Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Genetisk manipulation i Published: July 12, 2013 doi: 10.3791/50598
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, The Geisel School of Medicine at Dartmouth

Summary

Här rapporterar vi ett förfarande för användning av typ I och typ II

Abstract

Riktad genmodifiering använder homolog rekombination är den metod som föredras för funktionell genomisk analys för att få en detaljerad vy av geners funktion och fenotyp (s). Utvecklingen av muterade stammar med riktade gendeletioner, riktade mutationer, kompletterade genfunktionen, och / eller märkta gener ger kraftfulla strategier för att ta itu geners funktion, särskilt om dessa genetiska manipulationer effektivt kan riktas till genlokus intressepunkt med integration förmedlad genom att dubbelklicka gå över homolog rekombination.

På grund av mycket höga nonhomologous rekombination, funktionell genomisk analys av Toxoplasma gondii har tidigare begränsats av bristen på effektiva metoder för inriktning gendeletioner och ersättare gen till specifika genetiska loci. Nyligen, avskaffade vi den stora vägen för icke-homolog rekombination i typ I och typ II stammar av T. gondii genom att ta bort genen encoding den Ku80 proteinet 1,2. De Δku80 stammarna beter normalt under tachyzoite (akut) och bradyzoite (kronisk) stadier in vitro och in vivo och uppvisar i huvudsak en 100% frekvens av homolog rekombination. De Δ Ku80 stammar gör funktionella genomiska studier genomförbart på enstaka gen samt på genomet skala 1-4.

Här rapporterar vi metoder för att använda typ I och typ II Δku80Δhxgprt stammar att avancera genmålinriktning strategier i T. gondii. Vi beskriva effektiva metoder för att generera gendeletioner, utbyten genen och taggade gener genom riktade införande eller borttagande av hypoxantin-xantin-guaninfosforibosyltransferas (HXGPRT) valbar markör. Den beskrivna genmålsökning protokoll kan användas i en mängd olika sätt i Δku80 stammar till för funktionell analys av parasiten genomet och att utveckla enstaka stammar som bärflera riktade genetiska manipulationer. Tillämpningen av denna genetiska metod och efterföljande fenotypiska analyser kommer att avslöja grundläggande och unika aspekter av biologi T. gondii och tillhörande viktiga mänskliga patogener som orsakar malaria (Plasmodium sp.) och kryptosporidios (Cryptosporidium).

Introduction

Toxoplasma gondii är en vanlig obligat intracellulär protozo parasit som ofta och kroniskt infekterar en rad olika djur och människor 5. Det uppskattas att mer än 1 miljard människor är närvarande och kroniskt smittade av denna patogen. Förutom vikten av sjukdom orsakad av T. gondii-infektion, den ökade tillgången på experimentella verktyg, kraftfulla genomik resurser 6, enkel in vitro tillväxt och utmärkta modeller mus har gjort T. gondii en ledande modell för den bredare studie av intracellulära eukaryota patogener och andra viktiga parasiter apicomplexan som orsakar förödande sjukdomar såsom malaria (Plasmodium sp.) och Cryptosporidios (Cryptosporidium) 5,7. En betydande begränsning av Toxoplasma gondii som modell organism har varit ineffektiv återvinning av avkomma som bär riktade genetiska manipulationer. Denna problematiskm Riktad genmodifiering beror på en låg frekvens av homolog rekombination i förhållande till den mycket höga frekvensen av icke-homolog rekombination i vildtyp stammar av T. gondii även när omfattande DNA-homologi finns i DNA-molekyler mål används i genetiska studier 2.

Vi har nyligen genetiskt blockerade viktig väg av icke-homolog rekombination i typ I och typ II-stammar av Toxoplasma gondii genom att ta bort genen som kodar för proteinet Ku80 1,2. Den erhållna typ I och typ II Δ Ku80 stammar uppvisar normala tillväxt, storlek och beteende både in vitro och in vivo under tachyzoite och bradyzoite stadier in vitro och in vivo, men dessa stammar uppvisar i huvudsak en 100% frekvens av homolog rekombination och detta fenotyp ökar sannolikheten för snabbt önskade isolera avkomma av riktade genetiska manipulationer med flera hundra till flera thousand-faldig 1,2,4. Senaste community-bred användning av typ I och typ II Δ Ku80 stammar har betydligt ramped upp tempot, sorten, liksom andelen framgångsrika riktade genetiska strategier i T. gondii 1-4,8-13. Här beskriver vi ett omfattande protokoll för målinriktad gendeletion, genutbyte, och genen taggning i Δ Ku80 stammar av T. gondii. Vi visar hur man designar och tillförlitligt rikta genetiska manipulationer till specifika gener eller genetiska loci i Δ Ku80 stammar av Toxoplasma gondii.

Protocol

Ett. Riktad genmodifiering för att ta bort en gen av intresse

Detta protokoll är utformad för effektiv generering av en mutant stam som har en riktad gendeletion vid en definierad genetiskt lokus. Den tidigare beskrivna T. gondii hypoxantin-xantin-guaninfosforibosyltransferas (HXGPRT) valbar markör används i detta protokoll för säker och tillförlitlig markör insättning efter mykofenolsyra och xantin (MPA + X) val 14-16. Detta protokoll använder en validerad och kostnadseffektiv metod för att konstruera DNA-målsökande molekyler baserade på jäst rekombinationskloning 17,18. Flera alternativa protokoll är kommersiellt tillgängliga för konstruktion av rekombinanta målsökande molekyler genom att använda bakteriella rekombinationskloning metoder, in vitro-rekombinatoriska kloningsmetoder, eller fusion PCR. Protokollet som beskrivs nedan ger högsta totala effektivitet och tillförlitlighet återvinna klonade punkternaiter som har en riktad gendeletion i Δ Ku80 stammar av T. gondii.

1.1 Beredning av targeting DNA

  1. Tillgång ToxoDB 6 ( http://www.toxodb.org ) för att erhålla genomiska sekvenser för genen av intresse (GOI).

Obs: Genomiska sekvenser bör erhållas från typ I, II eller III-genomen sekvens i ToxoDB databas som är närmast stammen manipuleras. Till exempel: GT1 för RH och ME49 för Pru.

  1. Design specifika överlappande primrar som amplifierar 5 'och 3' genomiska riktade flanker av genen av intresse (GOI) som innehåller en 33 bp överlappning med jästskyttelvektorn pRS416 (eller alternativt pRS426) och införliva en 33 bp överlappning med den selekterbara markören ( HXGPRT) (fig. 1A-B). Lägg ett unikt restriktionsenzymställe i varje primer vid båda ändarna av den 5 'ennd 3 'genomiska riktade flanker, placerade mellan 33 bp överlappning och T. gondii-specifik primersekvens (er) (fig. 1A-B).

Anmärkning: En större än 30 bp överlappning krävs för effektiv jäst rekombination kloning. De 5 'och 3' genomiska inriktning flanker är utformade för att amplifiera specifika DNA-fragment mellan 800 och 1400 bp som definierar en riktad deletion. Var medveten om att kortare flankerna avsevärt kommer att minska inriktning effektivitet i Δ Ku80 Δ hxgprt bakgrund 2.

