + et 10 mM d'EGTA (Ca2 DMEM + gratuit) à une concentration finale de 4 pm (1,5 ml nécessaires par boîte MatTek) et stocker sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.
- Pré-chaude (37 ° C) aliquotes de 1 ml de la solution A et la solution B dans des tubes Eppendorf.
- Gardez sur des solutions de glace de DMEM avec Ca 2 +, et Cun DMEM 2 + libre.
3. Imagerie de cellules vivantes FM1-43 Afflux en SLO traités et les cellules non traitées
- Remplir un récipient métallique peu profond de taille moyenne avec de la glace pilée, l'inverser dans un grand récipient en verre avec de la glace, et ajouter de la glace supplémentaire ne laissant que la surface de fond du récipient métallique exposée. Placez une serviette de papier humide sur le fond de métal exposé pour permettre le transfert thermique même.
- Prenez un plat MatTek contrôle siRNA traité (échantillon 1) et placez-le sur la serviette en papier humide froid. Aspirer tous les médias et laver 3 fois avec froid Ca 2 + sans DMEM. Après le dernier lavage, aspirer hors tous les médias dans le plat.
- Pour créer une image associée aux cellules FM1-43 dans des cellules qui n'ont pas la blessure SLO (échantillon 1), en présence de Ca 2 +, ajouter 180 ul de solution froide B à la lamelle de verre centrale de la coupelle inférieure 35 mm verre et incuber pendant 5 min sur de la glace (tableau 1). Placez plat MatTek sur la scène d'un microscope confocal chauffé à 37 ° C et équipé d'une chambre environnementale (qui maintient la température, l'humidité et niveaux de CO 2). Trouver le domaine des cellules qui seront imagés en regardant à travers un 40X NA 1.3 objectif (Nikon). Si possible, mettez PerfectFocus ou un dispositif similaire à corriger la dérive thermique.
- Ajouter 1 ml de solution A préchauffé doucement sur le côté de la boîte de 35 mm et remettre le couvercle de la chambre de l'environnement (tableau 1).
- Acquérir les images de 4 min à 1 image toutes les 3 secondes en utilisant un logiciel d'imagerie approprié (Volocity dans le système de filage de la microscopie confocale UltraView disque Vox Perkin Elmer). L'excitation du FM1-43 est effectuée avec un rayon laser de 488 nm en utilisant un filtre dichroïque avec un passe-bande de 488 nm, et la discrimination d'émission est réalisée par utilisation d'un filtre 527 (W55) d'émission. des niveaux de puissance de laser et de la sensibilité de la caméra sont réglés pour réaliser des expositions d'image de 100 msec.
- Répétez les étapes 3.2 à 3.6 pour détecter FM1-43 dans les cellules traitées siRNA contrôle sans blessure SLO (échantillon 2) en l'absence de Ca 2 +, sauf que lors de l'étape 3.5 Solution B devrait être ajouté (tableau 1).
- Pour mesurer FM1-43 flux dans des cellules de contrôle siRNA traités blessées avec SLO soit en présence (échantillon 3) ou en l'absence de Ca 2 + (échantillon 4), ajouter 180 ul de froid la solution B contenant SLO à la lamelle de verre centrale de la 35 mm plat à fond de verre et incuber pendant 5 min sur la glace que dans l'étape 3.3. Répétez les étapes 3.2 à 3.6; ajuster ajoutant soit la solution A ou la solution B à l'étape 3.5 (tableau 1).
- Pour déterminer le rôle de l'ASM dans le plasma réparation de la membrane, répétez les étapes 3.2 à 3.6 en utilisant des cellules de siARN traité ASM pour toutes les conditions (échantillons 5-8) (Tableau 1).
- Pour déterminer le rôle de la sphingomyélinase extracellulaire recombinant (SM) sur lacinétique de réparation de la membrane plasmatique (réfléchis par l'inhibition de l'afflux FM1-43) (échantillons 9 à 10), on ajoute SM (0-50 uU) soit à la solution A ou la solution B à l'étape 3.5, et ensuite ajoutés aux cellules pendant cellules vivantes imagerie dans un volume total de 1 ml (tableau 1).
