Genetisk Manipulation i Published: July 12, 2013 doi: 10.3791/50598

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Leah M. Rommereim¹, Miryam A. Hortua Triana¹, Alejandra Falla¹, Kiah L. Sanders¹, Rebekah B. Guevara¹, David J. Bzik¹, Barbara A. Fox¹

¹Department of Microbiology and Immunology, The Geisel School of Medicine at Dartmouth

Summary

Her rapporterer vi en fremgangsmåde til anvendelse af type I og type II

Abstract

Målrettet genmanipulation hjælp homolog rekombination er den foretrukne metode til funktionel genomisk analyse for at få et detaljeret billede af gen-funktion og fænotype (r). Udviklingen af ​​mutantstammer med målrettede gendeletioner, målrettede mutationer, suppleret genfunktion og / eller mærkede gener giver effektive strategier til at løse genfunktion, især hvis disse genetiske manipulationer effektivt kan målrettes til genet locus af interesse ved hjælp af integration medieret af dobbelt krydse over homolog rekombination.

Grundet meget høje homolog rekombination, funktionelle genomisk analyse af Toxoplasma gondii er tidligere blevet begrænset af manglen på effektive metoder til målretning gendeletioner og gen-erstatninger til specifikke genetiske loci. For nylig, vi afskaffede vigtig vej homolog rekombination i type I og type II-stammer af T. gondii ved at slette genet encoding den Ku80 protein ^1,2. De Δku80 stammer opføre sig normalt under tachyzoite (akut) og bradyzoite (kronisk) Forløb in vitro og in vivo og udviser væsentlige en 100% frekvens af homolog rekombination. De Δ Ku80 stammer lave funktionelle genomiske undersøgelser muligt på enkelt gen samt på genomet skalaen ^1-4.

Her rapporterer vi metoder til anvendelse type I og type II Δku80Δhxgprt stammer til fremme gen-targeting tilgange i T. gondii. Vi skitserer effektive metoder til at generere gendeletioner, gen udskiftninger, og mærkede gener ved målrettet indsættelse eller sletning af hypoxantin-xanthin-guaninphosphoribosyltransferase (HXGPRT) markør. Den beskrevne gene targeting protokol kan bruges i en række forskellige måder i Δku80 stammer til fremme funktionel analyse af parasitten genomet og udvikle enkelte stammer, der bærerflere målrettede genetiske manipulationer. Anvendelsen af denne genetiske fremgangsmåde og efterfølgende fænotypiske assays vil afsløre fundamentale og unikke aspekter af biologi T. gondii og tilhørende betydelige menneskelige patogener, der forårsager malaria (Plasmodium sp.) og cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Introduction

Toxoplasma gondii er en fælles obligat intracellulær protozoparasit der hyppigt og kronisk inficerer en bred vifte af dyr og mennesker ^5. Det anslås, at mere end 1 milliard mennesker er i øjeblikket og kronisk inficeret af dette patogen. Ud over betydningen af sygdom forårsaget af T. gondii infektion, den øgede tilgængelighed af eksperimentelle værktøjer, kraftfulde genomics ressourcer ^6, nem in vitro vækst og gode musemodeller har gjort T. gondii en førende model for den bredere undersøgelse af intracellulære eukaryote patogener og andre væsentlige apicomplexan parasitter, der forårsager ødelæggende sygdomme såsom malaria (Plasmodium sp.) og Cryptosporidiose (Cryptosporidium) ^5,7. En væsentlig begrænsning af Toxoplasma gondii som en model organisme har været ineffektiv inddrivelse af afkom, der bærer målrettet genetiske manipulationer. Denne problem gentargeting skyldes en lav frekvens af homolog rekombination i forhold til den meget høje frekvens af homolog rekombination i vildtype-stammer af T. gondii selv når omfattende DNA homologi tilvejebringes i DNA-målmolekyler, der anvendes i genetiske undersøgelser ^2.

Vi har for nylig genetisk blokeret vigtig vej homolog rekombination i type I og type II-stammer af Toxoplasma ved at slette det gen der koder for Ku80 proteinet ^1,2. Den resulterende type I og type II Δ Ku80 stammer udviser normale vækstrater, størrelse og adfærd både in vitro og in vivo under tachyzoite og bradyzoite stadier in vitro og in vivo, men disse stammer udviser væsentlige en 100% frekvens af homolog rekombination og dette fænotype øger sandsynligheden for hurtigt at isolere den ønskede afkom af målrettede genetiske manipulationer af flere hundrede til flere thousand-fold ^1,2,4. Nyere EU-dækkende brug af type I og type II Δ Ku80 stammer har markant optrappet tempoet, sorten, samt succesraten for målrettede genetiske tilgange i T. gondii ^1-4,8-13. Her beskriver vi en omfattende protokol for målrettet gendeletion genudskiftning og gen-tagging i Δ Ku80 stammer af T. gondii. Vi viser, hvordan man designer og pålideligt målrette genetiske manipulationer til bestemte gener eller genetiske loci i Δ Ku80 stammer af Toxoplasma gondii.

Protocol

1.. Gene Targeting for at Slette et gen af ​​interesse

Denne protokol er udviklet til effektiv frembringelse af en mutantstamme, der har en målrettet gendeletion ved en defineret genetisk locus. Den tidligere beskrevne T. gondii hypoxantin-xanthin-guaninphosphoribosyltransferase (HXGPRT) markør anvendes i denne protokol til sikker og pålidelig markør indsættelse efter mycophenolsyre og xanthin (MPA + X) valg ^14-16. Denne protokol anvender en valideret og omkostningseffektiv metode til at konstruere DNA målsøgningsmolekyler baseret på gær rekombinatorisk kloning ^17,18. Flere alternative protokoller er kommercielt tilgængelige til konstruktion af rekombinante målsøgningsmolekyler ved hjælp bakterielle rekombinatoriske kloning metoder, in vitro rekombinatoriske kloning metoder eller fusion PCR. Protokollen beskrevet nedenfor giver den højeste samlede effektivitet og pålidelighed inddrive klonet præmisites besidder en målrettet gendeletion i Δ Ku80 stammer af T. gondii.

1.1 Forberedelse af målretning DNA

1. Adgang ToxoDB ⁶ ( http://www.toxodb.org ) for at opnå genomiske sekvenser for genet af interesse (GOI).

Bemærk: Genomiske sekvenser skal hentes fra type I, II eller III genom sekvens i ToxoDB database, der er tættest på stammen bliver manipuleret. For eksempel: GT1 for RH og ME49 for Pru.

2. Design specifikke overlappende primere, der amplificerer 5'-og 3'-genomiske målretning flankerne af genet af interesse (GOI), der inkorporerer en 33 bp overlap med gær shuttle-vektoren pRS416 (eller alternativt pRS426) og indarbejde et 33 bp overlap med den selekterbare markør ( HXGPRT) (Figur 1A-B). Tilføj et unikt restriktionsenzymsted i hver primer i begge ender af 5'ennd 3 'genomiske målretning flanker, placeret mellem de 33 bp overlap og T. gondii-specifik primer-sekvens (er) (Figur 1A-B).