  1. PCR amplifiera 5'mål flanken med användning av primers F1 och R1, och PCR-amplifiering av 3'-mål-flanken med användning av primer F2 och R2 (figurerna 1A-C) från genomiskt DNA 3. Separat PCR amplifiera ~ 2 Kbp HXPGRT genen innefattande den tillhörande 5-och 3'-dhfr-flankerande regioner av HXGPRT cDNA pminiHXGPRT kassett 14 med användning av primrarna HXF och HXR(Figurerna 1B-C).

Obs: Amplify mål flankerna med genomisk DNA från moderstammen skall transfekteras.

Obs! Sätt HXGPRT markör i den främre orientering i förhållande till 5 'och 3' DNA targeting flanker att underlätta påföljande effektiva genetiska manipulationer, såsom riktad avlägsnande av HXGPRT från den sönderdelade lokuset.

  1. Verifiera korrekta PCR-produktstorlekar genom agarosgelelektrofores och uppskatta koncentrationen DNA-fragmentet med hjälp av agarosgel-standarder eller annan metod för bestämning av DNA-koncentration.
  2. Generera kompetenta jäst portioner som beskrivs i Gietz och Schiestly 17.
  3. Kombinera 50 ng av 5 'genomiska targeting flank, 50 ng av 3' genomiska targeting flank, 100 ng HXGPRT selektionsmarkör, och 50 ng av linjäriserad skyttelvektor med sterilt H2O för att uppnå en slutlig volym av 10 -20 | il. Transformera kompetenta jäst med de tre PCR-produkter och jäst-E. coli-skyttelvektor för rekombinatorisk kloning med användning av protokollet som beskrivs av Gietz och Schiestly 17. Plate transformerade jästen på uracil-minus minimalplattor medelstora agar och inkubera vid 30 ° C i 2 - 3 dagar.

Obs: Den ordnade montering av plasmiden, den 5 "mål flanken, den HXGPRT markör, och 3'-mål-flanken underlättas av de konstruerade 33 bp överlappning mellan DNA-fragment (fig. 1A-B) och förmedlas av homolog rekombination i jäst.

  1. Harvest jäst genom att tillsätta 2 ml av 2x YPAD till uracil-minus plattor och försiktigt skrapa för att driva bort kolonier utan att störa agar. Centrifugera jästen lösningen i 5 min vid 5000 xg och kassera supernatanten.
  2. Resuspendera jästen pelleten i 250 | il av en resuspension buffert innehållande RNasA och tillsätt 50-100 pl av encid-tvättade glaspärlor till lösningen. Vortex under 5 minuter på högsta hastighet för att krossa jästcellerna.
  3. Låt glaspärlor för att sedimentera till botten av röret och för över supernatanten till ett 2 ml Eppendorf-rör.
  4. Isolera jäst-DNA med användning av en miniprep kit DNA-isolering, återsuspendering i en slutlig volym av ~ 100 | il.
  5. Blanda 2 pl jäst-DNA (~ 50 ng) med 40 pl DH10B elektroporation kompetent E. coli hålls på is.
  6. Överför lösningen till en kyld 2 mm gap elektroporationskuvett och electroporate bakteriecellerna på 2,4 kV och 129 Ω.
  7. Rescue celler genom tillsats av 0,8 ml SOC buljong till varje kyvett och överföra lösningen till en 14 ml snap-cap Falcon rör. Inkubera cellerna vid 37 ° C på en vals trumma för 40 - 60 min.
  8. Plate E. coli på 2xYT + ampicillin (AMP)-plattor och inkubera plattorna vid 37 ° C över natten.
  9. Välj ~ 6 - 8 enstaka kolonier och växa i 3 ml 2XYT + AMP för ~ 16 timmar vid 37 ° C.
    10. E. coli klon.
  10. Isolera plasmiden pΔGOI från E. coli-kloner med användning av en miniprep kit, återsuspendering i en slutlig volym av ~ 100 | il.
  11. Validera pΔGOI med restriktionsenzym smälter för att mäta DNA-plasmid storlek och verifiera den förväntade pΔGOI DNA banding mönster.
  12. Finalize validering av pΔGOI genom DNA-sekvensering av 5'-och 3 'genomiska riktade flanker att kontrollera 100% DNA-sekvens baserad på data genomsekvens i http://www.ToxoDB.org .

Obs: Nära perfekt sekvenshomologi är viktigt för att maximera genmålstyrning effektivitet 3 eftersom varje baspar skillnad utgör ett motsvarande snitt i längd perfekt homologi.

Anmärkning: genomsekvens av typ II Δku80 stammen baserad på Pru föräldra stregn är inte tillgänglig just nu. Detta arbete använder typ II ME49 genomet sekvens som surrogat genomet för typ II Δ Ku80 stammen. Baserat på sekvensdata vid ett antal genetiska lokus, uppskattas det att ME49 genomet och Pru genomet uppvisar singelnucleotidepolymorphisms med en frekvens av ~ 1 per 10.000 nukleotider, eller mindre.

  1. Generera> 200 pg pΔGOI lager genom att ympa en ~ 250 ml 2XYT + AMP övemattsodling med glycerol lager från en validerad E. coli miniprep klon.
  2. Isolera pΔGOI plasmid-DNA från den stora kulturen med hjälp av en maxiprep kit DNA-isolering, återsuspendering i en slutlig volym av ~ 1000 il.
  3. Upprepa restriktionsenzym klyvningar, eller DNA-sekvensering av pΔGOI maxiprep DNA för att verifiera korrekt målsöknings-DNA-molekylen före transfektion.
  4. Linjärisera ~ 15 ^ g pΔGOI vid 5'-änden med användning av den unika restriktionsenzymet X (RE.X)digest webbplats inbyggd i 5 "mål flanken (figur 1B).

Obs: genmålsökning i T. gondii kräver minst ~ 10 ^ g av målsöknings-DNA för att erhålla en effektiv frekvens på målinriktning evenemang på genlocus av intresse 2.

  1. Verifiera linjärisering av pΔGOI och bestämma DNA-koncentrationen genom agarosgelelektrofores eller en alternativ metod.

Obs: Om restriktionsenzymdigerering vid 5'flanken inte ger fullständig linjärisering, den designade 3 'kan unika RE.Y digest webbplats kan användas som en alternativ plats för linjärisering av pΔGOI.

Obs: En helt linjär inriktning DNA-molekylen är avgörande för framgångsrik genmålinriktning genom homolog rekombination i Δ Ku80 stammarna.

  1. Neutralisera restriktionsenzymet genom incubatning vid 68 ° C under 15-20 min.
  2. Bered minst 15 ^ g av lineariserad plasmid i 100 | il sterilt H2O Store lineariserad pΔGOI vid -20 ° C tills tiden för transfektion.