4. Quantification de FM1-43 Afflux dans les cellules
- Après films ont été acquis, mesurer l'intensité de fluorescence intracellulaire de FM1-43 en utilisant un logiciel d'analyse d'image (Volocity Suite, PerkinElmer). Tirage d'une région d'intérêt dans la région cytosolique de chaque cellule dans le champ et à appliquer les outils logiciels pour déterminer la moyenne FM1-43, l'intensité de fluorescence dans toutes les trames de la vidéo.
- Pour tenir compte des variations dans la première FM1-43 coloration, les données de chaque vidéo est exprimé en pli augmentation de l'intensité de fluorescence au cours du temps, et tracées pour chaque condition différente. Le facteur d'augmentation de la fluorescence de chaque heure individuelle parcellule est calculé comme F T / F 0, où F T est la fluorescence moyenne au point de temps spécifique, et F 0 est la fluorescence moyenne à t = 0 (Figures 1-2).
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Representative Results
De faibles concentrations de bactéries sphingomyélinase (SM) sauvetage réparation de la membrane plasmatique dans des cellules appauvries en sphingomyélinase acide lysosomale.
En utilisant le test de formation d'image FM1-43, nous avons précédemment montré que des cellules déficientes pour l'ASM enzyme lysosomale et exposés à SLO blessant en présence de Ca 2 + ont un défaut de la membrane plasmique est recueilli par addition extracellulaire de l'enzyme humaine recombinante 19. Etant donné que l'ASM lysosomale humaine a un optimum de pH faible, nous avons cherché à savoir si rescellement peut également être restaurée ajoutant SM purifiée à partir de Bacillus cereus (Sigma), ce qui est pleinement active à un pH neutre. Comme précédemment indiqués, les cellules traitées avec le siRNA contrôle ou le siRNA oligos ASM et exposés à la SLO, en l'absence de Ca 2 + (conditions non permissives pour la réparation) ont été également perméabilisées, montrant que l'épuisement ASM n'interfère pas avec sensibilité à la toxine (Figure 1A ). Fait intéressant, une pleine sauvetage of la capacité des cellules déficientes en ASM pour refermer après exposition à SLO a été observée avec de faibles concentrations de SM, 5 et 7,5 uU / ml (Figure 1B). Lorsque la concentration est ajouté au milieu de l'enzyme augmente, il y avait une perte progressive du phénotype de sauvetage - les cellules exposées à 10 uU / ml seulement partiellement bloquée l'afflux de FM1-43 après exposition à la SLO, et des cellules exposées à 50 uU / ml ont montré un motif de colorant afflux forte, reflétant un défaut complet de refermeture similaire à celle observée dans les cellules de l'ASM appauvri (figures 1B et 1C). Ce résultat suggère que la suppression d'endocytose de SLO pores est étroitement régulée par les niveaux de céramide générés à la membrane plasmique par SM - au-dessus d'un certain niveau, le processus ne se produit pas normalement, et les cellules ne peut pas supprimer les lésions.
plus de Sphingomyélinase contourne l'obligation de Ca 2 + dans le plasma réparation de la membrane.
Remarquablement, l'addition de bactéries SM de cellules perméabilisées par SLO en l'absence de Ca 2 + (normalement un état qui ne permet pas refermeture de la cellule) a également sauvé réparation de la membrane plasmatique. Comme vu dans les cellules exposées à la toxine de formation de pores en présence de Ca2 + (Figures 1B et 1C), seuls de faibles concentrations de SM étaient efficaces dans le blocage de l'influx FM1-43 (figure 2A et 2B). Ces résultats indiquent que les fonctions de la sphingomyélinase en aval de la Ca 2 +-dépendante l'étape de réparation de la membrane plasmatique. Ce résultat est pleinement compatible avec notre modèle précédemment proposé, qui postule que le Ca 2 + qui coule à travers les pores transmembranaires déclenche l'exocytose de lysosomes et ASM presse, qui clive la sphingomyéline sur le feuillet externe de la membrane plasmique, céramide générer et de promouvoir pores enlèvement par endocytose 22 , 19. Le fait que plus de purifié SM contourne la nécessité de Ca 2 + fortement renforcents le point de vue que dans les conditions physiologiques de Ca 2 + exocytose régulée des lysosomes est la source de l'activité de sphingomyélinase nécessaires pour promouvoir l'endocytose.