Bemærk: En højere end 30 bp overlap er nødvendig for en effektiv gær rekombination kloning. 5'-og 3'-genomiske målretning flanker er designet til at forstærke specifikke DNA-fragmenter mellem 800 og 1.400 bp, der definerer en målrettet sletning. Vær opmærksom på, at kortere flanker markant vil reducere målrette effektivitet i Δ Ku80 Δ hxgprt baggrund ^2.

3. PCR amplificere 5'mål flanke anvendelse af primere F1 og R1, og PCR amplificere 3'mål flanke under anvendelse af primer F2 og R2 (Figur 1A-C) fra genomisk DNA ^3.. Separat PCR amplificere ~ 2 Kbp HXPGRT gen der indbefatter de associerede 5'-og 3'-dhfr-flankerende regioner af HXGPRT cDNA pminiHXGPRT kassette ¹⁴ ved anvendelse af primerne HXF og HXR(Fig. 1B-C).

Bemærk: Forstærk target flanker hjælp genomisk DNA fra forældrenes stamme til transficeres.

Bemærk: Placer HXGPRT markør i fremad orientering i forhold til 5'-og 3'-DNA målretning flanker for at lette efterfølgende effektive genetiske manipulationer, såsom målrettede fjernelse af HXGPRT fra den afbrudte locus.

4. Verificere korrekte PCR-produkt størrelser ved agarosegelelektroforese og estimere DNA-fragmentet koncentrationen hjælp agarosegel standarder eller en anden metode til bestemmelse af DNA-koncentrationen.
5. Generere kompetente gær alikvoter som beskrevet i Gietz og Schiestly ^17..
6. Kombiner 50 ng af 5 'genomisk målretning flanke, 50 ng 3' genomisk målretning flanke, 100 ng HXGPRT selektionsmarkør, og 50 ng lineariseret shuttle-vektor med sterilt _H2O for at opnå et endeligt volumen på 10 -20 ul. Omdan kompetent gær med de tre PCR-produkter og gær-E. coli shuttle vektor for rekombinatorisk kloning ved hjælp af protokollen beskrevet af Gietz og Schiestly ^17.. Plade transformeret gær på uracil-minus minimal-medium agarplader og inkuberes ved 30 ° C i 2 - 3 dage.

Bemærk: Den ordnede samling af plasmidet, 5'mål flanke, den HXGPRT markering, og 3'mål flanke lettes af de konstruerede 33 bp overlap mellem de DNA-fragmenter (figur 1A-B), og medieres ved homolog rekombination i gær.

7. Høst gær ved tilsætning af 2 ml 2x YPAD til uracil-minus plader og forsigtigt at skrabe at fjerne kolonier uden at forstyrre agaren. Centrifugeres gær opløsningen i 5 minutter ved 5.000 xg og supernatanten.
8. Resuspender gær pellet i 250 ul af en resuspenderingsbufferen indeholdende RNaseA og tilføje 50-100 ul af encid-vaskede glasperler til løsningen. Vortex i 5 minutter ved den højeste hastighed for at knuse gærceller.
9. Lad glaskugler for at sedimentere til bunden af ​​røret og overføre supernatanten til et 2 ml Eppendorf-rør.
10. Isoler gær-DNA ved hjælp af en miniprep DNA-isolering kit, resuspendering i et endeligt volumen på ~ 100 gl.
11. Mix 2 pi gær DNA (~ 50 ng) med 40 ul DH10B elektroporation kompetent E. coli holdt på is.
12. Opløsningen overføres til en kølet 2 mm spalte elektroporeringskuvette og elektroporere bakteriecellerne på 2,4 kV og 129 Ω.
13. Rescue celler ved at tilsætte 0,8 ml SOC bouillon til hver kuvette og overføre opløsningen til en 14 ml snap-cap Falcon rør. Cellerne inkuberes ved 37 ° C i en tromle tromle til 40-60 min.
14. Plate E. coli på 2xYT + ampicillin (AMP) plader og inkubere pladerne ved 37 ° C natten over.
15. Vælg ~ 6 - 8 enkelte kolonier og vokse i 3 ml 2XYT + AMP for ~ 16 timer ved 37 ° C.
E. coli klon.
16. Isoler plasmid pΔGOI fra E. coli kloner med en miniprep kit, resuspendering i et endeligt volumen på ~ 100 gl.
17. Godkend pΔGOI hjælp restriktionsenzym fordøjer at måle DNA-plasmid størrelse og verificere den forventede pΔGOI DNA båndmønstre.
18. Færdiggøre validering af pΔGOI ved DNA-sekventering af 5 'og 3' genomiske målretning flanker at kontrollere 100% DNA-sekvens baseret på genom sekvensdata i http://www.ToxoDB.org .

Bemærk: Near perfect sekvenshomologi er afgørende for at maksimere gentargeting effektivitet ³ da hver basepar forskel udgør en tilsvarende nedskæring i længden af perfekt homologi.

Bemærk: genom-sekvensen af type II Δku80 stamme baseret på Pru forældrenes stregn er ikke tilgængelig på dette tidspunkt. Dette arbejde bruger type II ME49 genomsekvens som surrogat genom for type II Δ Ku80 stamme. Baseret på sekvensdata på en række genetiske loci, anslås det, at den ME49 genom og Pru genomet udviser single nucleotide polymorphisms ved en frekvens på ~ 1 ud af 10.000 nukleotider eller mindre.

20. Generer> 200 ug pΔGOI bestand ved at pode en ~ 250 ml 2XYT + AMP overnight kultur med glycerolstamopløsninger fra en valideret E. coli minipræp klon.
21. Isoler pΔGOI plasmid-DNA fra den store kultur med en maxiprep DNA-isolering kit, resuspendering i et endeligt volumen på ~ 1.000 pi.
22. Gentag restriktionsenzym fordøjer eller DNA-sekventering af pΔGOI maxiprep DNA'et at efterprøve den korrekte målretning DNA-molekyle før transfektion.
23. Linearize ~ 15 ug pΔGOI ved 5 'enden med den unikke restriktionsenzym X (RE.X)fordøje sted indbygget i 5'mål flanke (figur 1B).

Note: Gene målretning i T. gondii kræver et minimum af ~ 10 ug målrette DNA for at opnå en effektiv frekvens målretning begivenheder i gen locus af interesse ^2.

24. Validere linearisering af pΔGOI og bestemme DNA-koncentration ved agarosegelelektroforese eller en alternativ metode.

Bemærk: Hvis restriktionsenzymfordøjelse ved 5'flanke ikke giver fuldstændig linearisering, den designede 3'kan unikt RE.Y fordøje stedet anvendes som et andet sted til linearisering af pΔGOI.

Note: En helt lineariseret targeting DNA-molekylet er afgørende for en vellykket gen-targeting ved homolog rekombination i Δ Ku80 stammer.