1.2 Beredning av T. gondii parasiter, transfektion, urval, subkloning, validering, arkiv och underhåll av genetiskt manipulerade stammar

Allmänna metoder för odling och manipulation av T. gondii i mänskliga (HFF) förhudsfibroblast celler beskrivs 19-21. De Δ Ku80 Δ hxgprt stammar replikera normalt i parasitinfektion medium (Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) tillväxtmedium kompletterat med 1% fetalt bovint serum (FBS) och 1% Antimykotika-Antibiotikum utspädd från en 100x lager) 1,2. Allt arbete med Toxoplasma gondii utföras med skyddsnivå 2 förfaranden. T. gondii RHΔ Ku80 2 parental stammen genererades från RHΔ hxgprt stammen från Roos Lab 14. Den PruΔku80 en moderstammen genererades från PruΔhxgprt (Pru gniaud stam BSG-4 22) som innehåller en stabilt integrerad CAT selekterbar markör och ett grönt fluorescerande protein (GFP) reporter under kontroll av den bradyzoite stadiet specifika promotorn LDH2.

  1. Inokulera en 25 cm 2 kolv innehållande sammanflytande HFF-celler med 1 x 10 6 livskraftig typ I RH Δ Ku80 Δ hxgprt parasiter, eller inokulera två 25 cm 2 kolvar med 2 x 10 6 livskraftig typ II Prugniaud (Pru) Δ Ku80 Δ hxgprt parasiter.

Obs: Livskraftiga parasiter definieras som extracellulära parasiter som nyligen har lyserade ut.

Anmärkning:

  1. Inspektera Δ Ku80 Δ hxgprt infekterade kulturer ~ 68-72 timmar efter infektion. Kontrollera förekomsten av livskraftiga parasiter och ~ 90 - 95% lys av HFF-celler för att planera den exakta tidpunkten för transfektion.

Obs: Isoleringen av nyligen egressed parasiter är avgörande för att lyckas med detta protokoll eftersom låg parasit lönsamheten kommer att avskaffa gen-targeting effektivitet.

  1. Rör om livsdugliga parasiter i lösning genom att stänga propp lock på 25 cm 2 kolv och kraftfullt skaka kolven fram och tillbaka att röra om parasiter bort av tillväxtytan utan stänk vätska på insidan av locket eller kolvens hals .

Obs: Parasit skörd kräver inte en spruta-nål frisättning protokoll för typ I ellerTyp II Δ Ku80 stammar.

  1. Överför parasiten lösningen till en 10 ml spruta fäst till en filterhållare innehåller en 3 ^ m membran och placera filterenheten ovanpå en öppen 15 ml skruvkork rör. Sprutfilter parasiter in i 15 ml skruvkork rör.

Obs: Filtrering parasiterna genom membranet avlägsnar infekterade celler och cellulära skräp.

  1. Bestäm parasiten koncentration (tachyzoite blanketter per ml) med hjälp av en hemocytometer.

Obs: Valfritt: Använda parasiten lösningen, inrätta en plackbildande enhet (PFU) analys 21 som kommer att läsas 7 - 8 dagar senare för att bestämma lämplig bärkraft de transfekterade parasiter (PFU att tachyzoite förhållande ≥ 0,2).

  1. Pellets parasiter för 7 min vid 1400 xg och aspirera supernatanten till ~ 0,4 ml utan att störa parasiten pelleten. Spin i 2 min vid 1,400 xg och aspirera återstående supernatanten till ~ 0,01 ml utan att störa parasiten pelleten.
  2. Resuspendera pelleten parasit genom att ställa botten av röret och omedelbart lägga cytomix 23 buffert (1.33x koncentration) på parasitens pelleten för erhållande av en parasit koncentration av 4-5 x 10 7 parasiter / ml cytomix.

Notera: Utelämna tillsats av ATP och glutation till cytomix eftersom dessa tillägg inte effektivisera genmålsökning.

  1. Tina 100 | il alikvot av den linjäriserade pΔGOI från protokoll 1,1 (steg 26).
  2. Överför 0,3 ml av parasiten cytomix lösning (~ 1,3-1,6 x 10 7 parasiter) till 100 | il av linjäriserad pΔGOI från protokoll 1,1 (steg 26), och omedelbart överföra hela 0,4 ml parasit + pΔGOI blanda till en kyld 2 mm spalt elektroporeringskyvett.
  3. Electroporate parasiterna på 1,4 kV och 24 Ω.
  4. Rest transfektion kyvett vid rumstemperatur i ~ 5 minuter sedan överföra hela innehållet i transfektion kyvetten i en 150 cm 2 kolv innehållande sammanflytande HFF-celler med 30 ml infektion medelstora och inkubera den infekterade kulturen över natten.
  5. Börja selektion i mykofenolsyra + xantin (MPA + X) ~ 20 h efter transfektion (fig 2A) genom att ersätta infektion mediet med MPA + X selektionsmedium (MPA (25 | ig / ml) och xantin (50 | ig / ml) i infektion medium).

Obs: Inte störa inkubera MPA + X urval kolv.

  1. Uppskatta det totala antalet PFU i MPA + X urval kolv ~ 8 dagar efter transfektion genom visuell inspektion monoskiktet. Kontrollera att det finns att utveckla PFU och friska zoner av infektion med ljusmikroskop.

Obs: Om plack inte syns vid dag 8, upprätthålla urval och skärmen för tecken på smittaion sedan muterade stammar kan ha en reducerad replikering takt.

Anmärkning: De Δ Ku80 Δ hxgprt parasitstammar har en extremt låg bakgrund av oönskade icke-målbestämd händelser, vilket möjliggör den framgångsrika isoleringen av mutanta stammar med ganska svår, men inte letala defekter tillväxt. Om en gen är viktig och det kan inte tas bort, det primära transfektion, eller senare passerade parasit befolkningen, kan avslöja en fenotyp där parasiterna upphör att replikera under valet som befolkningen beslutar att riktade knockouts.

  1. Skaka kolv som i steg 3 för att driva bort extracellulära parasiter från monolagret [efter synliga plack har utvecklat] för att generera en parasit lösning. Överför ~ 0,5 ml av parasiten lösningen från MPA + X val kolven till en 25 cm 2 MPA + X urval kolv innehållande sammanflytande HFF-celler (utse denna 1A kultur pass).
  2. Få bort parasits i de ursprungliga 150 cm 2 MPA + X urval kolv ~ 3 dagar senare och överföring ~ 0,5 ml parasit lösning till en andra 25 cm 2 MPA + X urval kolv innehållande sammanflytande HFF-celler (utse denna 1B kultur pass).
  3. Tillåt zoner infektion utvecklas i Pass 1A och / eller passera 1B kolvar för ~ 5 dagar. Visuellt kontrollera genom Ijusmikroskopi som passerar 1A och kolvar 1B innehåller ett minimum av 25 livsdugliga PFU med friska zoner av infektion.
  4. Välj antingen pass 1A eller pass 1B kolv för fortsatt passage i MPA + X selekteringsmedium i 25 cm 2 kolvar. Behåll passage under MPA + X urval.