Figure 1. Cereus sphingomyelinase de Bacillus (SM) peut compléter le défaut plasma de réparation de la membrane des cellules taire pour l'expression de sphingomyelinase acide (ASM) blessé par la toxine formant des pores Streptolysine O (SLO). Cellules HeLa traitées avec le siRNA contrôle ou ASM siRNA oligos ont été blessés dans l'absence ou la présence de Ca 2 + et l'afflux du colorant lipophile FM1-43 a été imagée à 1 image / 3 sec pendant 4 min. FM1-43 fluorescence intracellulaire a été quantifiée en utilisant le logiciel d'Volocity et exprimée en augmentation d'un facteur d'intensité de fluorescence au cours du temps. (A) Dans l'absence de Ca 2 +, les fonctions de contrôle et de siRNA ASM cellules siRNA-traités ont été perméabilisées par SLO. De 18 à 27 cellules ont été analysées dans chaque état;. Barres d'erreur correspondent à la moyenne + / - SEM (B) en présence de Ca 2 +, des cellules traitées par le siRNA contrôle ont été en mesure de refermer leur membrane plasmique et arrêter teindre afflux, tandis que cellules traitées avec ASM siRNA n'ont pas réussi à refermer. De plus, en présence de Ca 2 +, l'addition exogène de faibles doses de la sphingomyélinase complète le défaut de la membrane plasmique des cellules traitées par siRNA ASM. De 18 à 62 cellules ont été analysées dans chaque état; barres d'erreur correspondent à la moyenne + / - SEM (C) la sélection des trames de temps du film analysée par B.. Bars, 9 pm. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Figure 2. addition de Sphingomyélinase contourne la nécessité de Ca 2 + dans le plasma réparation de la membrane. cellules HeLa traitées par siRNA contrôle ont été blessés à SLO en l'absence de Ca 2 + et l'afflux du colorant lipophile FM1-43 a été imagé à une trame / 3 s pour 4 min. FM1-43 fluorescence intracellulaire a été quantifiée en utilisant le logiciel d'Volocity et exprimée en augmentation d'un facteur d'intensité de fluorescence au cours du temps. (A) L'absence de membrane plasmique rescellement habituellement observée dans les cellules blessées avec SLO en l'absence de Ca 2 + est inversée par l'addition exogène des doses faibles de la sphingomyélinase. 18-31 cellules ont été analysées dans chaque état, les barres d'erreur correspondent à la moyenne + / - SEM (B) la sélection des délais du film analysé dans un.. Bars, 9 pm.g2large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.
Figure 3. Procédure chronologie. Chronologie des étapes expérimentales impliquées dans la procédure. Cliquez ici pour agrandir la figure .
| Ca2 + condition | État libre de +-Ca2 | Toxine SLO | Solution A chaud | Chaud Solution B | Sphingomyélinase | Procédure Étape |
| + | - | - | + | - | - | 3.2 |
| - | + | - | - | + | - | 3.7 |
| + | - | + | + | - | - | 3.8 |
| - | + | + | - | + | - | 3.8 |
| + | - | - | + | - | - | 3.9 |
| - | + | - | - | + | - | 3.9 |
| + | - | + | + | - | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | + | 3.10 |
| + | - | + | + | - | + | 3.10 |
Tableau 1. Composition des solutions utilisées dans la procédure expérimentale. Échantillons comme décrit dans la procédure sont énumérés dans les rangées. Les colonnes indiquent la présence (+) ou absence (-) de l'élément nommé (oligo, Ca 2 + ou Ca 2 +-support libre, SLO, la solution A ou B, la sphingomyélinase). Les étapes expérimentales dans lesquelles ces échantillons sont d'abord utilisés pour l'imagerie des cellules vivantes dans la procédure de l'article 3 sont indiquées.