25. Neutraliseres restriktionsenzym ved incubating ved 68 ° C i 15 - 20 min.
26. Forbered mindst 15 ug lineariseret plasmid i 100 ul sterilt H ₂ O. Opbevares lineariseret pΔGOI ved -20 ° C indtil tidspunktet for transfektion.

1.2 Fremstilling af T. gondii parasitter, transfektion, udvælgelse, subkloning, validering, arkivering og vedligeholdelse af genetisk manipulerede stammer

Generelle metoder til kultur og manipulation af T. gondii i humane forhudsfibroblast (HFF) celler er beskrevet ^19-21. De Δ Ku80 Δ hxgprt stammer replikere normalt i parasitangrebet medium (Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) vækstmedium suppleret med 1% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antimykotikum-antibiotisk fortyndet fra en 100x stamopløsning) ^1,2. Alt arbejde med Toxoplasma gondii, skal udføres ved hjælp af biosikkerhed niveau 2 procedurer. T. gondii RHΔ Ku80 ² parental stamme blev genereret fra RHΔ hxgprt stammen fra Roos Lab ^14.. Den PruΔku80 ¹ parentale stamme blev genereret fra PruΔhxgprt (Pru gniaud stamme BSG-4 ^22), som indeholder en stabilt integreret CAT selekterbar markør og et grønt fluorescerende protein (GFP) reporter under kontrol af den bradyzoite fase promotor LDH2.

1. Pode en 25 cm ^2-kolbe indeholdende sammenflydende HFF celler med 1 x 10 ⁶ levedygtig type I RH Δ Ku80 Δ hxgprt parasitter, eller pode to 25 ^cm2 kolber med 2 x 10 ⁶ levedygtig type II Prugniaud (Pru) Δ Ku80 Δ hxgprt parasitter.

Bemærk: Levedygtige parasitter er defineret som ekstracellulære parasitter, der har frisk lyseres ud.

Note:

2. Efterse Δ Ku80 Δ hxgprt inficerede kulturer ~ 68-72 timer efter infektion. Kontrollér tilstedeværelse af levedygtige parasitter og ~ 90 - 95% lyse af HFF celler til at planlægge den præcise timing af transfektion.

Bemærk: isolation af frisk egressed parasitter er afgørende for succes i denne protokol, fordi lav parasit levedygtighed vil afskaffe gen-targeting effektivitet.

3. Agitere levedygtige parasitter i opløsning ved at lukke plug-segl låg på 25 cm ^2-kolbe og rystes kraftigt kolben og tilbage at agitere parasitter ud af væksten overflade uden sprøjt væske på indersiden af låget eller halsen af kolben .

Bemærk: Parasit høst kræver ikke en sprøjte-nål release protokol for type I-ellertype II Δ Ku80 stammer.

4. Overfør parasitten løsning til en 10 ml sprøjte fastgjort til en filterholder indeholdende en 3 um membran og placere filterenheden på toppen af ​​en åben 15 ml skruelåg rør. Sprøjte filtrere parasitter i 15 ml skruelåg rør.

Bemærk: Filtrering af parasitter gennem membranen fjerner inficerede celler og cellulære debris.

5. Bestem parasitten koncentration (tachyzoite former per ml) ved hjælp af et hæmocytometer.

Note: Valgfrit: Brug parasitten løsning oprette en plaquedannende enhed (PFU) assay ^21, der vil blive læst 7 - 8 dage senere for at bestemme den tilstrækkelige levedygtighed transfekterede parasitter (PFU at tachyzoite forholdet ≥ 0,2).

6. Pellet parasitter til 7 min ved 1400 xg og aspirere supernatanten til ~ 0,4 ml uden at forstyrre parasitten pellet. Spin i 2 minutter ved 1,400 xg og aspirat resterende supernatant til ~ 0,01 ml uden at forstyrre parasitten pellet.
7. Resuspender parasitten pellet ved flicking bunden af røret og straks tilføje cytomix ²³ buffer (1.33x koncentration) for parasitten pellet for at opnå en parasit koncentration på 4 - 5 x 10 ⁷ parasitter / ml cytomix.

Bemærk: Udelad tilsætning af ATP og glutathion til cytomix da disse tilføjelser ikke forbedrer effektiviteten af genet målretning.

8. Optø 100 ul alikvot af lineariserede pΔGOI fra protokol 1.1 (trin 26).
9. Overfør 0,3 ml af parasitten cytomix opløsning (~ 1,3-1,6 x 10 ⁷ parasitter) til 100 ul lineariseret pΔGOI fra protokol 1.1 (trin 26), og straks overføre hele 0,4 ml parasit + pΔGOI mix en kølet 2 mm spalte elektroporeringskuvette.
10. Elektroporere parasitter ved 1,4 kV og 24 Ω.
11. Rest transfektion kuvetten ved stuetemperatur i ~ 5 min derefter overføre hele indholdet af transfektion kuvetten i en 150 ^cm2 kolbe indeholdende sammenflydende HFF celler med 30 ml infektion medium og inkubere den inficerede kultur natten over.
12. Begynd udvælgelse i mycophenolsyre + xanthin (MPA + X) ~ 20 timer efter transfektion (fig. 2A) ved at erstatte infektion medium med MPA + X selektionsmedium (MPA (25 ug / ml) og xanthin (50 ug / ml) i infektion medium).

Bemærk: Du må ikke forstyrre inkubationstiden MPA + X udvælgelse kolbe.

13. Anslår det samlede antal PFU'er i MPA + X udvælgelse kolbe ~ 8 dage post-transfektion ved visuelt at inspicere monolag. Kontrollere tilstedeværelsen af ​​udviklingen PFU og sunde zoner af infektion ved lysmikroskopi.

Bemærk: Hvis plaques ikke er synlige ved dag 8, vedligeholde udvælgelse og monitor for tegn på smitteion da mutantstammer kan have en reduceret replikation sats.

Bemærk: Δ Ku80 Δ hxgprt parasit stammer har en ekstremt lav baggrund af uønskede nontargeted begivenheder, som giver mulighed for en vellykket isolering af mutantstammer med ret alvorlige, men ikke dødelige vækstdefekter. Hvis et gen er afgørende, og det kan ikke slettes, den primære transfektion eller efterfølgende vedtaget parasit befolkning, kan afsløre en fænotype, hvor parasitterne ophøre at replikere under valget, da befolkningen beslutter at målrettede knockouts.

14. Ryst kolben som i trin 3 for at fjerne ekstracellulære parasitter fra monolaget [efter synlige plaques har udviklet] for at generere en parasit løsning. Overførsel ~ 0,5 ml af parasitten løsning fra MPA + X udvælgelse kolbe til en 25 cm ² MPA + X udvælgelse kolbe indeholdende sammenflydende HFF celler (betegne denne kultur pass 1A).
15. Fordrive parasits i de oprindelige 150 cm ² MPA + X udvælgelse kolbe ~ 3 dage senere og overførsel ~ 0,5 ml parasit opløsning til en anden 25 ^cm2 MPA + X udvælgelse kolbe indeholdende sammenflydende HFF celler (betegne denne kultur pass 1B).
16. Tillad zoner af infektion at udvikle sig i hovedet 1A og / eller passere 1B flasker for ~ 5 dage. Visuelt kontrollere ved lysmikroskopi at pass 1A og 1B kolber indeholde minimum 25 levedygtige PFU'er med raske zoner af infektion.
17. Vælg enten pass 1A eller pass 1B kolbe for fortsat passage i MPA + X udvælgelse medium i 25 ^cm2 kolber. Opretholde passage under MPA + X udvælgelse.