Obs: Parasiter måste odlas för ett tillräckligt antal generationer att radera icke-integrerade kvarstående episomer från befolkningen före subkloning. Utför inte subkloning före till 20 dagar efter transfektion för typ I RH Δ Ku80 Δ hxgprt, eller före 25 dagar efter transfektion förtyp II Pru Δ Ku80 Δ hxgprt parasiter att ge tillräcklig tid för att späda icke-integrerade episomer 1,2.

  1. Subklon parasiter i en platta med 96 brunnar innehållande konfluenta HFF-celler med MPA + X selektionsmedium. Förbered en bricka i en koncentration av 1 parasit / brunn och ett andra fack vid en koncentration av 2 parasiter / brunn.

Obs: subklonen parasiter som nyligen har lyserade (~ 90 - 95% av HFF-celler i 25 cm 2 kolv) för att se till att parasiterna har hög lönsamhet.

Anmärkning: Den optimala tidsramen efter transfektion för subkloning fastställdes genom att mäta hur snabbt framgångsrikt riktade parasiter uppstår vid en hög frekvens i den valda populationen 1.

  1. Fortsätt att passagen den primära populationen av transfekterade parasiter i MPA + X selekteringsmedium med en veckovis passage schema att infekteraen 25 cm 2 HFF kolv med 10 ìl av parasiten lösningen.

Obs: Om kloner som bär den riktade gendeletionen (knockouts) inte erhålls från den första subkloning i steg 18, resubclone parasiterna från kontinuerligt underhållas populationen ~ 10 - 12 veckor efter transfektion.

Anm: En av orsakerna en gendeletion erhålls inte härrör från den episomala persistens av vissa pΔGOI plasmider. Episomal uthållighet bestäms av de sekvenser som finns i 5 'och 3' genomiska riktade flanker och verkar inte uppstå ur HXGPRT genetiskt element. Ungefär 5 - 10% av riktade plasmider uppvisar betydande episomal uthållighet som kräver en senare tidpunkt för subkloning att tillåta parasiten befolkningen ett tillräckligt antal generationstider att späda de ihållande episomer och lösa befolkningen huvudsakligen stabila integranter.

    Betyg den 96-brunnar 6-7 dagar efter subkloning (typ I parasiter) eller 7-8 dagar efter subkloning (typ II parasiter) för brunnar som innehåller ett enkelsträngat PFU, identifierad som en enda zon av infektion i Ijusmikroskopi vid antingen 40X eller 60X makten. Markera en liten prick på 96-brunnar lock för att beteckna placeringen av PFU i brunnen.
  1. Blanda innehållet i varje brunn innehållande en enda PFU användning av en pipett inställd på 50 | il (200 | il spets) genom att rikta fluidflödet över PFU att dispergera parasiter i brunnen.

Obs: Blanda väl accelererar parasiten lys av HFF monolager. Typ I RH stammar lysera den väl ~ 4 dagar efter blandning, kommer typ II Pru parasiter lysera väl ~ 5 dagar efter blandning.

  1. Välj ett dussin lyseras brunnar (kloner) och skrapa längst ned på varje av dessa lyserade brunnar med en 0,5-10 l pipett spets samtidigt drar upp 6 pl parasit lösning. Transfer den 6 pl av parasit lösning till en brunn i en 24-brunnar innehållande sammanflytande HFF-celler i 1 ml MPA + X selektionsmedium.

Obs: Det är viktigt att skrapa på botten av brunnen för att hålla öppningen borrning av pipettspetsen i konstant kontakt med parasiter som bor i botten av brunnen.

  1. Övervaka 24-brunnar för lys av HFF-celler.

Obs: Typ I RH parasiter typiskt lysera väl i 24-brunnar i ~ 4 dagar. Typ II Pru parasiter kommer typiskt lysera väl i ~ 5 dagar.

  1. Överför 2 pl av livskraftig parasit lösning skrapat från botten av varje brunn i 24-brunnars format till motsvarande brunn av en ny 24-brunnar innehållande konfluenta HFF-celler och 1 ml MPA + X selektionsmedium per brunn.

Obs: Alla parasiter kloner och linjer kan vara kontinuerligt mainupprätthålls genom att passera 2 pl livskraftig parasit lösning var 7 dagar i 24-brunnar format.

  1. Kontrollera att parasiter framgångsrikt överförts till ett nytt 24-brunnar genom visuell inspektion med ljusmikroskop ~ 18 timmar efter passage.
  2. Harvest parasiter från de lyserade brunnar i 24-brunnar från steg 23 till 24 med hjälp av antingen en 1 ml eller 10 ml pipett och överför parasiten lösningen till ett Eppendorf-rör.
  3. Pellet parasiterna vid 1400 x g under 7 min, skölj en gång i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och pelleten igen vid 1400 x g under 3 min.
  4. Sug PBS från pelleten, tillsätt sedan 200 l PBS till pelleten att suspendera parasiter. Frys den parasit lösningen vid -80 ° C tills DNA-isolering.
  5. Isolera parasit-DNA från varje klon med användning av en vävnad Minikit DNA-isolering.
  6. Validera målsökta genen deletion (knockout) genom PCR med användning validering primrar (figurerna 2A-C). Test för denfrånvaro av den funktionella kodande regionen av genen av intresse och att använda den uppströms CXF och nedströms CXR genomiska primrar DNA (figurerna 2A-B)-test med avseende på närvaro av PCR-produkter som spänner över de genomiska riktade flanker och HXGPRT att demonstrera korrekt 5 'och 3 "målinriktad integrering av HXGPRT genen i den deleterade genlokuset.

Obs: Primrar för validering måste vara unikt till genen av intresse eller ett falskt positivt resultat kan erhållas. Primer design kan valideras på http://www.toxodb.org genom sprängning primersekvenser till genomet (er) för att kontrollera primrar är unika.

  1. Passage parasit kloner på ett veckoschema som beskrivs i steg 24. När det riktade raderingen har validerats är fortsatt urval i MPA + X frivillig.
  2. Arkiv parasit kloner genom att förbereda frys bestånd. Pellets extracellulära parasiterfrån lyserade HFF-celler i en 25 cm 2 kulturen kolv, ta bort media och försiktigt återsuspendera parasit pelleten i cellkultur frysmediet vid en parasit koncentration> 4 x 10 7 parasiter per ml. Överför alikvoter till kryokärl och parasiter lagra på obestämd tid i flytande kväve eller vid -80 ° C.

2. Deletion av HXGPRT

Detta protokoll är utformad för att ta bort HXGPRT markören från sin integration plats i genomet hos en genetiskt manipulerad Δ Ku80 stammen. Borttagning av HXGPRT möjliggör markör återvinning och alstring av stammar med flera genetiska manipulationer med enbart val baserade på HXGPRT 1-3. Medan protokollet beskrivs nedan beskriver metoden för att omorientera ett lokus för att radera HXGPRT, bör det noteras att avlägsnande av HXGPRT på gen-lokus av intresse också medger samtidig återintegrering av den vildtypgenen (complementation), återintegrering av en muterad gen, samt återintegrering av en taggad gen (N-eller C-terminala GFP, HA-tag, etc,), vilket möjliggör en mängd olika genetiska manipulationer. De verkningsmekanismer 24 och riktar protokoll med 6-tioxantin val har tidigare beskrivits 1-3,15.