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Discussion
Des études antérieures sur blessure mécanique et la membrane plasmique réparation invoqués divers mécanismes de cellules blessant, allant de l'abandon des perles de verre, micropipetage, cisaillement, gratter ou racler. La lecture de tous ces essais était qualitative plutôt que quantitative, et ne donne pas d'informations précises sur la cinétique du mécanisme de réparation. La capacité des cellules à resceller leur membrane plasmique après ces formes de lésion a été mesurée en présence ou en l'absence de traceurs ajoutés au fluide extracellulaire dans le cytoplasme, la perforation de la membrane colorants imperméables, des pertes d'enzymes cytosoliques, les taux d'ATP ou à long terme la survie cellulaire. Bien que plusieurs de ces analyses peuvent être effectuées quantitativement, l'un obstacle majeur dans ces études a été la difficulté de synchroniser l'événement blesser, tout en évaluant la cinétique rapide de refermeture, au niveau de la cellule unique.
Le développement et l'utilisation de dommage laser UV des fibres musculaires suimené par la détection de l'arrivée du colorant lipophile FM1-43 a été une avancée majeure dans ces études 17,20. Au lieu des dégâts infligés brut à toute la population de cellules par grattage ou des moyens mécaniques similaires de blessures, ces tests introduits de façon plus définie de blesser les cellules qui ont permis l'analyse d'une seule cellule. Cependant, plusieurs problèmes subsistent dans de tels dosages. La taille des lésions induites par laser est grande et très variables en fonction de l'intensité du laser, et de nature très différente de la forme de lésion de membrane qui se produisent dans des conditions physiologiques. Un autre problème est que d'une seule cellule ou fibre musculaire peuvent être blessés à la fois en utilisant des lasers de microscope associé, réduire le nombre de refermeture des événements qui peuvent être suivies, et donc la signification statistique des résultats. Ces problèmes de reproductibilité et d'échantillonnage considérablement réduit l'utilité de la blessure au laser comme une méthode pour étudier les mécanismes de réparation de la membrane plasmatique.
To répondre à ces questions, nous avons développé un nouveau test d'imagerie des cellules vivantes de mesurer précisément la cinétique de réparation des lésions de la membrane plasmique causés par des toxines formant des pores bactériennes. Il s'agit d'une forme de lésion qui survient fréquemment dans la nature, puisque de nombreux microbes possèdent de nombreuses toxines qui sont capables de perméabiliser la membrane des cellules eucaryotes. Ce dosage peut être précisément synchronisé par pré-incubation des cellules avec la toxine à des températures basses, et permet à un grand nombre de cellules dans un champ microscopique à analyser pour l'afflux de FM1-43, que la température est augmentée à déclencher la formation de pores.
La synchronisation précise des pores formation réalisés avec ce dosage permet des mesures reproductibles de la cinétique plasmatique de réparation de la membrane, qui peut être quantifiée simultanément dans plusieurs cellules individuelles dans le champ microscopique. Un facteur important dans la technique de ces essais est la qualité de l'objectif de microscope pour être utilisé pour l'imagerie. Til 40X NA 1.3 (Nikon) objectif utilisé dans nos tests permet un échantillonnage suffisant de cellules dans une population sans perte de résolution d'image. Le passage à un objectif 10X permettrait un plus grand échantillon de la population de cellules, mais la résolution qui est obtenue est insuffisante pour un bon de quantification intracellulaire FM1-43. Une étape critique pour ce dosage direct de formation d'image de la cellule est l'utilisation de PerfectFocus ou d'un dispositif similaire afin de corriger la dérive thermique. Notre procédure nécessite de pré-liaison de la toxine porogène bactérienne à des cellules sur de la glace, puis se déplaçant rapidement la température à 37 ° C pour l'imagerie des cellules vivantes. Ce réglage de la température peut entrainer des fluctuations de discussion axiales pendant la période d'acquisition d'image, et doit être corrigée. PerfectFocus ou un dispositif similaire sera corriger ce problème en permettant l'imagerie des cellules vivantes d'un plan focal choisi sur de longues périodes de temps, ce qui permet une quantification précise de la cinétique plasmatique de réparation de la membrane.