Bemærk: Parasitter skal dyrkes i et tilstrækkeligt antal generationer at slette ikke-integreret vedvarende episomer fra befolkningen forud for subkloning. Udfør ikke subkloning før til 20 dage efter transfektion for type I RH Δ Ku80 Δ hxgprt eller før til 25 dage efter transfektion fortype II Pru Δ Ku80 Δ hxgprt parasitter at give tilstrækkelig tid til at fortynde ikke-integreret episomer ^1,2.

18. Subklon parasitter i en 96-brønds bakke indeholdende sammenflydende HFF celler med MPA + X selektionsmedium. Forbered en bakke i en koncentration på 1 parasit / brønd og en anden bakke i en koncentration på 2 parasitter / brønd.

Bemærk: subklon parasitter, der for nylig lyserede (~ 90 - 95% af HFF celler i 25 ^cm2 kolbe) for at sikre, at parasitterne har høj levedygtighed.

Bemærk: Den optimale tidsramme efter transfektion til subkloning blev etableret ved at måle, hvor hurtigt succes målrettede parasitter opstår ved en høj frekvens i den valgte population ^1..

19. Fortsæt til passage den primære population af transficerede parasitter i MPA + X selektionsmedium ved hjælp af en ugentlig passage tidsplan for smitteen 25 cm ² HFF kolbe med 10 pi af parasitten opløsningen.

Bemærk: Hvis kloner bærer det målrettede genet (knockouts), ikke er opnået fra den første subkloning i trin 18, resubclone parasitterne fra løbende vedligeholdes befolkning ~ 10-12 uger efter transfektion.

Note: En af grundene en gendeletion ikke opnås skyldes den episomale vedholdenhed nogle pΔGOI plasmider. Episomal vedholdenhed er bestemt af de sekvenser indeholdt i 5'-og 3'-genomiske målretning flanker og ikke synes at hidrøre fra HXGPRT genetiske element. Ca. 5 - 10% af målretning plasmider udviser signifikant episomal vedholdenhed, der nødvendiggør et senere tidspunkt af subkloning at tillade parasit befolkning et tilstrækkeligt antal generation gange at fortynde de vedvarende episomer og løse befolkningen primært stabile integranter.

Score 96-brønds bakke 6-7 dage efter subkloning (type I parasitter) eller 7 - 8 dage efter subkloning (type II parasitter) i brønde, der indeholder en enkelt PFU, identificeret som en enkelt zone af infektion i lysmikroskopi ved enten 40X eller 60X magt. Markere en lille prik på 96-brønds bakke låg til at udpege placeringen af ​​PFU i brønden.
1. Blande indholdet af hver brønd indeholdende en enkelt PFU anvendelse af en pipette på 50 pi (200 ul spids) ved at dirigere fluidumstrømmen over PFU at sprede parasitter i brønden.

Bemærk: Blanding brønden accelererer parasit lyse af HFF monolag. Type I RH stammer vil lysere brønden ~ 4 dage efter blanding, vil type II Pru parasitter lyserer brønden ~ 5 dage efter blanding.

22. Vælg et dusin lyseret brønde (kloner) og ridser på tværs i bunden af ​​hver af disse lyserede brønde med en 0,5-10 pi pipettespids samtidig udarbejdelsen 6 pi parasit løsning. TransFer den 6 ul parasit løsning til en brønd i en 24-brønds bakke indeholdende sammenflydende HFF celler i 1 ml MPA + X selektionsmedium.

Bemærk: Det er vigtigt at ridse bunden af brønden for at holde åbningen boring pipettespidsen i konstant kontakt med parasitter bosiddende i bunden af brønden.

23. Overvåg 24-brønds bakke til lysis af HFF celler.

Bemærk: Type I RH parasitter vil typisk lyserer brønden i 24-brønds format i ~ 4 dage. Type II Pru parasitter vil typisk lyserer brønden i ~ 5 dage.

24. Overfør 2 pi levedygtig parasit opløsning ridset fra bunden af ​​hver brønd i 24-brønds format til den tilsvarende brønd i en ny 24-brønds bakke indeholdende sammenflydende HFF celler og 1 ml MPA + X selektionsmedium per brønd.

Bemærk: Alle parasitter kloner og linjer kan være kontinuerligt mainopretholdt ved at passere 2 pi levedygtig parasit løsning hver 7 dage i denne 24-brønds bakke format.

25. Kontroller, at parasitter lykkedes overført til et nyt 24-brønds bakke ved visuelt at inspicere med lysmikroskopi ~ 18 timer efter passage.
26. Harvest parasitter fra de lyserede brønde i 24-brønds bakke fra trin 23. - 24. hjælp af enten en 1 ml eller 10 ml pipette og overføres parasitten løsning til et Eppendorf-rør.
27. Pelletere parasitter ved 1.400 x g i 7 minutter, en gang i 1 ml phosphat skylle saltvand (PBS), og pelleten igen ved 1.400 x g i 3 minutter.
28. Aspirat PBS fra pillen, tilsæt derefter 200 pi PBS til pillen for at genfordele parasitter. Frys parasitten opløsning ved -80 ° C indtil DNA-isolering.
29. Isoler parasit DNA fra hver klon med et væv DNA-isolering minisæt.
30. Validere målgenet deletion (knockout) ved PCR under anvendelse validering primere (figur 2A-C). Test forfravær af funktionelle kodende region af genet af interesse og bruge opstrøms CXF og downstream thorax genomiske DNA-primere (figur 2A-B) test for tilstedeværelsen af PCR-produkter, der spænder de genomiske målretning flanker og HXGPRT demonstrerer korrekt 5'-og 3' "målrettet integration af HXGPRT gen i slettede gen locus.

Bemærk: Primere til validering skal være unikke for genet af interesse eller et falsk positivt resultat kan opnås. Primer design kan valideres på http://www.toxodb.org ved sprængning primersekvenser til genomet (r) for at kontrollere primere er unikke.

31. Passage parasit kloner på en ugeplan, som beskrevet i trin 24.. Når til målrettet sletning er blevet valideret, fortsatte udvælgelse i MPA + X er valgfrit.
32. Arkiv parasit-kloner ved at forberede fryser bestande. Pellet ekstracellulære parasitterfra lyserede HFF celler i en 25 ^cm2 dyrkningskolbe, fjerne medier og forsigtigt resuspender parasit pellet i cellekultur frysemedium på en parasit koncentration> 4 x 10 ⁷ parasitter per ml. Overførsel alikvoter til kryoglas og gemme parasitter på ubestemt tid i flydende nitrogen eller ved -80 ° C.