2,1 Radera HXGPRT

  1. Excise HXGPRT selekterbara markören från pΔGOI genom digerering med RE.Z att skära på de unika restriktionsenzymställena flankerar HXGPRT (Figur 1B).
  2. Verifiera fullständig digerering av DNA med agarosgelelektrofores. Isolera den större av de två banden från agarosgelen.

Obs: Den större av de två banden innehåller plasmiden tillsammans med 5 'och 3' DNA flankerna mål, men inte HXGPRT genen.

  1. Placera agaros avsnitt som innehåller större DNA-bandet i en spin kolumn laying gelén platt på membranet. Snurra kolonnen vid 13.000 x g under 4 min vid rumstemperatur. Tillsätt steril H2O till genomflödet för att bringa volymen till 100 | il.

Obs: Andra kommersiella metoder finns tillgängliga för att isolera DNA från agaros.

  1. Koncentrera DNA genom EtOH utfällning, återsuspendering av DNA i en slutlig volym av 18 | il sterilt H2O
  2. Blanda 1 il av koncentrerade DNA med 7 ml H2O, 1 | il 10 x ligeringsbuffert och 1 | il T4-DNA-ligas (5 enheter) och placera reaktionen vid 4 ° C över natten för att generera pΔGOIc (pΔGOIclean) (figur 3A).

Obs: DNA-fragment med RE.Z innehållande DNA ändar kan utformas och införas i detta steg för att skapa plasmider lämpade för målinriktat återintegrering av vildtypgenen (komplettering), riktad återintegrering av en muterad gen samt riktade återintegrering av ett taggat gen(N-eller C-terminal GFP, HA-markör, etc).

  1. Späd reaktionsblandningen 2x med sterilt H2O före elektroporering.
  2. Förvandla pΔGOIc till E. coli som i protokoll 1,1 att subklona, ​​isolera, och validera den målsökande plasmiden. Sedan linearisera pΔGOIc inför transfektion (se steg 1.1.11 till 1.1.26).
  3. Upprepa parasiten transfektion protokoll som anges i protokoll nr 1.2 (steg 1 till 11).

Obs: Innan genomföra steg 1 till 8, kontrollera att riktade borttagning av HXGPRT är genomförbart i den muterade stammen. Infektera en 150 cm 2 kolv av sammanflytande HFF-celler med 1 x 10 6 tachyzoiter av muterade stammen med 6-tioxantin (6TX) val av medium (200 ug / ml 6TX i infektion medium) och placera kolven i ett PFU-analysen. Inspektera kolven 8 dagar senare för att kontrollera att inga (eller mycket få, <10) PFU är synliga, vilket är viktigt att fastställa att potendande genmålsökning effektivitet kommer att överstiga eventuella spontan återgång av den muterade stammen till en fenotyp med reducerad HXGPRT uttryck (en 6TX fenotypen).

Anmärkning: Ungefär 5 - 10% av HXGPRT integrationsställen uppvisar en signifikant och den spontana frekvensen av 6TX motstånd trots att HXGPRT markören fortfarande är integrerad vid målstället (se Representativa resultat avsnitt för förklaring).

  1. Börja 6TX urval ~ 20 h efter transfektion genom att ändra mediet i 150 cm 2 kolven till 6TX selektionsmedium.

Obs: Stör inte kolven för ~ 10 dagar efter transfektion.

  1. Inspektera kolven för PFU bildning på dag 10 - 12 efter transfektion (typ I parasiter) eller dag kl 10 - 16 efter transfektion (typ II parasiter).

Notera: Parasites blir måltavla för en strykning av HXGPRT kommer inte att börja växa under 6TX val tills HXGPRT genen och mRNA raderas och den resterande HXGPRT proteinet inaktiverats.

  1. Skaka urvalet kolven för att skapa en parasit lösning, och överföring 0,5-1,0 ml av parasiten lösningen till en ny 25 cm 2 kolv innehållande sammanflytande HFF-celler och 5 ml 6TX selektionsmedium. Upprepa överföringen från de primära 150 cm 2 till nya 25 cm 2 kolvar en gång per dag under två dagar.

Obs: Flerfaldig provtagning ökar chanserna att fånga livsdugliga riktade parasiter som har förlorat HXGPRT genen.

  1. Inspektera 25 cm 2 kolvar ~ 5 dagar efter infektion för att kontrollera förekomsten av framkallning PFU med zoner av friska replikerande parasiter. Välj en eller två flaskor som innehåller zoner av infektion.

Anmärkning: HXGPRT genen replikera en normal tillväxttakt 6TX val.

  1. Fortsätt att passage parasiterna i 6TX selekteringsmedium.
  2. Subklonen parasiten befolkningen efter den 25 - 30 dagar av urval. Ställ in en 96-brunnar med ~ 1 parasit / brunn och en annan med ~ 2 parasiter / brunn.
  3. Förbered parasit DNA från isolerade kloner och upprätthålla kloner i en 24-brunnars format kultur enligt protokoll 1,2 (stegen 19-29).
  4. Validera radering av HXGPRT med PCR med den strategi som skisseras i figurerna 3A-B.

Tre. C-terminal taggning av proteiner

Detta protokoll är avsedd för C-terminal taggning av proteiner genom att rikta taggen för integration via dubbel kors över homolog rekombination vid genomiska Genen med MPA + X urval 2,4. Detta protokoll fungerar effektivt eftersom 5'-dhfr-sekvensen av 2,4.

3.1 Direkt C-terminal taggning av proteiner vid endogena genetiska loci

  1. Skapa targeting pΔGOItag plasmidkonstruktion med användning av jäst rekombinationskloning (Figur 4) och metoder som beskrivs i protokoll 1.1. Den 5 'genomiska inriktning flank innehåller de senaste 800 till 1.200 bp av kodande region (eller genomisk DNA) i de indiska myndigheterna, utom termineringskodonet flyttas till en position 3' till taggen val (HA-tag, Myc tag, His tag , etc.)
  2. Skapa den riktade insättningen av den C-terminala tagg på det endogena lokuset av proteinkodande genen genom att följa stegen i protokoll 1,1 och 1,2 med användning av strategi som beskrivs (figur 4).
  3. Verifiera insättningen av den C-terminala tagg på den endogena genen locus med hjälp av en PCR-strategi.
  4. Retarget genen locus använda metoder som beskrivs i protokoll 1, och protokoll 2 till delete den HXGPRT valbara markören för att skapa en exakt reglerad endogen genlocus som uttrycker ett taggat protein. Detta protokoll återvinner också HXGPRT selekterbar markör som kan användas igen för att rikta ett annat locus i den märkta stammen (se protokoll 1).