Une clé àla réussite de cet essai est toujours à titre de différentes concentrations de la toxine de préformage afin de déterminer les doses réparables et non réparables, étant donné que cela peut varier pour chaque lot de toxine utilisée. L'activité de nombreuses toxines, et de SLO en particulier, est sensible à la température et multiples gel dégèle cycles sont préjudiciables à son activité. Cependant, à côté de titrages effectués dans chaque expérience permettent la dose de toxine correcte à être déterminée avec précision en seulement quelques minutes de l'imagerie time-lapse.
Ce test repose sur la détection de la fluorescence intracellulaire FM1-43 suffisant après une lésion de la membrane plasmique. Cette limite peut être, dans certaines conditions. Après l'insertion dans les membranes ALS formes des pores d'un diamètre d'environ 30 nm, ce qui permet robuste influx de Ca2 + et une réponse de réparation de plasma membrane rapide dans les cellules eucaryotes. Cependant, les toxines qui forment des lésions plus petites, telles que aérolysine et que lysenin ont des diamètres de pores de l'ordre de formation de pores1-3 nm 23 à 25 mai ne pas être suffisant pour cette analyse car ils peuvent entraîner une insuffisance Ca 2 + et FM1-43 afflux.
Même en utilisant une toxine qui génère de grandes pores tels que SLO, il est important de garder à l'esprit que ce test d'imagerie ne permet pas de quantification absolue de l'intensité de fluorescence, mais plutôt fluorescence relative. Ainsi, il est essentiel que l'imagerie est effectuée à l'intérieur de la plage dynamique intrascene de l'appareil photo numérique. Etant donné que l'intensité de fluorescence est affectée par la puissance du laser, la durée d'exposition et le gain de la caméra, il est important de définir ces trois paramètres, au début de chaque expérience, en effectuant l'imagerie préliminaire des cellules traitées avec FM1-43 et SLO à la fois dans la réparation et non -réparation conditions (Ca 2 + ou Ca 2 +-moyennes gratuit). Ceci permet le choix des paramètres d'acquisition d'image qui permettent la détection de la fluorescence au temps zéro (avant l'addition SLO) mais qui ne donnent pas lieu à une saturation du détecteur (comme détermminé par la lecture du logiciel) à la fin de l'acquisition dans des conditions non-réparation.
En utilisant cet essai, nous avons pu démontrer que les pores SLO sont enlevés de la membrane plasmique des cellules de mammifères en moins de 30 sec, ce qui démontre que ce procédé présente une cinétique rapide semblables à la réparation des plaies mécaniques 16. Des études ultérieures ont montré que l'ASM enzyme lysosomale est requis pour la réparation de la membrane plasmatique, et capable de restaurer rescellement extracellulaire lorsqu'il est ajouté à des cellules déficientes en 19 ASM. Dans la présente étude, nous avons profité de la sensibilité de l'analyse de flux FM1-43 de montrer, pour la première fois, que le plasma réparation de la membrane peut également se produire en l'absence de Ca 2 + extracellulaire. L'exposition des cellules blessés à sphingomyelinase recombinant était suffisante pour promouvoir refermeture dans des cellules perméabilisées par SLO en Ca 2 + milieu libre, une condition normalement pas permissive pour le plasma réparation de la membrane. Fait intéressant, achèvementmentation de la capacité du plasma de réparation de la membrane n'a pas été observée après exposition à des concentrations élevées de la sphingomyélinase, ce qui suggère que la quantité de céramide généré par cette enzyme sur le feuillet externe de la membrane plasmique est un déterminant important de la procédure de suppression de la lésion. Ce résultat démontre que le Ca 2 + est nécessaire pour déclencher l'étape d'exocytose lysosomale, mais n'est pas nécessaire pour l'endocytose induite par la sphingomyélinase qui est responsable de l'internalisation des plaies.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par des subventions du NIH R37 AI34867 et R01 GM064625 à NWA Nous remercions le Dr R. Tweten de l'Université de l'Oklahoma pour le plasmide d'expression SLO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
| FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
| Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
| Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
| SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
| Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
| Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
| 35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
| Material | |||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
| Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
| Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
| Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber | |
References
- Heilbrunn, L. The dynamics of living protoplasm. , Academic Press. (1956).
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