2.. Sletning af HXGPRT

Denne protokol er beregnet til at fjerne HXGPRT markør fra dets integration site i genomet af en genetisk manipuleret Δ Ku80 stamme. Fjernelse af HXGPRT tillader markør genopretning og generering af stammer med flere genetiske manipulationer kun bruger markeringer baseret på HXGPRT ^1-3. Medens protokollen beskrevet nedenfor beskriver fremgangsmåden til at re-målrette en locus at slette HXGPRT, skal det bemærkes, at fjernelsen af HXGPRT på gen-locus af interesse også tillader samtidig reintegration af vildtype-genet (complementation), re-integration af et mutantgen, samt re-integration af et kodet gen (N-eller C-terminale GFP, HA-mærke, osv.), der giver mulighed for en række genetiske manipulationer. De virkningsmekanismer ²⁴ og målretning protokoller anvender 6-thioxanthin markeringer er tidligere blevet beskrevet ^1-3,15.

2.1 Slet HXGPRT

1. Udskaer HXGPRT selekterbare markør fra pΔGOI ved fordøjelse med RE.Z at skære på de unikke restriktionsenzymsteder flankerer HXGPRT (figur 1B).
2. Verificere fuldstændig fordøjelse af DNA ved agarosegelelektroforese. Isolere det største af de to bånd fra agarosegelen.

Bemærk: Den største af de to bånd indeholder plasmidet sammen med de 5 'og 3' DNA target flanker, men ikke den HXGPRT genet.

3. Placer agarose, som indeholder større DNA-bånd i en centrifugesøjle laying gel fladt på membranen. Spin søjlen ved 13.000 x g i 4 minutter ved stuetemperatur. Tilføj sterilt H ₂ O til gennemstrømning for at bringe volumen til 100 gl.

Note: Andre kommercielle metoder til at isolere DNA fra agarose.

4. Koncentrer DNA ved EtOH udfældning, resuspendering af DNA i et slutvolumen på 18 pi sterilt H ₂ O.
5. Bland 1 pi koncentreret DNA med 7 ml _H2O, 1 pi 10x ligeringspuffer og 1 pi T4 DNA ligase (5 enheder) og placere reaktionen ved 4 ° C natten over for at generere pΔGOIc (pΔGOIclean) (figur 3A).

Bemærk: DNA-fragmenter med RE.Z indeholder dna ender kan udformes og medtages på dette trin til at oprette plasmider er egnede til målrettet re-integration af vildtypegenet (komplementering), målrettede re-integration af et mutant gen samt målrettet reintegration af et kodet gen(N-eller C-terminale GFP, HA-mærke osv.).

6. Reaktionsblandingen fortyndes 2x med sterilt _H2O før elektroporering.
7. Omdan pΔGOIc ind i E. coli som i protokol 1.1 til subklone, isolere, og validere målretningen plasmid. Så linearize pΔGOIc som forberedelse til transfektion (se trin 1.1.11 til 1.1.26).
8. Gentag parasitten transfektionsprotokol som skitseret i protokol 1.2 (trin 1 til 11).

Bemærk: Forud for gennemførelsen trin 1 til 8, kontrollere, at målrettet fjernelse af HXGPRT er muligt i mutant stamme. Inficere en 150 cm ² flaske sammenflydende HFF celler med 1 x 10 ⁶ tachyzoitter af mutant stamme hjælp 6-thioxanthin (6TX) udvælgelse medium (200 pg / ml 6TX i infektion medium), og kolben anbringes i en PFU assay. Undersøg kolben otte dage senere for at kontrollere at ingen (eller meget få, <10) PFU er synlige, hvilket er afgørende for at fastslå, at potentiale genmålretning effektivitet vil overstige enhver potentiel spontan reversion af mutant stamme til en fænotype med nedsat HXGPRT udtryk (a 6TX resistensfænotype).

Bemærk: Ca. 5 - 10% af HXGPRT integration sites udviser en betydelig og hyppighed af spontane 6TX modstand selvom HXGPRT markør stadig integreret på målrettet websted (se Repræsentative resultater sektion for forklaring).

9. Begynd 6TX udvælgelse ~ 20 timer efter transfektion ved at ændre mediet i 150 ^cm2 kolbe til 6TX selektionsmedium.

Bemærk: Du må ikke forstyrre kolben for ~ 10 dage efter transfektion.

10. Undersøg kolben for PFU dannelse på dag 10-12 post-transfektion (type I parasitter) eller dag 10-16 post-transfektion (type II parasitter).

Note: Parasites at blive målrettet til sletning af HXGPRT vil ikke begynde at vokse under 6TX valg indtil HXGPRT genet og mRNA bliver slettet, og den resterende HXGPRT protein er inaktiveret.

11. Ryst udvælgelsen kolben for at skabe en parasit løsning, og overførsel 0,5-1,0 ml af parasitten løsning på en ny 25 cm ^2-kolbe indeholdende sammenflydende HFF celler og 5 ml 6TX selektionsmedium. Gentag overførslen fra den primære 150 cm ² til nye 25 ^cm2 kolber gang dagligt i to dage mere.

Bemærk: Multiple sampling øger chancerne for at fange levedygtige målrettede parasitter, der har mistet HXGPRT genet.

12. Efterse 25 cm ² kolber ~ 5 dage efter smitte at kontrollere tilstedeværelsen af at udvikle PFU'er med zoner af sunde replikerende parasitter. Pick en eller to kolber indeholdende zoner af infektion.

Note: HXGPRT genet replikere en normal vækst i 6TX valg.

13. Fortsæt med at passage parasitterne i 6TX valg medium.
14. Subklone parasitten befolkning efter 25 - 30 dage af markering. Opsæt en 96-brønds bakke med ~ 1 parasit / godt og et andet med ~ 2 parasitter / brønd.
15. Forbered parasit DNA fra isolerede kloner og fastholde kloner i en 24-brønds format kultur ifølge protokol 1.2 (trin 19-29).
16. Godkend sletning af HXGPRT ved PCR ved den strategi, der er skitseret i figur 3A-B.

3.. C-terminale tagging af proteiner

Denne protokol er udviklet til C-terminal mærkning af proteiner ved at målrette tag for integrationen via dobbelt cross over homolog rekombination på det genomiske locus af genet ved hjælp af MPA + X udvælgelse ^2,4. Denne protokol fungerer effektivt, fordi 5'dhfr sekvens af 2,4.

3.1 Direkte C-terminale mærkning af proteiner endogene genetiske loci

1. Skabe målretning pΔGOItag plasmidkonstruktion bruge gær rekombinatorisk kloning (figur 4) og metoder beskrevet i protokol 1.1. 5'genomiske målretning flanke indeholder de sidste 800 til 1.200 bp af kodningsområdet (eller genomisk DNA) fra den indiske regering, undtagen termineringskodonen er flyttet til en stilling 3 'i forhold til tag valg (HA-mærke, Myc-tag, His-tag , osv.)
2. Opret målrettet indsættelse af C-terminale tag på det endogene locus proteinkodende gen ved at følge trinene i protokol 1.1 og 1.2 ved hjælp af strategien skitseret (figur 4).
3. Kontroller indsættelsen af ​​den C-terminale tag på det endogene gen locus ved hjælp af en PCR-strategi.
4. Retarget genet locus anvendelse af metoder beskrevet i protokol 1, og protokol nr. 2 til delete den HXGPRT selekterbare markør for at skabe en præcist reguleret endogene gen locus, der udtrykker et kodet protein. Denne protokol også genopretter den HXGPRT selekterbare markør, der kan bruges igen til at målrette et andet locus i den mærkede stamme (se protokol 1).

Representative Results

En detaljeret skabelon leveres til konstruktion en målsøgende plasmid at slette et gen, herunder placeringen af restriktionsenzymsteder og generering af de primere, der letter genetiske targeting og validering af gen-targeting, samt plasmidkonstruktion for efterfølgende sletning af HXGPRT i en enkelt proces (Figur 1A-C, figur 2A, 3A). En generel skematisk præsenteres for at gøre en målrettet gendeletion (figur 2A), primerparrene anvendes til validering sletning af en knockout, for eksempel, er type I rop18 (figur 2B), og repræsentative resultater af PCR valideringen vist (fig. 2C). Denne repræsentativt resultat er vist for at illustrere forskellige resultater, der kan opnås ved genetiske loci, der er relativt vanskelige at målrette. En succes målrettet genet vil resultere i fravær af genet af iinteresse PCR-produkt (PCR 1), tilstedeværelsen af 3'genomiske målretning flanke (PCR2), og tilstedeværelsen af den HXGPRT selekterbare markør integreres ordentligt mellem 5'-og 3'-genomiske målretning flanker, der definerer sletningen (PCR3 og PCR4) . Kloner 3, 4, 5, 6, 8, 9 og 11 er validerede målrettet gendeletioner (knockouts) hvor HXGPRT har erstattet den indiske regering (Figur 2C).

En klon, som ikke indeholder en gendeletion kan være repræsenteret ved en række båndmønstre. Typisk vil en klon uden en gendeletion afspejle forældrenes stamme (forældrenes mønster) med bands observeret for PCR1 og PCR2, men ikke for PCR3 eller PCR4 set for kloner 1 og 2 (figur 2C). Denne "forældrenes mønster" opstår fra et par potentielle mekanismer. Lejlighedsvis, MPA resistente udvalgte parasitter bære ikke-integreret vedvarer episomer af pΔGOI målretning plasmid, og vi konstatere, at fortsat selektion ofte tvinger disse episomertil at integrere. Vi også observere nogle sjældne baggrund i type I Δ Ku80 pres, fordi utilsigtet integration af pΔGOI målretning plasmid, som indeholder et HXGPRT cDNA udtrykt via DHFR 5'-og 3'-promotorelementer, i enten DHFR locus eller i det delvist slettet HXGPRT locus ^14.. Mens denne sjældne begivenhed er en målrettet integration, var det ikke den tilsigtede integration og tjener som et centralt punkt at huske i udformningen af ​​ethvert genudskiftning strategi. DNA homologi større end 120 bp transporteres på din pΔGOI målretning plasmid kan være et alternativ site for rekombination i Δ Ku80 stammer ^2, der kan give tilbage en uønsket baggrund. I type II Pru Δ Ku80 stamme denne baggrund er reduceret eller ikke-eksisterende i forhold til type I, fordi HXGPRT selekterbare markør er baseret på type I-sekvenser, der har nucleotide polymorphisms sammenlignet med type II-DNA, somreducerer denne sjældne baggrund ved forsøg med type II Pru Δ Ku80 stammen ^1.. Hvis et gen locus er afgørende (kan ikke slettes) eller har et meget lavt genmålretning frekvensen ved locus, eller hvis vedvarende [ikke-integreret] episomer ikke let elimineres via vækst og udvælgelse, vil dette forældrenes mønster dominerer mønsteret observeret i MPA resistente kloner. Alternativt er det målsøgende DNA-molekyle undertiden observeret at integrere på kun 5 'eller 3' genomiske målretning flanke og et bånd observeres for enten PCR3 eller PCR4 (men ikke begge) sammen med PCR1 og PCR2 som ses for klon 10 (5 'integration) og klon 7 (3' integration) (Figur 2C). Disse mønstre antyder den sjældne forekomst af en enkelt cross over integration af targeting plasmid ved locus, der integrerer HXGPRT men dette målrettet integration ikke slette genet af interesse. Dette mønster (bane 7 & 10 i figur 2C) emphasizes behovet for at rapportere PCR oplysninger til at efterprøve, at en målrettet integration opstod i stedet for en enkelt homolog krydse over og en anden homolog integration af målsøgende molekyle. Sjældent vi observerer en genetisk blanding repræsenteret ved klon 12 (figur 2C), som repræsenterer både en forældre mønster og en målrettet sletning mønster. Dette mønster sandsynligvis opstår lejlighedsvis fra to parasit genotyper der er til stede på samme sted i en kloning godt.

En generel skematisk til fjernelse af HXGPRT fra Δ ku80Δgoi :: HXGPRT at slette HXGPRT fra stammen vist (figur 3A). Primerparret bruges til at validere fjernelsen af HXGPRT fra Δ Ku80 Δ gra2 :: HXGPRT (figur 3B) forstærker en unik ~ 1,2 kbp bånd i PCR5 som set i klonerne 4, 7, 9, 11 og 12 (figur 3C). Hvis HXGPRT ikke fjernes fra locuset, en ~ 3.4 Kbp bånd observeret (kloner 1, 2, 3, 6, 8, 10, og forældrekontrol). Adskillige mekanismer handle for at gøre fjernelsen af HXGPRT (6TX udvælgelse) mere udfordrende og mindre effektive end integrationen af HXGPRT (MPA + X udvælgelse). MPA valg er simpelthen mere effektiv end 6TX valg ^14,16. Desuden er højere niveauer af HXGPRT udtryk nødvendig for 6TX udvælgelse end for MPA valg ^16,24. Derfor kan mutationer, der kan reducere HXGPRT enzymaktivitet eller mutationer eller epigenetiske ændringer, der reducerer ekspressionsniveauet af HXGPRT på et gens locus potentielt afskaffe effektivitet 6TX udvælgelse. Selv med disse udfordringer 6TX udvælgelse, er succesraten for 6TX udvælgelse i Δ Ku80 stammer mere end 90% i første forsøg ^1-3.

En generel ordning for direkte C-terminal mærkning af protein-kodende gener er vist (figur 4). DetOrdningen bruger direkte integration via dobbelt cross over homolog rekombination af HXGPRT 3 'for mærkede genet og også beskæftiger validering strategier svarende til de ovenfor beskrevne. Når et gen er mistænkt for at være et vigtigt gen dette kan kontrolleres ved hjælp af en anden transfektion med et selvstændigt isoleret målrettet DNA plasmid. Alternative metoder, såsom ordninger for reguleret genekspression, er til rådighed for yderligere at kontrollere, om et gen er afgørende ^25..