Representative Results

En detaljerad mall är anordnad för att konstruera en målsökande plasmid för att ta bort en gen, inklusive placeringen av restriktionsenzymställen och generering av de primrar som underlättar genetisk målinriktning och validering av genmålsökning, såväl som plasmidkonstruktion för efterföljande deletion av HXGPRT i en enstegsprocess (figurerna 1A-C, figur 2a, figur 3A). En generell schematisk presenteras för att göra en riktad gendeletion (figur 2A), de primerpar som används för att godkänna raderingen av en knockout, till exempel, är typ I rop18 (Figur 2B), och representativa resultat av PCR-validering visas (Figur 2C). Detta representativa Resultatet visas för att illustrera de olika resultat som kan erhållas från genetiska ställen som är relativt svåra att målet. Ett framgångsrikt riktad gendeletion kommer att resultera i frånvaro av genen av itresse PCR-produkten (PCR 1), närvaron av 3'-genomiska targeting flank (PCR2), och närvaron av den HXGPRT selekterbara markören integreras ordentligt mellan de 5 'och 3' genomiska riktade flanker som definierar deletion (PCR3 och pCR4) . Klonerna 3, 4, 5, 6, 8, 9 och 11 är validerade riktade gendeletioner (knockouts) där HXGPRT har ersatt de indiska myndigheterna (figur 2C).

En klon som inte innehåller en gendeletion kan representeras av en mängd olika bandmönster. Typiskt kommer en klon utan en gendeletion spegla moderstammen (föräldra-mönster) med band observerade för PCR1 och PCR2, men inte för PCR 3 eller pCR4 som seen för klonerna 1 och 2 (figur 2C). Denna "föräldrarnas mönster" uppstår från några potentiella orsakerna. Ibland, MPA resistenta utvalda parasiter bära icke-integrerade ihållande episomer av pΔGOI målsökningsplasmiden, och vi noterar att fortsatta urvalet ofta tvingar dessa episomeratt integrera. Vi följer också några sällsynta bakgrund i typ I Δ Ku80 stam grund oavsiktlig integration av pΔGOI målsökningsplasmiden, som innehåller ett HXGPRT cDNA uttrycks via DHFR 5 'och 3' element promotor, i antingen DHFR locus eller i den delvis raderade HXGPRT locus 14. Även denna sällsynta händelse är en riktad integration, var det inte den avsedda integrationen och fungerar som en viktig punkt att komma ihåg att utforma en strategi genersättning. DNA homologi större än 120 bp transporteras på din pΔGOI målsökningsplasmiden kan ge en alternativ plats för rekombination i Δ Ku80 stammar 2 som skulle kunna ge tillbaka en oönskad bakgrund. I typ II Pru Δ Ku80 stam denna bakgrund är nedsatt eller obefintlig jämfört med typ I eftersom HXGPRT valbar markör är baserad på typ I-sekvenser som har nucleotidepolymorphisms jämfört med typ II-DNA somreducerar kraftigt denna ovanliga bakgrund genom försök med typ II Pru Δ Ku80 stam 1. Om en gen locus är viktigt (kan inte raderas), eller har en extremt låg genmålinriktning frekvens på stället, eller om kvarstående [icke-integrerade] episomer inte lätt elimineras via tillväxt och urval kommer detta föräldrarnas mönster dominerar mönster som observerats i MPA resistenta kloner. Alternativt är den målsöknings-DNA-molekylen observeras ibland att integrera på endast 5'-eller 3'-genomiska targeting flank och ett band observeras för antingen PCR3 eller pCR4 (men inte båda) tillsammans med PCR1 och PCR2 som seen för klon 10 (5 "integration) och klon 7 (3 'integration) (figur 2C). Dessa mönster tyder den ovanliga förekomsten av en enda kors över integreringen av målsökningsplasmiden på stället som integrerar HXGPRT men detta riktade integration inte bort genen av intresse. Detta mönster (spår 7 och 10 i figur 2C) emphasizes behovet att rapportera PCR data för att verifiera att riktad integration inträffade stället för en enda korsa homolog över och en andra icke-homolog integration av den målinriktande molekylen. Sällan ser vi en genetisk blandning representeras av klon 12 (figur 2C) som representerar både ett föräldra mönster och en målinriktad radering mönster. Detta mönster sannolikt uppstår ibland från två parasit genotyper som finns på samma plats i en kloning väl.

Ett allmänt schema för avlägsnande av HXGPRT från Δ ku80Δgoi :: HXGPRT att radera HXGPRT från stammen visas (figur 3A). Den primerpar används för att validera avlägsnandet av HXGPRT från Δ Ku80 Δ gra2 :: HXGPRT (figur 3B) förstärker en unik ~ 1,2 Kbp bandet i PCR5 såsom framgår av kloner 4, 7, 9, 11 och 12 (fig 3C). Om HXGPRT inte avlägsnas från locus, en ~ 3.4 Kbp band observeras (kloner 1, 2, 3, 6, 8, 10, och föräldrakontroll). Flera mekanismer agera för att göra avlägsnandet av HXGPRT (6TX selektion) mer utmanande och mindre effektiv än integrationen av HXGPRT (MPA + X selektion). MPA val är helt enkelt effektivare än 6TX urval 14,16. Dessutom är högre nivåer av HXGPRT uttryck behövs för 6TX urval än för MPA markeringar 16,24. Följaktligen kan mutationer som kan minska HXGPRT enzymaktivitet eller mutationer eller epigenetiska förändringar som minskar expressionsnivån av HXGPRT vid en genens lokus avskaffa potentiellt effektivitet 6TX urval. Även med dessa utmaningar 6TX val, är andelen framgångsrika 6TX val i Δ Ku80 stammar mer än 90% på första försöket 1-3.

Ett allmänt schema för direkt C-terminal taggning av protein-kodande gener visas (Figur 4). Dettaschema använder direkt integration via dubbel cross over homolog rekombination av HXGPRT 3 'hos den märkta genen och även sysselsätter validering strategier liknande de som beskrivits ovan. När en gen misstänks vara en viktig gen detta kan verifieras med hjälp av en andra transfektion med ett självständigt isolerade inriktning DNA-plasmid. Alternativa metoder, såsom system för reglerad genuttryck, finns tillgängliga för ytterligare kontroll om en gen är avgörande 25.