Figur 1. Oversigt over konstruktionen af en targeting DNA-plasmid. A. Skematisk for at designe overlapper primere anvendt til PCR forstærke 5'-og 3'target flanker med 33 bp overlap for pRS416 shuttle vektor og HXGPRT minigen kassetten. Primere afbildet i skematisk varanvendes til at generere de 5'-og 3'-target flanker pΔROP18 ^10.. B. Generel strategi for at designe et målsøgende DNA-molekyle. Rygraden i pΔGOI er pRS416 shuttle vektor, der indeholder uracil (URA) og ampicillin (AMP) valgbare markører. Indsat i pRS416 er en ~ 1 Kbp 5 'DNA-mål flanke amplificeret fra genomisk DNA med overlapninger for HXGPRT minigenet kassetten og pRS416 hjælp F1 og R1 primere, en ~ 1 Kbp 3' er DNA-mål flanke amplificeret fra genomisk DNA med overlapninger den HXGPRT minigenet kassetten og pRS416 hjælp af F2 og R2 primere og HXGPRT minigen kassette. Følgende unikke restriktionsenzymsteder fordøje sites føjes til primerne: RE.X (restriktionsenzym X kløvningspunkt) i F1 primer til skære plasmidet ved 5'-enden af ​​5'-DNA-mål flanke, RE.Y i R2 primer at skære plasmidet ved 3'-enden af 3 'DNA-mål flanke og RE.Z i R1 og F2 primere til udskære HXGPRT minigene kassette. C. Primersekvenser anvendt til at generere målkonstruktionen for sletning af rop18. Den dristige regioner svarer til T. gondii-genomiske sekvens, og de ​​nonbold regionerne svarer til de restriktionsenzymsteder og sekvenser, der overlapper med pRS416 og HXGPRT minigen kassetten. Den HX_F og HX_R primerpar amplificerer HXGPRT minigen kassetten ^14.. Primere læses fra 5 'til 3'. Tabel tilpasset fra Fentress m.fl. ^10.. Klik her for at se større figur .

Figur 2. Overblik af protokollen for sletning af et gen ved hjælp HXGPRT. A. Disruption af GOI i Δ ku80Δhxgprt stammen af en dobbelt crossover homolog rekombination begivenhed ved hjælp af en ~ 1 Kbp 5 'DNA-mål flanke og en ~ 1 Kbp 3' DNA-mål flanke på plasmid pΔGOI. En PCR-strategi ved hjælp PCR1, PCR2, PCR3 og PCR4 (ikke målfast) vises der gør det muligt genotype verifikation at validere kloner med en målrettet integration af HXGPRT og sletning af den indiske regering locus. B. Repræsentative primerpar designet til at validere sletning af rop18 . ROP18_DF og ROP18_DR forstærke PCR1, ROP18_ExF og ROP18_CxR forstærke PCR2, ROP18_CxF og DHFR_CxR forstærke PCR3 og DHFR_CxF og ROP18_CxR forstærke PCR4 (se figur 2A). Primere læses fra 5 'til 3'. Tabel tilpasset fra Fentress m.fl. ^10. C. Repræsentative resultater af validering af en målrettet gendeletion (rop18) ved hjælp HXGPRT. Efter transfektion af plasmid pΔROP18 ind Δ ku80Δhxgprt og udvælgelse i MPA +X, MPA + X resistente kloner blev analyseret for sletning af rop18. Den parentale stamme kontrol er positiv for PCR 1 (~ 400 bp) og PCR 2 (~ 650 bp) produkt-og negativ for PCR 3 (~ 1.200 bp) og PCR 4 (~ 1.300 bp) produkt. En målrettet GOI knockout er positivt for de PCR2, pCR3 og PCR4 produkter, og er negativ for PCR 1 produkt (se figur 2A). Vist er repræsentative paneler af resultaterne af PCR1 og PCR2 (øverste panel), pCR3 (midterste panel), og PCR4 (nederste panel). Kloner 3, 4, 5, 6, 8, 9 og 11 udviser den korrekte båndmønster PCR 1, PCR2, PCR3 og PCR4 der definerer en målrettet genet begivenhed i klonen. Kloner 1, 2, 7, 10 og 12 er ikke gendeletioner, og svarer til andre potentielle repræsentative resultater. (C = forældrekontrol stamme Δ ku80Δhxgprt, M = størrelse markører). Klik her for at se større figur .

Figur 3. Oversigt over protokollen for re-targeting genet af interesse at slette HXGPRT. A. Strategi for fjernelse af HXGPRT markør af en dobbelt crossover homolog rekombination begivenhed i stammen Δ ku80Δgoi :: HXGPRT hjælp af en ~ 1 Kbp 5 'DNA-mål flanke og en ~ 1 Kbp 3' DNA-mål flanke på plasmid pΔGOIc. PCR strategi for genotype verifikation er afbildet ved hjælp af et primerpar til analyse for et PCR-produkt (PCR5), der spænder over deletion (ikke målfast). B. En repræsentativ primerpar udformet til at validere fjernelse af HXGPRT selekterbare markør fra gra2 locus i stammen Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primere GRA2 _CLF og GRA2_CxR forstærke PCR5. Primere læses fra 5 'til 3'. C. repræsentativt panel af 6TX-resistente kloner, som kan opnås efter transfektion af plasmid pΔGOIc ind Δ ku80Δgoi :: HXGPRT og udvælgelse i 6TX. Kloner 4, 7, 9, 11 og 12 udviser den korrekte båndmønster af PCR5 der svarer til målrettet deletion af HXGPRT markør (~ 1,2 Kbp produkt der spænder over 3'-flanke med svag overlapning med 5'flanke og uden 3' flanke). Kloner 1, 2, 3, 6, 8 og 10 (dette bånd er lys) repræsenterer den forventede båndmønster på omkring ~ 3,4 kbp, der svarer til den parentale klon genotype, selvom disse kloner udviste en grad af resistens over for 6TX som tilladt deres valg (denne fænotype kan lejlighedsvis opstå spontant nedlukning af HXGPRT udtryk (se note i protokol 2.1 (trin 8), og Repræsentant afsnittet Resultater). (C = forældrekontrol stamme Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = størrelse markører).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.

Figur 4.. Design af et målsøgende DNA-molekyle for at mærke den C-terminale ende af et protein. Strategien er baseret på evnen af HXGPRT markør til også fungere som en 3 'nedstrøms regulatoriske region. Rygraden i pΔGOItag er pRS416 shuttle vektor, der indeholder uracil (URA) og ampicillin (AMP) valgbare markører. Indsat i pRS416 er en ~ 1 Kbp 5 'DNA-mål flanke amplificeret fra genomisk DNA med overlapninger for HXGPRT minigenet kassette og pRS416 bruge Fgoi og Rtag primere, en ~ 1 Kbp 3' DNA-mål flanke er blevet amplificeret fra genomisk DNA med overlapninger Den HXGPRT minigenet kassette og pRS416 hjælp af F2 og R2primere og HXGPRT minigenet kassetten. 5'DNA-mål flanke erstatter termineringskodon med tagget (HA, Myc, His, osv.) efterfulgt af en udskiftning termineringskodon. MPA + X udvælgelse integrerer den C-terminale-tag og en nedstrøms HXGPRT og flytter 3'UTR til en stilling efter HXGPRT markør. Følgende unikke restriktionsenzymsteder fordøje sites føjes til primerne: RE.X (restriktionsenzym X kløvningspunkt) i Fgoi primeren at skære plasmidet ved 5'-enden af ​​5'-DNA-mål flanke, og RE.Y i R2 primer at skære plasmidet ved 3'-enden af 3 'DNA-mål flanke, og RE.Z i Rtag og F2 primere til udskære HXGPRT minigenet kassette til brug for plasmid konstruktion at re-målrette det kodede gen locus at slette den HXGPRT markør, der vil genoprette placeringen af 3'UTR.

Discussion

Her giver vi en protokol til effektiv genmålretning i Δ Ku80 parasitstammer at muliggøre effektiv inddrivelse af genetisk manipulerede afkom, der besidder målrettede gendeletioner, gen udskiftninger, og / eller mærkede gener. Den sekventielle udførelse af disse metoder giver en pålidelig fremgangsmåde til isolering af parasitten mutanter, der indeholder en enkelt eller flere målrettede genetiske manipulationer ^1-3. Mens dannelsen af en målrettet deletion afhænger af flere faktorer, brugen af Δ Ku80 stamme med den præsenterede strategi og protokol øger effektiviteten og nem at gøre præcist definerede mutantstammer af T. gondii for funktionelle genomiske studier.

Genomet af T. gondii under ukønnede stadier er haploide. Således vil en overvejelse at gøre, når du planlægger at slette et gen er, at genet ikke må være afgørende in vitro. Ikke desto mindre effektivitet Angrebsskjoldetteret gen knockouts i Δ Ku80 stammer er ekstremt høj, og dette muliggør isolering af muterede stammer med væsentligt forringede replikation satser. Hvis en målrettet gen er afgørende, parasitter ofte ophøre med at replikere under selektion. En anden afgørende faktor i målrettet genetisk manipulation er det perfekte homologi med mindst 620 bp af det genomiske målretning flanke er nødvendig for at opnå påviselige målrettede integrationer ^2.. Længere homologiregioner producere højere virkningsgrader målrette og bruge målretning DNA flankerne af cirka 1.000 bp er en pålidelig og effektiv tilgang ^1-4. Af denne grund er det vigtigt, at genomiske målretning flanker er genereret ud fra den samme stamme af T. gondii (RH, Pru) som stamme, der bliver genetisk manipuleret. Mangel på tilstrækkelig homologi kan ofte resultere i målrettet integration af et genomisk målretning flanke, men ikke den anden. Ufuldstændig integration eller manglende opnå en knockout may også skyldes episomalt vedholdenhed. Umiddelbart efter transfektion alle de målsøgende molekyler ikke-integreret episomer, og undertiden målsøgende molekyler kan forblive som episomer i mange generationer. Hjælp mål-DNA flanker ~ 1 Kbp og fortsat at passere parasitter under selektion før re-subkloning ofte løser problemer forbundet med episomal vedholdenhed.

Når en knockout er valideret, og HXGPRT markør er fjernet, kan det gen målretningsstrategi gentages ved en anden indiske regering til at generere flere gendeletioner i et enkelt parasit stamme ^1-3. Generering af deletioner, udskiftninger eller mærkede gener kan også opnås ved hjælp af forskellige selekterbare markører (bleomycin, CAT, pyrimethamin resistent DHFR, osv.). Selvom CAT selekterbare markør i øjeblikket er til stede i type II-Δ Ku80 Pru genom ^1, kan denne markør fjernes med HXGPRT HXGPRT valg den sikreste og mest effektive markør med den højeste målrettet effektivitet, hvor en enkelt kopi målrettet indsættelse er tilstrækkelig til robust udvælgelse i MPA + X medium. HXGPRT giver også den eneste i øjeblikket nyttig metode til målrettet sletning af en selekterbar markør (fig. 3) under anvendelse af 6-thioxanthin (6TX) udvælgelse ^2,3. Således denne protokol giver den eneste nuværende tilgang til udvikling af definerede mutantstammer med flere målrettede genetiske manipulationer.

Denne protokol giver en værdifuld og effektiv metode til målrettet genmanipulation i Δ Ku80 stammer af Toxoplasma gondii, og er gældende for analyse af et enkelt gen, en familie af gener, eller genom-dækkende funktionelle genomiske studier. Forud for tilgængeligheden af Δ Ku80 stammer ^1,2, disse tilgange var ikke bredt gennemførlige på grund af inefficiency af disse metoder. Derfor denne protokol er bredt anvendelig til målrettet genmanipulation af Toxoplasma gondii og er tilgængelig for alle investigatorer interesseret i at løse en række spørgsmål om parasit biologi, værtsrespons og funktionel genomik.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Overlap Primers	Integrated DNA Technologies		4 nmole Ultramer DNA oligos
Validation Primers	Integrated DNA Technologies		100 nmole DNA Oligo
Yeast Strain #90845	ATCC		Designation FY834
Shuttle Vector pRS416	ATCC	87521
DH10B E. coli	Invitrogen	12033-015	SOC broth in kit with E. coli
Resuspension Buffer	Qiagen		Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit
Miniprep Kit	Qiagen	27104	QIAprep Spin Miniprep Kit
Glass Beads	Scientific Industries	SI-BG05	0.5 mm acid-washed
Qiacube Automated Robotic Work Station	Qiagen
Electroporation Cuvette	USA Scientific	9104-5050	2 mm-gap
BTX600 electroporator	BTX
Maxiprep Kit	Qiagen	12662	QIAprep Spin Maxiprep Kit
25 cm2 Canted neck plug seal flask	Corning	430168
150 cm2 Canted Neck plug seal flask	Corning	430823
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells	ATCC	SCRC1041
Swin-lok Filter Holder	Whatman	420200	25-mm-diameter
Membrane	Whatman	110612	Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter
Mycophenolic acid (MPA)	Sigma
Xanthine (X)	Sigma
96-well Tissue Culture Tray	Corning Costar
24-well Tissue Culture Tray	Corning Costar
MEM Eagle Media	Lonza Biowhittaker	12-611F
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-111
Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)	Gibco	15240-062
Spin Column	Primm Labs	PAE-100	Easy Clean DNA Extraction Spin Kit
T4 DNA Ligase	New England Biolabs
6-thioxanthine	Acros Organics
Tissue DNA Minikit	Qiagen	51104	QIAamp DNA Blood Mini Kit
Cell Culture Freeze/Recovery Media	Gibco	126-48-010
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30028.02	minus calcium, minus magensium