Figur 1
Figur 1. Översikt över utformningen av en målsöknings-DNA-plasmid. A. Schematisk för att utforma överlappar primers som används för PCR amplifiering av 5 'och 3' flanker mål med 33 bp överlappningar för pRS416 skyttelvektorn och HXGPRT miniatyrgen kassett. Primrar som avbildas i den schematiska varanvänds för att generera 5'-och 3'-mål-flanker pΔROP18 10. B. Allmän strategi för att utforma en målsöknings-DNA-molekyl. Ryggraden i pΔGOI är pRS416 skyttelvektorn innehållande uracil (URA) och ampicillin (AMP) selekterbara markörer. Insatt i pRS416 är en ~ 1 kbp 5 'DNA-mål flank förstärks från genomiska DNA med överlappningar för HXGPRT minigenen kassetten och pRS416 med F1 och R1 primers, en ~ 1 Kbp 3' DNA-mål flank förstärks från genomiska DNA med överlappningar den HXGPRT minigenen kassetten och pRS416 använda F2 och R2 primers och HXGPRT miniatyrgen kassett. Följande unika restriktionsenzymställen digest platser läggs till primrarna: RE.X (restriktionsenzym X cut plats) i F1-primer för att skära plasmiden vid 5'-änden av 5'-DNA-målet flank, RE.Y i R2 primer för att skära plasmiden vid 3'-änden av 3'-DNA-målet flank och RE.Z i R1 och F2 primrar för att skära ut HXGPRT minigene kassett. C. Primersekvenser används för att generera målkonstruktionen för radering av rop18. De djärva regionerna motsvarar T. gondii genomisk sekvens, och de nonbold regionerna motsvarar restriktionsenzymställena och sekvenser som överlappar med pRS416 och HXGPRT minigenen kassetten. Den HX_F och HX_R primerpar amplifierar HXGPRT minigen kassetten 14. Primrar läses från 5 'till 3'. Tabell anpassat från Fentress et al 10. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. Översikt av protokollet för radering av en gen med hjälp HXGPRT. A. Disruption av en indiska i Δ ku80Δhxgprt stammen genom en dubbel crossover homolog rekombination med en ~ 1 kbp 5 'flank DNA-mål och en ~ 1 Kbp 3' DNA-mål flank på plasmid pΔGOI. En PCR-strategi med PCR1, PCR2, PCR3 och pCR4 (ej skalenligt) visas som möjliggör genotyp verifiering att validera kloner med riktade åtgärder för integration av HXGPRT och radering av de indiska myndigheterna locus. Utformad för att godkänna raderingen av rop18 B. Representativa primerparen . ROP18_DF och ROP18_DR amplifiera PCR1, ROP18_ExF och ROP18_CxR amplifiera PCR2, ROP18_CxF och DHFR_CxR amplifiera PCR3 och DHFR_CxF och ROP18_CxR amplifiera pCR4 (se Figur 2A). Primrar läses från 5 'till 3'. Tabell anpassat från Fentress et al 10. C. Representativa resultat av validering av en riktad gendeletion (rop18) använder HXGPRT. Efter transfektion av plasmid pΔROP18 in Δ ku80Δhxgprt och val i MPA +X, MPA + X resistenta kloner analyserades för radering av rop18. Ursprungsstammen kontroll är positivt för PCR 1 (~ 400 bp) och PCR 2 (~ 650 bp) produkt och negativa för PCR 3 (~ 1200 bp) och PCR 4 (~ 1300 bp) produkt. En riktad GOI knockout är positivt för de PCR2, PCR3 och pCR4 produkter och är negativt för PCR 1 produkt (se Figur 2A). Visas är representativa paneler av resultaten av PCR1 och PCR2 (övre panelen), PCR3 (mellersta panel), och pCR4 (nedre panelen). Kloner 3, 4, 5, 6, 8, 9 och 11 uppvisar den korrekta bandmönster av PCR 1, PCR2, PCR3 och pCR4 som definierar en riktad händelse gendeletion i klonen. Klonerna 1, 2, 7, 10 och 12 är inte gendeletioner, och motsvarar andra potentiella representativa resultat. (C = föräldrakontroll stam Δ ku80Δhxgprt, M = storlek markörer). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3
Figur 3. Översikt av protokollet för re-targeting genen av intresse att radera HXGPRT. A. Strategi för avlägsnande av HXGPRT markör med en dubbel crossover homolog rekombination i stammen Δ ku80Δgoi :: HXGPRT använder en ~ 1 kbp 5 'flank DNA-mål och en ~ 1 kbp 3' DNA-mål flank på plasmid pΔGOIc. Den PCR-strategi för genotyp verifiering avbildas användning av ett primerpar till analys för en PCR-produkt (PCR5) som spänner över deletionen (ej skalenlig). En representativ primerpar utformade att validera avlägsnandet av HXGPRT selekterbara markören från gra2 B. locus i stam Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primers GRA2 _CLF och GRA2_CxR amplifiera PCR5. Primrar läsa från 5 'till 3'. C. representativ panel av 6TX-resistenta kloner som kan erhållas efter transfektion av plasmid pΔGOIc in Δ ku80Δgoi :: HXGPRT och val i 6TX. Kloner 4, 7, 9, 11 och 12 uppvisar den korrekta bandmönster av PCR5 som motsvarar riktad deletion av HXGPRT markör (~ 1,2 Kbp produkt som spänner över 3'-flanken med liten överlappning med 5'-flank och utanför 3' flank). Klonerna 1, 2, 3, 6, 8 och 10 (detta band är ljus) visar den förväntade bandmönster på omkring ~ 3,4 Kbp som motsvarar den parentala klonen genotypen, även om dessa kloner uppvisade en viss grad av motstånd mot 6TX som tillät deras val (denna fenotyp kan ibland uppstå spontant genom avstängning av HXGPRT uttryck (se not i protokoll 2.1 (steg 8) och resultat Representant avsnitt). (C = föräldrakontroll stam Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = storlek markörer).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Figur 4
Figur 4. Designen av en målsöknings-DNA-molekyl för att märka den C-terminala änden av ett protein. Strategin bygger på förmågan hos den HXGPRT markör för att även fungera som ett 3'-nedströms regulatorisk region. Ryggraden i pΔGOItag är pRS416 skyttelvektorn innehållande uracil (URA) och ampicillin (AMP) selekterbara markörer. Insatt i pRS416 är en ~ 1 Kbp 5 'DNA-mål flank förstärks från genomiska DNA med överlappningar för HXGPRT minigenen kassetten och pRS416 med Fgoi och Rtag primers, en ~ 1 Kbp 3' DNA-mål flanken förstärks från genomiska DNA med överlappningar den HXGPRT minigenen kassetten och pRS416 med F2 och R2primers och HXGPRT miniatyrgen kassetten. 5'-DNA-mål flanken ersätter termineringskodonen med taggen (HA, Myc, His, etc) följt av en ersättare termineringskodon. MPA + X val integrerar den C-terminala taggen och en nedströms HXGPRT, och flyttar 3 'UTR till en position efter den HXGPRT markör. Följande unika restriktionsenzymställen digest platser läggs till primrarna: RE.X (restriktionsenzym X cut plats) i Fgoi primer för att skära plasmiden vid 5'-änden av 5'-DNA-målet flank, och RE.Y i R2 primer för att skära plasmiden vid 3'-änden av 3'-DNA-målet flank, och RE.Z i Rtag och F2 primrar för att skära ut HXGPRT minigen kassett för användning för plasmidkonstruktion för att omorientera den taggade genlokus för att radera den HXGPRT markör som kommer att återställa placeringen av 3'-ITR.

Discussion

Här ger vi ett protokoll för effektiv genmålinriktning i Δ Ku80 parasitstammar att möjliggöra en effektiv återvinning av genetiskt manipulerade avkomma som har riktade gendeletioner, utbyten genen och / eller märkta gener. Den sekventiella utförandet av dessa metoder ger en tillförlitlig metod för isoleringen av parasiten mutanter som innehåller enkla eller multipla riktade genetiska manipulationer 1-3. Även skapandet av en riktad deletion beror på flera faktorer, ökar användningen av Δ Ku80 stammen med den presenterade strategin och protokoll kraftigt effektivitet och enkel att göra exakt definierade muterade stammar av T. gondii för funktionella genomiska studier.

Genomet hos T. gondii under asexuella stadier är haploid. Således ett övervägande att göra när du planerar att ta bort en gen är att genen inte vara nödvändigt in vitro. Trots effektiviteten i siktating gen knockouts i Δ Ku80 stammar är extremt hög, och detta möjliggör isoleringen av muterade stammar med signifikant försämrad replikering priser. Om en riktad gen är viktig, parasiter upphör ofta att replikera under valet. En annan kritisk faktor riktad genmodifiering är det perfekta homologi med minst 620 bp av den genomiska inriktning flanken krävs för att erhålla detekterbara riktade integrationer 2. Längre homologiregioner ger högre effektivitet på inriktning och använda targeting DNA flanker ca 1000 bp är en pålitlig och effektiv metod 1-4. Av denna anledning är det viktigt att genomiska inriktning flankerna genereras från samma stam av T. gondii (RH, Pru) som den stam som är genetiskt manipulerad. Brist på tillräcklig homologi kan ofta leda till riktade åtgärder för integration av en genomisk inriktning flank, men inte den andra. Ofullständig integration eller underlåtenhet att skaffa en knockout may kan också bero på episomal uthållighet. Omedelbart efter transfektion, är alla de målsökande molekyler icke-integrerade episomer, och ibland målsökande molekyler kan kvarstå som episomer för många generationer. Använda flanker mål-DNA av ~ 1 Kbp och fortsätter att passera parasiter under selektion före re-underkloning ofta löser problem som är förknippade med episomal uthållighet.

När en knockout valideras och HXGPRT markören tas bort, kan det genmålinriktning strategin upprepas på andra indiska myndigheterna att generera flera gendeletioner i en enda parasit stam 1-3. Genereringen av deletioner, utbyten, eller taggade gener kan också åstadkommas genom att använda olika selekterbara markörer (bleomycin, CAT, pyrimetamin resistent DHFR, etc.). Trots att CAT-selekterbara markören för närvarande är närvarande i typ II Δ Ku80 Pru genomet 1, kan denna markör tas bort med HXGPRT HXGPRT valet den säkraste och mest effektiva markör med den högsta inriktning effektiviteten där en enda kopia riktad insättning är tillräcklig för robust val i MPA + X medium. HXGPRT ger också den enda närvarande användbar metod för målinriktad radering av ett selekterbar markör (figur 3) med användning av 6-tioxantin (6TX) urval 2,3. Således detta protokoll ger den enda nuvarande metoden för att utveckla definierade mutantstammar med flera riktade genetiska manipulationer.

Detta protokoll ger en värdefull och effektiv metod för riktad genmodifiering i Δ Ku80 stammar av Toxoplasma gondii och gäller analys av en enda gen, en familj av gener, eller genomvida funktionella studier genomiska. Före tillgängligheten av Δ Ku80 stammar 1,2, var dessa metoder inte är allmänt möjligt på grund inefficiency av dessa metoder. Följaktligen är detta protokoll brett tillämpbar för riktad genmodifiering av Toxoplasma gondii och är tillgänglig för alla utredare intresserade hanterar en rad frågor om parasiten biologi, värdrespons och funktionsgenomik.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH till DJB (AI041930, AI073142, AI075931 och AI091461).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Overlap Primers Integrated DNA Technologies 4 nmole Ultramer DNA oligos
Validation Primers Integrated DNA Technologies 100 nmole DNA Oligo
Yeast Strain #90845 ATCC Designation FY834
Shuttle Vector pRS416 ATCC 87521
DH10B E. coli Invitrogen 12033-015 SOC broth in kit with E. coli
Resuspension Buffer Qiagen Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit
Miniprep Kit Qiagen 27104 QIAprep Spin Miniprep Kit
Glass Beads Scientific Industries SI-BG05 0.5 mm acid-washed
Qiacube Automated Robotic Work Station Qiagen
Electroporation Cuvette USA Scientific 9104-5050 2 mm-gap
BTX600 electroporator BTX
Maxiprep Kit Qiagen 12662 QIAprep Spin Maxiprep Kit
25 cm2 Canted neck plug seal flask Corning 430168
150 cm2 Canted Neck plug seal flask Corning 430823
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells ATCC SCRC1041
Swin-lok Filter Holder Whatman 420200 25-mm-diameter
Membrane Whatman 110612 Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter
Mycophenolic acid (MPA) Sigma
Xanthine (X) Sigma
96-well Tissue Culture Tray Corning Costar
24-well Tissue Culture Tray Corning Costar
MEM Eagle Media Lonza Biowhittaker 12-611F
Fetal Bovine Serum Gibco 26140-111
Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti) Gibco 15240-062
Spin Column Primm Labs PAE-100 Easy Clean DNA Extraction Spin Kit
T4 DNA Ligase New England Biolabs
6-thioxanthine Acros Organics
Tissue DNA Minikit Qiagen 51104 QIAamp DNA Blood Mini Kit
Cell Culture Freeze/Recovery Media Gibco 126-48-010
Phosphate Buffered Saline Hyclone SH30028.02 minus calcium, minus magensium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fox, B. A., et al. Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection. Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).
  2. Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).
  3. Fox, B. A., Bzik, D. J. Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii. Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).
  4. Hortua Triana, M. A., et al. Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).
  5. Kim, K., Weiss, L. M. Toxoplasma gondii: the model apicomplexan. Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).
  6. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).
  7. Kim, K., Weiss, L. M. Toxoplasma: the next 100 years. Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).
  8. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).
  9. Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility. Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).
  10. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).
  11. Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA. Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).
  12. Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii. PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).
  13. Szatanek, T., et al. Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).
  14. Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation. J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).
  15. Donald, R. G., Roos, D. S. Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis. Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).
  16. Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine. Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).
  17. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).
  18. Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast. Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).
  19. Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation. Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).
  20. Roos, D. S. Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).
  21. Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).
  22. Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).
  23. vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival. Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).
  24. Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine. Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).
  25. Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion. Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).

Tags

Infektionskliniken genetik mikrobiologi infektion medicin immunologi molekylärbiologi cellbiologi medicinsk teknik Bioteknik genomik parasitologi patologi Apicomplexa koccidier Toxoplasma genteknik genmålinriktning Eukaryota, Genmanipulation Riktad genmodifiering gendeletion genutbyte gen taggning homolog rekombination DNA sekvensering
Genetisk manipulation i<em&gt; Δku80</em&gt; Stammar för funktionell genomik Analys av<em&gt; Toxoplasma gondii</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rommereim, L. M., Hortua Triana, M.… More

Rommereim, L. M., Hortua Triana, M. A., Falla, A., Sanders, K. L., Guevara, R. B., Bzik, D. J., Fox, B. A. Genetic Manipulation in Δku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (77), e50598, doi:10.3791/50598 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter