Genetische Manipulation in Published: July 12, 2013 doi: 10.3791/50598

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Leah M. Rommereim¹, Miryam A. Hortua Triana¹, Alejandra Falla¹, Kiah L. Sanders¹, Rebekah B. Guevara¹, David J. Bzik¹, Barbara A. Fox¹

¹Department of Microbiology and Immunology, The Geisel School of Medicine at Dartmouth

Summary

Hier berichten wir ein Verfahren zur Verwendung von Typ I und Typ II

Abstract

Gezielte genetische Manipulation mit homologen Rekombination ist die Methode der Wahl für die funktionelle Genomanalyse, um eine detaillierte Ansicht der Genfunktion und Phänotyp (s) zu erhalten. Die Entwicklung von Mutanten mit gezielter Deletionen, gezielte Mutationen, ergänzt Genfunktion und / oder markierten Gene liefert leistungsfähige Strategien zur Genfunktion zu befassen, insbesondere, wenn diese genetische Manipulationen effizient mit dem Gen-Locus von Interesse unter Verwendung vermittelte Integration durch gezielte Doppel überqueren homologe Rekombination.

Aufgrund der sehr hohen homologen Rekombination funktionelle Genomanalyse von Toxoplasma gondii wurde zuvor durch das Fehlen effizienter Methoden zur gezielten Deletionen und Genaustausche bestimmten genetischen Loci begrenzt. Vor kurzem abgeschafft wir den Hauptweg von homologe Rekombination in Typ I und Typ II Stämme von T. gondii durch Löschen des Gens encoding der KU80 Protein ^1,2. Die Stämme Δku80 normales Verhalten während Tachyzoiten (akute) und bradyzoite (chronische) Stufen in vitro und in vivo und weisen im Wesentlichen eine 100% Häufigkeit der homologen Rekombination. Die Δ Ku80 Stämme machen funktionellen Genomstudien möglich auf dem Gen als auch auf dem Genom Skala ^1-4.

Hier berichten wir über Methoden für die Verwendung von Typ I und Typ II Δku80Δhxgprt Stämme Gen-Targeting-Ansätze in T. voranbringen gondii. Wir skizzieren effiziente Methoden zur Erzeugung von Deletionen, Gen-Ersatz, und markierten Gene durch gezielte Insertion oder Deletion des Hypoxanthin-Xanthin-Guanin phosphoribosyltransferase (HXGPRT) Selektionsmarker. Die beschriebene Gen-Targeting-Protokoll kann in einer Vielzahl von Weisen in Δku80 Stämme verwendet werden, um funktionelle Analyse des Parasitengenom voranzutreiben und einzelnen Stämme, die Durchführung zu entwickelnmehrere gezielte genetische Manipulationen. Die Anwendung dieser genetischen Verfahren und anschließende phänotypische Assays wird zeigen, grundlegende und einzigartige Aspekte der Biologie von T. gondii und damit verbundene erhebliche personelle Erreger der Malaria (Plasmodium sp.) und cryptosporidiosis (Cryptosporidium) verursachen.

Introduction

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazelluläre gemeinsamen einzelligen Parasiten, die häufig chronisch infiziert und eine breite Palette von Tieren und Menschen ^5. Es wird geschätzt, dass mehr als 1 Milliarde Menschen derzeit chronisch infizierten und von diesem Erreger. Neben der Bedeutung von Krankheiten verursacht durch T. gondii-Infektion, die zunehmende Verfügbarkeit von experimentellen Tools, leistungsstarke Genomik Ressourcen ^6, einfache in vitro Wachstum und eine hervorragende Maus-Modellen gemacht haben T. gondii ein führender Modellsystem für die Untersuchung der intrazellulären breiteren eukaryotischen Krankheitserreger und andere bedeutende Apicomplexa die verheerende Krankheiten wie Malaria (Plasmodium sp.) und Cryptosporidiosis (Cryptosporidium) ^5,7 verursachen. Eine erhebliche Einschränkung der Toxoplasma gondii als Modellorganismus ist die ineffiziente Verwertung von Nachkommen, die gezielte genetische Manipulationen zu tragen. Diese problem in der Gen-Targeting ist aufgrund einer niedrigen Frequenz der homologen Rekombination relativ zu der sehr hohen Frequenz-homologe Rekombination in Wildtyp-Stämme von T. gondii, auch wenn umfangreiche DNA-Homologie wird in Ziel-DNA-Moleküle in genetischen Studien ² verwendet wird.

Wir haben kürzlich die genetisch Hauptweg der homologen Rekombination in der Aktivität blockiert I und Typ II-Stämme von Toxoplasma gondii durch Deletion des Gens kodierend für das Protein KU80 ^1,2. Die resultierende Typ I und Typ II Δ Ku80 Stämme weisen normale Wachstumsraten, Größe und Verhalten sowohl in vitro als auch in vivo während Tachyzoiten und bradyzoite Stadien in vitro und in vivo, jedoch weisen diese Stämme im Wesentlichen eine 100% Frequenz der homologen Rekombination und diese Phänotyp erhöht die Wahrscheinlichkeit rasch Isolieren gewünschten Nachkommen der gezielten genetischen Manipulation von mehreren hundert bis zu mehreren Thousand-fach ^1,2,4. Aktuelle EU-weite Verwendung von Typ I und Typ II Δ Ku80 Stämme hat deutlich hochgefahren das Tempo, die Vielfalt sowie die Erfolgsquote der gezielte genetische Ansätze in T. gondii ^1-4,8-13. Hier beschreiben wir ein umfassendes Protokoll zur gezielten Gen-Deletion, Gen-Ersatz, und Gen-Tagging in Δ Ku80 Stämme von T. gondii. Wir zeigen, wie zu entwerfen und zuverlässig gezielt genetische Manipulationen, bestimmte Gene oder genetische Loci in Δ Ku80 Stämme von Toxoplasma gondii.

Protocol

1. Gene Targeting auf ein Gen von Interesse löschen

Dieses Protokoll ist für die effiziente Erzeugung eines mutierten Stammes, der eine gezielte Gen Deletion an einer definierten genetischen Lokus gestalten. Die zuvor beschriebene T. gondii Hypoxanthin-Xanthin-Guanin phosphoribosyltransferase (HXGPRT) Selektionsmarker wird in diesem Protokoll für die sichere und zuverlässige Marker nach Einsetzen Mycophenolsäure und Xanthin (MPA + X) Auswahl ^14-16 verwendet. Dieses Protokoll basiert auf einer validierten und kostengünstige Methode zur Konstruktion DNA-Targeting-Moleküle auf Hefe recombinational Klonen ^17,18 basiert. Mehrere alternative Protokolle sind kommerziell erhältlich für Konstruktion rekombinanter Targeting-Moleküle durch bakterielle rekombinatorischen Klonierungsmethoden, in vitro rekombinatorischen Klonierungsmethoden oder Fusions-PCR. Die unten beschriebenen Protokoll bietet die höchste Effizienz und Zuverlässigkeit der Wiederherstellung geklont Abs.ites besitzt eine gezielte Gen-Deletion in Δ Ku80 Stämme von T. gondii.

1.1 Herstellung von Targeting-DNA

1. Zugang ToxoDB ⁶ ( http://www.toxodb.org ), um genomische Sequenzen für das Gen von Interesse (GOI) zu erhalten.

Hinweis: Genomische Sequenzen sollen vom Typ I, II oder III in der Genomsequenz ToxoDB Datenbank, die mit dem Stamm manipuliert nächsten ist, erhalten werden. Zum Beispiel: GT1 für RH und ME49 für Pru.

2. Design-spezifischen Primer, die Überlappung der 5 'und 3' genomischen Targeting Flanken des Gens von Interesse (GOI) Einbringen einer 33 bp Überlappung mit dem Hefe-Shuttle-Vektor pRS416 verstärken (oder alternativ pRS426) und beinhalten eine 33 bp Überlappung mit dem Selektionsmarker ( HXGPRT) (1A-B). In einer einzigartigen Restriktionsenzymschnittstelle in jedem Primer an beiden Enden des 5'einemnd 3 'genomischen Targeting Flanken, zwischen den 33 bp Überlappung und der T. platziert gondii-spezifischen Primer-Sequenz (en) (Fig. 1A-B).

Hinweis: Ein mehr als 30 bp Überlappung für eine effiziente Rekombination Hefe Klonen erforderlich. Die 5 'und 3' das genomische Targeting Flanken entwickelt, um spezifische DNA-Fragmente von 800 und 1400 bp, welche eine gezielte Deletion definieren verstärken. Seien Sie sich bewusst, dass kürzere Flanken wird deutlich verringern Targeting Effizienz in der Δ Δ Ku80 hxgprt Hintergrund ^2.

3. PCR amplifizieren 5'Ziel Flanke unter Verwendung der Primer F1 und R1 und PCR zu amplifizieren 3'-Ziel-Flanke unter Verwendung von Primer F2 und R2 (Fig. 1A-C) aus genomischer DNA ^3. Getrennt davon wurde die PCR amplifizieren ~ 2 kbp HXPGRT Gen einschließlich der zugehörigen 5'-und 3'-flankierenden Regionen dhfr der HXGPRT cDNA pminiHXGPRT Kassette ¹⁴ unter Verwendung von Primern und HXF HXR(1B-C).

Hinweis: Amplify Ziel Flanken Verwendung genomischer DNA aus dem elterlichen Stamm transfiziert werden.

Hinweis: Den HXGPRT Marker in dem vorderen Orientierung relativ zu der 5 'und 3' DNA-Targeting-Flanken anschließender effizienter genetische Manipulationen, wie die gezielte Abfuhr HXGPRT vom gestört Ort zu erleichtern.

4. Die korrekte PCR Produkt fällt durch Agarosegelelektrophorese worden war und das DNA-Fragment Konzentration unter Verwendung von Agarosegel-Standards oder ein anderes Verfahren zur Bestimmung der DNA-Konzentration.
5. Generieren zuständigen Hefe Aliquots wie in Gietz und Schiestly ¹⁷ beschrieben.
6. Kombinieren Sie 50 ng 5 'genomische Targeting Flanke, 50 ng 3' genomischen Targeting Flanke, 100 ng HXGPRT Selektionsmarker und 50 ng linearisierter Shuttle-Vektor mit sterilem H ₂ O, um ein Endvolumen von 10 zu erreichen -20 ul. Verwandeln zuständigen Hefe mit den drei PCR-Produkte und Hefe-E. coli-Shuttle-Vektor für rekombinatorischen Klonen mit dem Protokoll von Gietz und Schiestly ¹⁷ beschrieben. Teller transformierten Hefezellen auf Uracil-Minus-Minimalmedium-Agar-Platten und Inkubation bei 30 ° C für 2 - 3 Werktagen.

Hinweis: Die geordnete Anordnung von dem Plasmid, dessen 5'-Ziel Flanke der HXGPRT Marker und die 3'-Ziel-Flanke wird durch die technisch 33 bp Überlappung zwischen den DNA-Fragmenten (1A-B) ermöglicht und durch homologe Rekombination in vermittelt Hefe.

7. Ernte Hefe durch Zugabe von 2 ml 2x YPAD der Uracil-Minus-Platten und leichtem Schaben Kolonien ohne Unterbrechung des Agar zu lösen. Zentrifuge die Hefe-Lösung für 5 min bei 5.000 xg und den Überstand verwerfen.
8. Resuspendieren Hefepellet in 250 ul einer Resuspensionspuffer enthält RNaseA und fügen Sie 50 - 100 ul einercid-washed Glasperlen zur Lösung. Vortex für 5 min bei höchster Geschwindigkeit, um die Hefezellen zu zerschlagen.
9. Lassen Sie die Glasperlen an den Boden des Röhrchens absetzen und den Überstand in ein 2 ml Eppendorf-Röhrchen.
10. Isolieren Hefe-DNA mit einem Miniprep DNA Isolation Kit, Resuspendieren in einem Gesamtvolumen von 100 ul ~.
11. Mix 2 ul Hefe-DNA (~ 50 ng) mit 40 ul DH10B Elektroporation kompetente E. coli auf Eis gehalten.
12. Die Lösung wird in einem gekühlten 2 mm Spalt Elektroporationsküvette und elektroporieren die Bakterienzellen bei 2,4 kV und 129 Ω.
13. Rettungs-Zellen durch Zugabe von 0,8 ml SOC Brühe zu jeder Küvette und Transfer-Lösung zu einer 14 ml Snap-cap-Falcon-Röhrchen. Inkubieren Zellen bei 37 ° C auf einer Walze Trommel für 40 - 60 min.
14. Teller E. coli auf 2XYT + Ampicillin (AMP)-Platten und Inkubation der Platten bei 37 ° C über Nacht.
15. Wählen Sie ~ 6-8 einzelne Kolonien wachsen und in 3 ml 2XYT + AMP für ~ 16 Stunden bei 37 ° C
E. coli-Klon.
16. Isolieren von Plasmid pΔGOI E. coli-Klone unter Verwendung einer Miniprep Kit, Resuspendieren in einem Endvolumen von ~ 100 ul.
17. Bestätigen die pΔGOI mit Restriktionsenzym verdaut, um die DNA-Plasmid Größe zu messen und überprüfen, ob die erwarteten pΔGOI DNA Bandenmuster.
18. Abschließen Validierung pΔGOI durch DNA-Sequenzierung der 5 'und 3' das genomische Targeting Flanken 100% DNA-Sequenz auf Genomsequenzdaten in basierend überprüfen http://www.ToxoDB.org .

Hinweis: Nahezu perfekte Sequenzhomologie ist für die Maximierung Gen-Targeting Effizienz ^3, da jedes Basenpaar Differenz stellt einen entsprechenden Ausschnitt in der Länge perfekte Homologie.

Hinweis: Die Genom-Sequenz des Typs II Δku80 Belastung des Pru elterliche st Basisregen ist zu diesem Zeitpunkt nicht zur Verfügung. Diese Arbeit verwendet die Typ-II-ME49 Genomsequenz als Surrogat Genom für den Typ II Δ Ku80 Stamm. Basierend auf Sequenz-Daten in einer Reihe von genetischen Loci, wird geschätzt, dass die ME49 Genom und die PRU Genom Einzel-Nukleotid-Polymorphismen aufweisen bei einer Frequenz von ca. 1 pro 10.000 Nukleotide oder weniger.

20. Generieren> 200 ug pΔGOI Lager durch Impfen einer ~ 250 ml 2XYT + AMP-Nacht-Kultur mit Glycerin Aktien aus einer validierten E. coli miniprep Klon.
21. Isolieren pΔGOI Plasmid-DNA aus den großen Kultur mit Hilfe eines DNA-Isolierung maxiprep Kit, Resuspendieren in einem finalen Volumen von ~ 1.000 ul.
22. Wiederholen Restriktionsenzym verdaut, oder DNA-Sequenzierung des pΔGOI maxiprep DNA, um die richtige Ausrichtung DNA-Molekül vor der Transfektion zu überprüfen.
23. Linearisieren ~ 15 ug pΔGOI am 5'-Ende mit dem einzigartigen Restriktionsenzym X (RE.X)Digest-Website in der 5 'target Flanke (1B) gebaut.

Hinweis: Gene Targeting in T. gondii erfordert ein Minimum von ~ 10 ug DNA-Targeting, um eine effiziente Frequenz von Targeting-Veranstaltungen auf dem Genlocus von Interesse ² zu erhalten.

24. Bestätigen Linearisierung pΔGOI und bestimmen die DNA-Konzentration durch Agarosegelelektrophorese oder einem alternativen Verfahren.

Hinweis: Wenn Restriktionsenzymverdau am 5'-Flanke nicht nachgibt vollständige Linearisierung, die entworfen 3 'einzigartige RE.Y Digest-Website kann als Alternative Website zur Linearisierung pΔGOI verwendet werden.

Hinweis: Ein vollständig linearisiert Targeting DNA-Molekül ist entscheidend für die erfolgreiche Gen-Targeting durch homologe Rekombination in den Δ Ku80 Stämme.

25. Neutralisieren des Restriktionsenzyms durch INCUBATten bei 68 ° C für 15 - 20 min.
26. Planen Sie mindestens 15 ug linearisierte Plasmid in 100 ul sterilem H ₂ O. Shop linearisierten pΔGOI bei -20 ° C bis zum Zeitpunkt der Transfektion.

1.2 Herstellung von T. gondii Parasiten, Transfektion, Selektion, Subklonierung, Validierung, Archivierung und Pflege von genetisch manipulierten Stämme

Allgemeine Verfahren für die Kultur und Manipulation von T. gondii in humanem Vorhautfibroblastenzellen (HFF) Zellen werden ^19-21 beschrieben. Die Δ Δ Ku80 hxgprt Stämme normalerweise replizieren in Parasiteninfektion Medium (Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) Wachstum Medium mit 1% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Antimykotische-Antibiotika verdünnt aus einer 100x stock ergänzt) ^1,2. Alle Arbeiten mit Toxoplasma gondii müssen unter Verwendung Sicherheitsstufe 2 Verfahren werden. Die T. gondii RHΔ Ku80 ² parental Stamm wurde von der RHΔ hxgprt Stamm aus der Roos Lab ¹⁴ erzeugt. Die PruΔku80 ¹ elterliche Stamm wurde aus PruΔhxgprt (Pru gniaud Stamm BSG-4 ^22), die ein stabil integriertes CAT selektierbaren Marker und ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) Reporter unter der Kontrolle des Promotors bradyzoite Stufe LDH2 enthält erzeugt.

1. Impfen eine 25 cm ² Kolben mit konfluenten HFF-Zellen mit 1 x 10 ⁶ lebensfähige Typ I RH Δ Δ Ku80 hxgprt Parasiten oder impfen zwei 25 cm ² Flaschen mit 2 x 10 ⁶ lebensfähige Typ II Prugniaud (Pru) Δ Δ Ku80 hxgprt Parasiten.

Hinweis: Tragfähige Parasiten als extrazelluläre Parasiten, die frisch lysiert haben definiert.

Hinweis:

2. Überprüfen Sie die Δ Δ Ku80 hxgprt infiziert Kulturen ~ 68-72 Stunden nach der Infektion. Überprüfen Sie das Vorhandensein lebensfähiger Parasiten und ~ 90 - 95% Lyse von HFF-Zellen, den genauen Zeitpunkt der Transfektion zu planen.

Hinweis: Die Isolierung von frisch egressed Parasiten ist wichtig für den Erfolg dieses Protokoll, da niedrig Parasiten Lebensfähigkeit Gen-Targeting-Effizienz abschaffen wird.

3. Agitate lebensfähigen Parasiten in Lösung durch Schließen des Plug-Dichtung Deckel auf dem 25 cm ^2-Kolben und kräftig schütteln den Kolben hin und her, um die Parasiten agitieren off des Wachstums Oberfläche ohne zu spritzen Flüssigkeit auf der Innenseite des Deckels oder der Hals des Kolbens .

Hinweis: Parasite Ernte benötigt keine Spritze-Nadel Release-Protokoll für die Typ-I-oderTyp-II-Δ Ku80 Stämme.

4. Übertragen Sie die Parasiten Lösung auf eine 10 ml Spritze an einem Siebträger mit einer 3 um Membran und setzen Sie den Filter-Einheit auf einer offenen 15 ml Röhrchen mit Schraubverschluss. Spritze filtern die Parasiten in der 15 ml Tube mit Schraubverschluss.

Hinweis: Filtern der Parasiten durch die Membran entfernt infizierten Zellen und Zelltrümmer.

5. Bestimmen Sie die Konzentration Parasiten (Tachyzoiten Formen pro ml) mit einer Zählkammer.

Hinweis: Optional: Mit der Parasit Lösung, die Einrichtung eines Plaque-bildenden Einheit (PFU) Assay ^21, die 7 gelesen werden - 8 Tage später, um eine angemessene Rentabilität der transfizierten Parasiten (PFU-Verhältnis von ≥ 0,2 Tachyzoiten) zu bestimmen.

6. Pellet Parasiten für 7 min bei 1400 xg und saugen Überstand auf ~ 0,4 ml, ohne den Parasiten Pellet. Spin für 2 min bei 1,400 xg und saugen verbleibenden Überstand auf ~ 0,01 ml, ohne den Parasiten Pellet.
7. Resuspendieren Sie das Pellet Parasiten Dazu den Boden des Röhrchens und sofort cytomix ²³ Puffer (1,33 x Konzentration) gegen den Parasiten Pellet ein Parasit Konzentration von 4 erhalten - 5 x 10 ⁷ Parasiten / ml cytomix.

Hinweis: Lassen Sie die Zugabe von ATP und Glutathion zu cytomix da diese Ergänzungen nicht verbessern die Effizienz der Gen-Targeting.

8. Auftauen 100 ul Aliquot des linearisierten pΔGOI von Protokoll 1.1 (Schritt 26).
9. Übertragen Sie 0,3 ml des Parasiten cytomix Lösung (~ 1,3 - 1,6 x 10 ⁷ Parasiten) an die 100 ul linearisierten pΔGOI von Protokoll 1.1 (Schritt 26), und sofort in die gesamte 0,4 ml Parasiten + pΔGOI Mix zu einem gekühlten 2 mm Spalt Elektroporationsküvette.
10. Elektroporieren die Parasiten bei 1,4 kV und 24 Ω.
11. Rest die Transfektion Küvette bei Raumtemperatur ca. 5 Min. dann den kompletten Inhalt der Transfektion Küvette in einem 150 cm ² Kolben mit konfluenten HFF-Zellen mit 30 ml Medium Infektion und Inkubation der infizierten Kultur über Nacht.
12. Beginnen Auswahl Mycophenolsäure + Xanthin (MPA + X) ~ 20 Stunden nach der Transfektion (2A) durch Ersetzen der Infektion Medium mit MPA + X Selektionsmedium (MPA (25 ug / ml) und Xanthin (50 ug / ml) in Infektion Medium).

Hinweis: Bitte nicht stören die Inkubation MPA + X Auswahl Kolben.

13. Schätzen Sie die Gesamtzahl der in der MPA PFUs + X Auswahl Kolben ~ 8 Tage nach der Transfektion durch visuelle Inspektion der Monoschicht. Überprüfen Sie das Vorhandensein der Entwicklung PFUs und gesunde Zonen der Infektion durch Lichtmikroskopie.

Hinweis: Wenn Plaques nicht sichtbar sind, am Tag 8, pflegen die Auswahl und Überwachung auf Anzeichen von Infektionion seit Mutanten kann eine reduzierte Vermehrungsrate.

Hinweis: Die Δ Δ Ku80 hxgprt Parasitenstämme haben einen extrem niedrigen Hintergrund von unerwünschten nontargeted Ereignisse, die für die erfolgreiche Isolierung von Mutanten mit ziemlich schweren erlaubt, aber nicht tödlich Wachstum Mängel. Wenn ein Gen ist wichtig, und es kann nicht gelöscht werden, die primäre Transfektion oder später übergeben Parasiten Bevölkerung, kann sich herausstellen, einen Phänotyp, wo die Parasiten nicht mehr bei der Auswahl zu replizieren, da die Bevölkerung löst gezielt Knockouts.

14. Schütteln Sie die Flasche wie in Schritt 3 bis extrazellulären Parasiten aus der Monoschicht verdrängen [nach sichtbaren Plaques entwickelt haben], um eine Lösung zu generieren Parasiten. Übertragen ~ 0,5 ml des Parasiten Lösung aus der MPA + X Auswahl Kolben mit einem 25 cm ² MPA + X Auswahl Kolben mit konfluenten HFF-Zellen (bezeichnen diese Kultur Pass 1A).
15. Verdrängen Parasitens in den ursprünglichen 150 cm ² MPA + X Auswahl Kolben ~ 3 Tage später und Transfer ~ 0,5 ml Parasit Lösung zu einem zweiten 25 cm ² MPA + X Auswahl Kolben mit konfluenten HFF-Zellen (bezeichnen diese Kultur Pass 1B).
16. Erlauben Zonen der Infektion in 1A Pass und / oder entwickeln passieren 1B Kolben für ~ 5 Tage. Visuell durch Lichtmikroskopie überprüfen, ob Pass 1A und 1B Flaschen mindestens 25 lebensfähig PFUs mit gesunden Zonen Infektion enthalten.
17. Wählen Sie entweder den Pass 1A oder 1B Pass Kolben für die weitere Passage in MPA + X Selektionsmedium in 25 cm ^2-Kolben. Pflegen Durchgang unter MPA + X Auswahl.

Hinweis: Parasiten muss für eine ausreichende Anzahl von Generationen nicht integrierten anhaltenden Episome der Bevölkerung vor Subklonierung löschen kultiviert werden. Führen Sie keine Subklonierung vor bis 20 Tage nach der Transfektion für Typ-I-RH Δ Δ Ku80 hxgprt oder vor bis 25 Tage nach der Transfektion fürTyp-II-Pru Δ Δ Ku80 hxgprt Parasiten damit genügend Zeit zu verdünnen nicht integrierten Episomen ^1,2.

18. Subklon Parasiten in einer 96-Well-Fach mit konfluenten HFF Zellen mit MPA + X Selektionsmedium. Bereiten einer Ablage in einer Konzentration von 1 Parasiten / Vertiefung und ein zweites Fach in einer Konzentration von 2 Parasiten / Vertiefung.

Hinweis: Subklon Parasiten, die kürzlich lysiert wurden (~ 90 - 95% der HFF Zellen in 25 cm ^2-Kolben), um sicherzustellen, dass die Parasiten hohe Lebensfähigkeit haben.

Hinweis: Die optimale Zeitspanne nach der Transfektion für die Subklonierung wurde gemessen, wie schnell erfolgreich gezielt Parasiten bei einer hohen Frequenz in der ausgewählten Population entstehen ¹ hergestellt.

19. Weiter, um den Durchgang der primäre Bevölkerung von transfizierten Parasiten in MPA + X Selektionsmedium mit einem wöchentlichen Zeitplan Durchgang zu infizierenein 25 cm ² HFF Kolben mit 10 ul des Parasiten Lösung.

Hinweis: Wenn Klone Durchführung der gezielten Gen-Deletion (Knockouts) sind nicht von der ersten Subklonierung in Schritt 18 resubclone die Parasiten aus dem kontinuierlich gepflegt Bevölkerung erhalten ~ 10 - 12 Wochen nach der Transfektion.

Hinweis: Einer der Gründe, ein Gen-Deletion nicht erreicht ergibt sich aus der episomalen Beharrlichkeit einiger pΔGOI Plasmide. Episomale Persistenz von den Sequenzen in der 5 'enthalten und 3'das genomische Targeting Flanken bestimmt und scheint nicht von der HXGPRT genetischen Elements entstehen. Etwa 5 - 10% der Targeting-Plasmiden signifikante episomalen Beharrlichkeit, die einen späteren Zeitpunkt der Subklonierung, damit der Parasit Bevölkerung eine ausreichende Zahl von Generation Zeiten der anhaltenden Episomen verdünnen und zu beheben, die Bevölkerung in erster Linie stabile Integranten erfordert.

Ergebnis der 96-Well-Schale 6 - 7 Tage nach der Subklonierung (Typ I Parasiten) oder 7 - 8 Tage nach der Subklonierung (Typ II Parasiten) für Brunnen, die eine einzelne PFU, als eine einzige Zone der Infektion in der Lichtmikroskopie identifiziert bei entweder 40X oder 60X Macht. Markieren einen kleinen Punkt auf der 96-Well-Schale Deckel, um die Position des PFU in der gut zu bezeichnen.
1. Mischen Sie den Inhalt der Vertiefungen, die ein einzelnes PFU mit einer Pipette auf 50 ul (200 ul Spitze) durch Leiten Strömung über die PFU den Parasiten in der gut verteilen gesetzt.

Hinweis: Das Mischen der gut beschleunigt Parasiten Lyse der HFF Monoschicht. Typ I RH Stämme die gut lysieren ~ 4 Tage nach dem Mischen, Typ II Pru Parasiten die gut lysieren ~ 5 Tage nach dem Mischen.

22. Wählen Sie ein Dutzend lysiert Brunnen (Klone) und Kratzer auf der Unterseite von jedem dieser lysierten Brunnen mit einem 0,5-10 ul Pipettenspitze gleichzeitig Zeichnen-up 6 ul Parasit Lösung. Transfer der 6 ul Parasit Lösung zu einem gut in eine 24-Well Fach mit konfluenten HFF-Zellen in 1 ml MPA + X Selektionsmedium.

Anmerkung: Es ist wichtig, den Boden der Vertiefung kratzen, um die Öffnung von der Pipettenspitze in ständigem Kontakt mit Parasiten die sich auf dem Boden der Vertiefung.

23. Überwachen Sie die 24-Well-Schale für die Lyse der HFF-Zellen.

Hinweis: Typ I RH Parasiten wird in der Regel die Lyse auch in der 24-Well-Format in ~ 4 Tage. Typ II Pru Parasiten in der Regel auch die Lyse in ~ 5 Tage.

24. Übertragen 2 ul lebensfähiger Parasiten Lösung aus dem Boden jeder Vertiefung in 24-Well-Format in die entsprechende Vertiefung eines neuen 24-Well-Fach mit konfluenten HFF-Zellen und 1 ml MPA + X Selektionsmedium pro Vertiefung verkratzt.

Hinweis: Alle Parasiten Klone und Linien können kontinuierlich wichtigstenenthaltenen indem 2 ul lebensfähiger Parasiten Lösung alle 7 Tage in diesem 24-Well-Format Fach.

25. Dass Parasiten wurden erfolgreich Überprüfen auf eine neue 24-well Schale durch Sichtprüfung mit Lichtmikroskopie ~ 18 Stunden nach der Passage übertragen.
26. Ernte Parasiten aus den lysierten Vertiefungen der 24-Well-Schale aus Schritt 23 - 24 unter Verwendung entweder eines 1 ml oder 10 ml-Pipette und übertragen die Parasiten Lösung in ein Eppendorf-Röhrchen.
27. Pellet die Parasiten bei 1.400 x g für 7 min, einmal in 1 ml Phosphat spülen Kochsalzlösung (PBS) und Pellet erneut bei 1400 x g für 3 min.
28. Aspirate PBS aus dem Pellet, danach 200 ul PBS zu dem Pellet um die Parasiten zu resuspendieren. Frieren Sie den Parasit Lösung bei -80 ° C bis DNA-Isolierung.
29. Isolieren Parasiten-DNA aus jedem Klon mit einem Gewebe-DNA-Isolierung minikit.
30. Bestätigen Sie die gezielte Gen-Deletion (Knockout) durch PCR mit Primer Validierung (2A-C). Test für dieFehlen des funktionellen kodierenden Region des Gens von Interesse und mit der stromaufwärts und stromabwärts CxF CxR genomischen DNA-Primer (2A-B)-Test auf die Anwesenheit von PCR-Produkten, die das genomische Targeting Flanken und HXGPRT überspannen nachweisen richtigen 5'-und 3' "gezielte Integration des Gens in das HXGPRT gelöscht Genlocus.

Hinweis: Primer für die Validierung muss eindeutig sein, um das Gen von Interesse oder ein falsch positives Ergebnis erhalten werden kann. Primer Design kann auf validiert http://www.toxodb.org durch Strahlen Primersequenzen zum Genom (s), um zu überprüfen Primer sind einzigartig.

31. Passage Parasiten Klone auf einem Wochenplan, wie in Schritt 24 beschrieben. Sobald der gezielten Löschung bestätigt wurde, ist weiterhin in Auswahl MPA + X optional.
32. Archiv Parasiten Klone durch die Vorbereitung Gefrierschrank Aktien. Pellet extrazellulären Parasitenaus lysierten HFF-Zellen in einer 25 cm ² Kulturflasche, entfernen Medien und sanft resuspendieren Parasiten Pellet in Zellkultur Einfrieren Medium bei einer Konzentration Parasiten> 4 x 10 ⁷ Parasiten pro ml. Übertragen Aliquots Kryoröhrchen und speichern Parasiten auf unbestimmte Zeit in flüssigem Stickstoff oder bei -80 ° C

2. Löschung von HXGPRT

Dieses Protokoll wird zum Entfernen des HXGPRT Marker aus der Integration vor Ort in das Genom einer genetisch manipulierten Δ Ku80 Belastungen ausgelegt. Entfernen HXGPRT ermöglicht Marker Erholung und die Erzeugung von Stämmen mit verschiedenen genetischen Manipulationen nur mit Auswahlen HXGPRT ^1-3 basiert. Während das Protokoll detailliert beschreibt die Methode, um wieder gezielt ein Ort, um HXGPRT löschen, sei darauf hingewiesen, dass die Entfernung von HXGPRT am Genlocus sich außerdem ermöglicht die gleichzeitige Re-Integration des Wildtyp-Gen (c werdenomplementation), Re-Integration eines mutierten Gens sowie Reintegration eines markierten Gen (N-oder C-terminalen GFP, HA-Tag, usw.), so dass für eine Vielzahl von genetischen Manipulationen. Die Mechanismen der Aktion ²⁴ und Targeting-Protokolle unter Verwendung von 6-Thioxanthin Selektionen wurden zuvor ^1-3,15 beschrieben.

2.1 Löschen HXGPRT

1. Excise die HXGPRT selektierbaren Marker von pΔGOI durch Verdau mit RE.Z auf die einzigartigen Restriktionsenzym-flankierenden HXGPRT (1B) zu schneiden.
2. Überprüfen vollständigen Verdau der DNA durch Agarose-Gel-Elektrophorese. Isolieren des größeren der beiden Bänder aus dem Agarosegel.

Hinweis: Das größere der zwei Bänder enthält das Plasmid zusammen mit dem 5 'und 3'-DNA-Target-Flanken, aber nicht die HXGPRT Gen.

3. Legen Sie die Agarose Abschnitt mit dem größeren DNA-Bande in einer Spin-Säule laying das Gel flach auf der Membran. Drehen Sie die Säule bei 13.000 x g für 4 min bei RT. In sterilem H ₂ O, um die Durchfluss-, um die Lautstärke zu 100 ul zu bringen.

Hinweis: Andere kommerzielle Methoden zur Verfügung, um DNA aus Agarose isolieren.

4. Konzentrieren von DNA EtOH Niederschlag, Resuspendieren der DNA in einem Endvolumen von 18 ul sterilem H ₂ O.
5. Mischen Sie 1 ul konzentrierter DNA mit 7 ml H ₂ O, 1 ul 10x Ligationspuffer und 1 ul T4-DNA-Ligase (5 Einheiten) und legen Sie die Reaktion bei 4 ° C über Nacht pΔGOIc (pΔGOIclean) (3A) zu erzeugen.

Hinweis: DNA-Fragmente mit RE.Z enthält DNA-Enden gestaltet werden kann und bei diesem Schritt aufgenommen werden, um die Plasmide für gezielte Re-Integration des Wildtyp-Gen (Komplementierung), gezielte Re-Integration eines mutierten Gens sowie gezielte erstellen Re-Integration eines markierten Gen(N-oder C-terminalen GFP, HA-Tag, usw.).

6. Verdünnen Sie die Reaktion 2x mit sterilem H ₂ O vor Elektroporation.
7. Verwandeln pΔGOIc in E. coli wie in Protokoll 1.1 bis subklonieren, isolieren und Validierung der Targeting-Plasmid. Dann linearisieren in Vorbereitung für die Transfektion pΔGOIc (siehe Schritte 1.1.11 bis 1.1.26).
8. Wiederholen Sie den Parasiten Transfektionsprotokoll wie in Protokoll 1.2 (Schritte 1 bis 11) beschrieben.

Hinweis: Vor der Durchführung Schritte 1 bis 8, überprüfen Sie, dass die gezielte Entfernung von HXGPRT ist in der mutierte Stamm möglich. Infect eine 150 cm ^2-Kolben von konfluenten HFF-Zellen mit 1 x 10 ⁶ Tachyzoiten des mutierten Stamm mit 6-Thioxanthin (6TX) Selektionsmedium (200 ug / ml in 6TX Infektion mittel) und platzieren Sie den Kolben in einem PFU-Assay. Überprüfen Sie die Flasche 8 Tage später, um zu überprüfen, dass keine (oder nur sehr wenige; <10) PFU sichtbar sind, die für die Einführung ist, dass das PotenzialTiAl Gen-Targeting-Effizienz mögliche spontane Reversion des mutierten Stamm zu einem Phänotyp mit reduziertem HXGPRT Ausdruck (a 6TX Resistenz-Phänotyp) überschreiten.

Anmerkung: Etwa 5 - 10% der HXGPRT Integration Websites zeigen eine signifikante und spontanen Häufigkeit von 6TX Widerstand, obwohl die HXGPRT Marker noch an der Ziel-Website (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse für nähere Informationen) integriert.

9. Beginnen 6TX Auswahl ~ 20 Stunden nach der Transfektion durch Wechsel des Mediums in der 150 cm ^2-Kolben zu 6TX Selektionsmedium.

Hinweis: Bitte nicht stören die Flasche für ~ 10 Tage nach der Transfektion.

10. Überprüfen Sie die Flasche für PFU Bildung an Tag 10 - 12 nach der Transfektion (Typ I Parasiten) oder Tag 10 - 16 nach der Transfektion (Typ II Parasiten).

Hinweis: Parasites ist für die Löschung der HXGPRT gezielt wird nicht anfangen, unter 6TX Auswahl wachsen, bis die HXGPRT Gen und mRNA wird gelöscht, und die restliche HXGPRT Protein inaktiviert ist.

11. Schütteln Auswahl Kolben mit einem Parasiten-Lösung und 0,5 Übertragung zu schaffen - 1,0 ml des Parasiten Lösung in eine neue 25 cm ^2-Kolben mit konfluenten HFF-Zellen und 5 ml 6TX Selektionsmedium. Wiederholen Sie die Übertragung aus den primären 150 cm ² bis 25 cm ² neue Flaschen einmal am Tag für zwei weitere Tage.

Hinweis: Mehrfachprobenahmen erhöht die Chancen für den Fang von lebensfähigen Parasiten, die die gezielte HXGPRT Gen verloren haben.

12. Überprüfen Sie die 25 cm ^2-Kolben ~ 5 Tage nach der Infektion, um das Vorhandensein der Entwicklung PFUs mit Zonen von gesunden replizierenden Parasiten überprüfen. Wählen Sie eine oder zwei Flaschen mit Zonen der Infektion.

Hinweis: HXGPRT Gen Replikat auf einem normalen Wachstumsrate in 6TX Auswahl gelöscht.

13. Weiter zum Durchgang die Parasiten in 6TX Selektionsmedium.
14. Subklon den Parasiten Bevölkerung nach 25 - 30 Tagen der Selektion. Richten Sie einen 96-Loch-Tablett mit ~ 1 Parasiten / gut und das andere mit 2 ~ Parasiten / well.
15. Bereiten Parasiten-DNA aus isolierten Klone und pflegen Klone in einer 24-Well-Format Kultur nach Protokoll 1.2 (Schritte 19 bis 29).
16. Bestätigen Löschung HXGPRT durch PCR unter Verwendung der Strategie in den 3A-B dargestellt.

3. C-terminale Markierung von Proteinen

Dieses Protokoll wird für C-terminale Markierung von Proteinen durch Targeting die tag für die Integration über Doppelkreuz über homologe Rekombination an der genomischen Lokus des Gens mit MPA entwickelt + X Auswahl ^2,4. Dieses Protokoll arbeitet effizient, weil die 5 'dhfr Reihenfolge der 2,4.

3.1 Direkte C-terminale Markierung von Proteinen an endogene genetische Loci

1. Erstellen Targeting pΔGOItag Plasmidkonstrukt Verwendung von Hefe rekombinatorischen Klonen (Abbildung 4) und Methoden in Protokoll 1.1 beschrieben. Die 5 'genomische Targeting Flanke enthält die letzten 800 bis 1.200 bp kodierende Region (oder genomische DNA) der indischen Regierung, mit Ausnahme der Terminationscodon zu einer Position 3 bewegt wird "mit dem Tag der Wahl (HA tag, Myc-Tag, His-Tag , etc.)
2. Erstellen Sie das gezielte Einsetzen des C-terminalen tag an dem endogenen Locus des Protein-kodierenden Gen indem Sie die Schritte in Protokoll 1.1 und 1.2 mit der skizzierten Strategie (Abbildung 4).
3. Überprüfen das Einsetzen des C-terminalen-Tag am endogenen Genort unter Verwendung eines PCR-Strategie.
4. Retarget die Genlocus Methoden in Protokoll 1 und 2 zu Protokoll d beschriebenElete die HXGPRT Selektionsmarker eine präzise geregelte endogene Genlocus, die ein markiertes Protein exprimiert erstellen. Dieses Protokoll gewinnt auch die HXGPRT Selektionsmarker, die wieder verwendet werden kann, eine andere Stelle im markierten Stamm (siehe Protokoll 1) Ziel.

Representative Results

Eine detaillierte Vorlage zum Aufbauen eines Targeting-Plasmid, ein Gen zu löschen, einschließlich der Platzierung von Restriktionsenzymstellen und Erzeugung der Primer, die genetische Targeting und Validierung von Gen-Targeting, sowie Plasmidkonstruktion Erleichterung für den nachfolgenden Löschung HXGPRT in einer dafür vorgesehenen Einstufiges Verfahren (1A-C, 2A, 3A). Ein allgemeines Schema für die Herstellung einer gezielten Gen-Deletion (2A), die Primer-Paare verwendet werden, um die Löschung eines Knockout validieren, zum Beispiel dargestellt, sind Typ I ROP18 (2B) und repräsentative Ergebnisse des PCR-Validierung gezeigt (Abbildung 2C). Diese repräsentatives Ergebnis ist gezeigt, um die Streuung der Ergebnisse, die auf genetischer Loci, die relativ schwer sind Ziel erreicht werden kann, darzustellen. Eine erfolgreich gezielte Gen-Deletion in der Abwesenheit des Gens in FolgeInteresse PCR-Produkt (PCR 1), das Vorhandensein des 3'das genomische Targeting Flanke (PCR2) und die Gegenwart des selektierbaren Markers HXGPRT richtig zwischen 5 integriert und 3'das genomische Targeting Flanken, die die Löschung definieren (PCR3 und PCR4) . Clones 3, 4, 5, 6, 8, 9 und 11 sind gezielte Deletionen (Knockouts), wo HXGPRT die indische Regierung (Abbildung 2C) ersetzt wurde validiert.

Ein Klon, der keine einen Gendeletion kann durch eine Vielzahl von Bandenmuster dargestellt werden. Typischerweise wird ein Klon ohne Gen-Deletion die elterliche Stamm (elterlichen Muster) mit Bands für PCR1 und PCR2 beobachtet spiegeln, aber nicht für PCR3 oder PCR4 wie Klone 1 und 2 (Abbildung 2C) gesehen. Diese "elterliche Muster" ergibt sich aus ein paar mögliche Mechanismen. Gelegentlich tragen MPA beständig ausgewählt Parasiten nicht integrierten persistierenden Episomen der pΔGOI Targeting-Plasmid, und wir beachten, dass fortgesetzte Zuchtwahl oft zwingt diese Episomenzu integrieren. Wir beobachten einige seltene Hintergrund in der Typ-I-Δ Ku80 Kräften durch unbeabsichtigte Integration der pΔGOI Targeting Plasmid, das enthält eine HXGPRT cDNA über DHFR 5 'und 3' Promotorelemente, entweder in die DHFR-Locus oder in den teilweise gelöschten HXGPRT ausgedrückt Locus ^14. Während dieses seltene Ereignis ist eine gezielte Integration, war es nicht die beabsichtigte Integration und dient als wichtiger Punkt bei der Gestaltung eines Gen-Ersatz-Strategie erinnern. DNA-Homologie größer als 120 bp auf Ihrem pΔGOI durchgeführt Targeting Plasmid kann eine Alternative für die Rekombination in Δ Ku80 Stämme ^2, die zurück geben könnte einen unerwünschten Hintergrund. In der Typ-II-Pru Δ Ku80 Stamm diesem Hintergrund wird reduziert oder gar nicht im Vergleich zu Typ I, da die HXGPRT Selektionsmarker auf Typ-I-Sequenzen, die Nukleotid-Polymorphismen haben, wenn sie mit Typ-II-DNA im Vergleich basiert diereduziert diese seltene Hintergrund in Experimenten unter Verwendung der Typ-II-Pru Δ Ku80 Stamm ^1. Wenn ein Gen-Locus wesentlich ist (kann nicht gelöscht werden), oder hat einen extrem niedrigen Gen-Targeting-Frequenz an der Stelle, oder wenn persistierende [nicht integrierten] Episomen nicht einfach über Wachstum und Selektion eliminiert, diese elterliche Muster wird das Muster in MPA beobachtet dominieren resistenten Klone. Alternativ wird das Targeting-DNA-Molekül beobachtet, manchmal nur an der 5 'oder 3'-genomische Targeting Flanke und eine Band ist entweder PCR3 oder PCR4 beobachtet (aber nicht beide) zusammen mit PCR1 und PCR2 als für Klon 10 zu sehen (5 integrieren 'Integration) und Klon 7 (3' Integration) (Abbildung 2C). Diese Muster deuten die seltenen Auftreten einer einzigen Cross-Over-Integration des Targeting-Plasmid an der Stelle, die HXGPRT integriert aber diese gezielte Integration löscht nicht das Gen von Interesse. Dieses Muster (Spuren 7 & 10 in 2C) emzeigersinn die Notwendigkeit, die PCR-Daten zu berichten, um zu überprüfen, dass die gezielte Integration stattgefunden anstelle eines einzigen homologen überqueren und eine zweite homologe Integration des Zielmoleküls. Selten, beobachten wir eine genetische Mischung von Klon 12 (2C), die sowohl eine elterliche Muster und einen gezielten Löschung Muster stellt vertreten. Dieses Muster wahrscheinlich entsteht gelegentlich von zwei Genotypen, Parasiten an derselben Stelle in einem Klonierungsvektor gut.

Ein allgemeines Schema für die Entfernung von HXGPRT von Δ ku80Δgoi :: HXGPRT zu HXGPRT aus dem Stamm löschen dargestellt (Abbildung 3A). Die Primer-Paar verwendet, um das Entfernen von HXGPRT Δ Δ Ku80 GRA2 :: HXGPRT (3B) zu validieren verstärkt eine einzigartige ~ 1,2 kbp Band in PCR5 nach Klone 4, 7, 9, 11 und 12 (Fig. 3C) gesehen. Wenn HXGPRT nicht von dem Ort, a ~ 3 entfernt.4 Kbp Band beobachtet wird (Klone 1, 2, 3, 6, 8, 10, und die elterliche Kontrolle). Mehrere Mechanismen handeln, um die Entfernung von HXGPRT (6TX Auswahl) schwieriger und weniger effizient als die Integration von HXGPRT (MPA + X Auswahl). MPA Auswahl ist einfach effizienter als 6TX Auswahl ^14,16. Außerdem werden höhere HXGPRT Ausdruck für 6TX Auswahl als MPA Auswahl ^16,24 erforderlich. Folglich können Mutationen, die HXGPRT Enzymaktivität oder Mutationen oder epigenetischen Veränderungen, die die Expression von HXGPRT am Locus eines Gens reduzieren reduzieren kann möglicherweise die Abschaffung der Wirksamkeit 6TX Auswahl. Selbst mit diesen Herausforderungen 6TX Auswahl, ist die Erfolgsquote von 6TX Auswahl Δ Ku80 Stämme mehr als 90% beim ersten Versuch ^1-3.

Ein allgemeines Schema für die direkte C-terminale Markierung von Protein-kodierenden Gene dargestellt (Abbildung 4). DieseSchema verwendet die direkte Integration über Doppelkreuz über homologe Rekombination HXGPRT 3 'des Gens markiert und auch beschäftigt Validierung ähnliche Strategien wie die oben beschriebenen. Wenn ein Gen, das im Verdacht steht, ein essentielles Gen der Nachweis erbracht, unter Verwendung eines zweiten Transfektion mit einem unabhängig isoliert zielende DNS-Plasmid werden kann. Alternative Methoden, wie z. B. Systeme für regulierte Genexpression, zur weiteren Überprüfung, ob ein Gen ist wichtig ²⁵ verfügbar.

Abbildung 1. Überblick über die Konstruktion eines Targeting-DNA-Plasmid. A. Schema für die Gestaltung überlappen Primer zur PCR zu amplifizieren den 5 'und 3'-Ziel-Flanken mit 33 bp Überlappungen der Shuttle-Vektor pRS416 und HXGPRT Minigen Kassette. Grundierungen im Schaltplan dargestellt warenverwendet, um die 5 'und 3'-Ziel Flanken pΔROP18 ^10. B. Allgemeine Strategie zur Konstruktion eines Targeting-DNA-Molekül zu erzeugen. Das Rückgrat ist die pΔGOI pRS416 Shuttle-Vektor enthaltenden Uracil (URA) und Ampicillin (AMP) Selektionsmarker. Eingefügt in pRS416 ist a ~ 1 Kbp 5 'DNA-Target-Flanke aus genomischer DNA mit Überlappungen zum HXGPRT Minigen Kassette und pRS416 mit den F1 und R1 amplifiziert, a ~ 1 Kbp 3' DNA-Target-Flanke aus genomischer DNA mit Überlappungen für verstärkte die HXGPRT Minigen Kassette und pRS416 mit den F2 und R2 Primer und die HXGPRT Minigen Kassette. Die folgenden einzigartigen Restriktionsenzymverdau Seiten mit den Primern hinzugefügt: RE.X (Restriktionsenzym Schnitt X site) in der F1-Primer an die Plasmid-am 5'-Ende der 5'-DNA-Target-Flanke zu schneiden, in der R2 RE.Y Primer, um das Plasmid an das 3'-Ende der 3'-Ziel-DNA flankieren und RE.Z Schnitt in der R1 und F2 Primer Verbrauchsteuerpflichtige die HXGPRT minigene Kassette. C. Primer-Sequenzen verwendet, um das Targeting-Konstrukt für die Löschung der ROP18 erzeugen. Die fett Regionen T. entsprechen gondii genomische Sequenz und die nonbold Bereiche den Restriktionsenzymstellen und Sequenzen, die mit pRS416 und HXGPRT Minigen Kassette überlappen entsprechen. Die HX_F und HX_R Primerpaar verstärkt das HXGPRT Minigen Kassette ^14. Primer lesen von 5 'nach 3'. Tabelle aus Fentress et al ¹⁰ angepasst. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 2. Überblick über das Protokoll für die Löschung eines Gens mit HXGPRT. A. Disruption einer indischen Regierung in der Δ ku80Δhxgprt Belastung durch einen Doppel-Crossover homologe Rekombination Veranstaltung mit einem ~ 1 Kbp 5 'DNA-Target Flanke und ein ~ 1 Kbp 3' DNA-Target-Flanke auf dem Plasmid pΔGOI. Ein PCR-Strategie mit PCR1, PCR2, PCR3 und PCR4 (nicht maßstabsgetreu) wird gezeigt, dass Genotyp Überprüfung ermöglicht, um Klone mit gezielten Integration von HXGPRT und Löschung der indischen Regierung Locus validieren. B. Repräsentative Primerpaare entworfen, um die Löschung der ROP18 validieren . ROP18_DF und ROP18_DR verstärken PCR1, ROP18_ExF und ROP18_CxR verstärken PCR2, ROP18_CxF und DHFR_CxR verstärken PCR3 und DHFR_CxF und ROP18_CxR verstärken PCR4 (siehe Abbildung 2A). Primer lesen von 5 'nach 3'. Tabelle aus Fentress et al ^10. C. Repräsentative Ergebnisse der Validierung einer gezielten Gen-Deletion (ROP18) mit HXGPRT angepasst. Nach der Transfektion von Plasmid pΔROP18 in Δ ku80Δhxgprt und Selektion in MPA +X, X + MPA-resistente Klone wurden für die Löschung der ROP18 getestet. Die Elternstammes Kontrolle ist für die PCR-1 (~ 400 bp) und PCR 2 (~ 650 bp) Produkt positiv und negativ für die PCR-3 (~ 1.200 bp) und PCR 4 (~ 1.300 bp) Produkt. Eine gezielte GOI Knockout ist positiv für die PCR2, PCR3 und PCR4 Produkte und ist für die PCR 1 Produkt negativ (siehe Abbildung 2A). Dargestellt sind repräsentative Platten der Ergebnisse PCR1 und PCR2 (oben), PCR3 (Mitte), und PCR4 (unten). Klone, 3, 4, 5, 6, 8, 9 und 11 zeigen die richtige Bandenmuster PCR 1, PCR2, PCR3 und PCR4 die ein Zielgen Lösch-Ereignis in dem Klon definiert. Klone 1, 2, 7, 10 und 12 sind nicht Deletionen und entsprechen andere potenzielle repräsentative Ergebnisse. (C = elterliche Kontrolle Stamm Δ ku80Δhxgprt, M = Größe Marker). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 3. Übersicht des Protokolls für Re-Targeting das Gen von Interesse HXGPRT löschen. A. Strategie zur Entfernung des HXGPRT Selektionsmarker durch eine doppelte Crossover-Ereignis der homologen Rekombination in dem Stamm Δ ku80Δgoi :: HXGPRT eine ~ 1 kbp 5 'Ziel-DNA flankieren und ein ~ 1 kbp 3' DNA-Target-Flanke auf dem Plasmid pΔGOIc. Die PCR-Strategie für Genotyp Überprüfung dargestellt unter Verwendung eines Primer-Paares, um Assays für eine PCR-Produkt (PCR5), die die Löschung umfasst (nicht maßstabsgetreu). B. Eine repräsentative Primerpaar konstruiert, um das Entfernen des HXGPRT Selektionsmarker vom GRA2 validieren Locus in Stamm Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Grundierungen GRA2 _CLF und GRA2_CxR verstärken PCR5. Grundierungen Lesen von 5 'nach 3'. C. repräsentativen Auswahl von 6TX-resistenten Klone, die nach Transfektion von Plasmid pΔGOIc erhalten in Δ ku80Δgoi :: HXGPRT und Auswahl werden kann 6TX. Klone, 4, 7, 9, 11 und 12 zeigen die richtige Bandenmuster PCR5 die gezielte Deletion der HXGPRT Marker (~ 1,2 kbp-Produkt, das umfasst das 3'-Flanke mit geringfügige Überlappung mit dem 5'-Flanke und außerhalb der 3 'entspricht Flanke). Klone 1, 2, 3, 6, 8 und 10 (diese Band Licht) stellen die erwarteten Bandenmuster um ~ 3,4 kbp, die dem elterlichen Klon Genotyp entspricht, auch wenn diese Klone eine gewisse Resistenz zeigten an, die zulässige 6TX ihre Auswahl (dieser Phänotyp kann gelegentlich spontan entstehen durch Abschalten HXGPRT Ausdruck (siehe Hinweis im Protokoll 2.1 (Schritt 8) und Repräsentative Ergebnisse Abschnitt). (C = elterliche Kontrolle Stamm Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = Größe Marker).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4. Konstruktion eines Targeting-DNA-Molekül, um die C-terminalen Ende des Proteins kennzeichnen. Die Strategie beruht auf der Fähigkeit des HXGPRT Marker auch als 3'-regulatorische Region stromabwärts funktionieren basiert. Das Rückgrat ist die pΔGOItag pRS416 Shuttle-Vektor mit Uracil (URA) und Ampicillin (AMP) Selektionsmarker. Eingefügt in pRS416 ist a ~ 1 Kbp 5 'DNA-Target-Flanke aus genomischer DNA mit Überlappungen zum HXGPRT Minigen Kassette und pRS416 mit dem Fgoi und RTAG Primer, a ~ 1 Kbp 3 verstärkt' Ziel-DNA Flanke von genomischer DNA mit Überlappungen für verstärkte die HXGPRT Minigen Kassette und pRS416 mit der F2 und R2Primer und die HXGPRT Minigen Kassette. Die 5'-DNA-Target Flanke ersetzt die Terminationscodon mit dem Tag (HA, Myc, His, etc.) von einem Ersatz Terminationscodon gefolgt. MPA + X Auswahl integriert die C-terminalen Tags und einer stromabwärts HXGPRT und bewegt das 3'-UTR zu einer Position nach der HXGPRT Marker. Die folgenden einzigartigen Restriktionsenzymverdau Seiten mit den Primern hinzugefügt: RE.X (Restriktionsenzym Schnitt X site) im Fgoi Primer, um das Plasmid an das 5'-Ende der 5'-DNA-Target Flanke geschnitten und in die RE.Y R2-Primer, um das Plasmid am 3'-Ende des 3'-DNA-Target Flanke und RE.Z im RTAG und F2 Primer geschnitten, um die Verbrauchsteuern HXGPRT Minigen Kassette zur Verwendung für Plasmidkonstruktion wieder gezielt das markierte Genlocus löschen die HXGPRT Marker, der die Platzierung der 3 'UTR wiederherzustellen.

Discussion

Hier bieten wir ein Protokoll für einen effizienten Gen-Targeting in Δ Ku80 Parasitenstämme um die effiziente Gewinnung von genetisch manipulierten Nachkommen, die gezielte Deletionen, Genaustausche und / oder markierten Gene besitzen können. Die sequentielle Ausführung dieser Verfahren stellt eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Mutanten Parasiten, die einzelne oder mehrere gezielte genetische Manipulationen ^1-3 enthalten. Während die Erzeugung eines gezielten Löschung hängt von mehreren Faktoren ab, die Verwendung der Δ Ku80 Stamm mit der vorgestellten Strategie und Protokoll erhöht die Effizienz und Leichtigkeit der Herstellung genau definierte Mutanten von T. gondii zur funktionellen Genom-Studien.

Das Genom von T. gondii während asexuellen Stadien ist haploid. So eine Überlegung zu machen bei der Planung, um ein Gen zu löschen ist, dass das Gen darf nicht wesentlich in vitro. Dennoch ist die Effizienz der targeting Gen-Knockouts in Δ Ku80 Stämme ist sehr hoch, und dies ermöglicht die Isolierung von Mutanten mit deutlich eingeschränkter Replikationsraten. Wenn eine gezielte Gen ist wichtig, Parasiten oft nicht mehr bei der Auswahl zu replizieren. Ein weiterer kritischer Faktor bei der gezielten genetischen Manipulation ist, dass perfekte Homologie mit mindestens 620 bp der genomischen Targeting Flanke wird benötigt, um nachweisbar zu erhalten gezielte Integrationen ^2. Längere Homologieregionen erzeugen höhere Wirkungsgrade von Targeting und mit Targeting-DNA Flanken von ca. 1.000 bp ist ein zuverlässiges und effizientes Konzept ^1-4. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass genomische Targeting Flanken aus dem gleichen Stamm von T. erzeugt gondii (RH, Pru) als Stamm, ist genetisch manipuliert wird. Mangel an ausreichender Homologie häufig in der gezielten Integration eines genomische Targeting Flanke führen, aber nicht die anderen. Unvollständige Integration bzw. gegen eine Knockout ma erhalteny auch aufgrund episomalen Beharrlichkeit. Unmittelbar nach der Transfektion werden alle Zielmoleküle Episome nicht integrierten und manchmal Targeting-Moleküle können als Episomen viele Generationen bestehen. Mit Ziel-DNA-Flanken von ~ 1 Kbp und Weiterbildung, um Parasiten unter Selektion vor Re-Subklonierung passieren häufig behebt Probleme mit episomalen Persistenz verbunden.

Sobald ein Knockout wird validiert und die HXGPRT Markierung entfernt wird, kann das Gen-Targeting-Strategie auf einer zweiten GOI mehrere Deletionen in einem einzigen Parasiten Stamm ^1-3 erzeugen wiederholt werden. Die Erzeugung von Deletionen, Ersatz oder markierten Gene können auch durch die Verwendung verschiedener Selektionsmarker (Bleomycin, CAT, Pyrimethamin resistent DHFR, etc.) erreicht werden. Obwohl die CAT Selektionsmarker derzeit in der Typ-II-Δ Ku80 Pru Genoms ¹ kann diese Markierung entfernt werden unter Verwendung des HXGPRT HXGPRT Auswahl die sicherste und effizienteste Marker mit der höchsten Effizienz Targeting wo ein single-copy gezielte Einsetzen ist ausreichend für robuste Auswahl MPA + X Medium. HXGPRT bietet auch die einzige derzeit nützlicher Ansatz für gezielte Löschen eines Selektionsmarker (Abbildung 3) mit 6-Thioxanthin (6TX) ^2,3 Auswahl. Dabei dient dieses Protokoll bietet die einzige derzeitige Ansatz für die Entwicklung definiert Mutanten mit mehreren gezielten genetischen Manipulationen.

Dieses Protokoll bietet eine wertvolle und effiziente Methode zur gezielten genetischen Manipulation in Δ Ku80 Stämme von Toxoplasma gondii und ist auf die Analyse eines einzelnen Gens, einer Familie von Genen, oder Genom-weiten funktionalen genomischen Studien. Vor der Verfügbarkeit von Δ Ku80 Stämme ^1,2 waren diese Ansätze nicht allgemein möglich aufgrund der inefficiency dieser Methoden. Folglich ist dieses Protokoll weit für gezielte genetische Manipulation von Toxoplasma gondii und ist zugänglich für alle Ermittler bei der Bewältigung einer Reihe von Fragen auf Parasiten Biologie, Host-Reaktion und der funktionellen Genomik interessiert.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Overlap Primers	Integrated DNA Technologies		4 nmole Ultramer DNA oligos
Validation Primers	Integrated DNA Technologies		100 nmole DNA Oligo
Yeast Strain #90845	ATCC		Designation FY834
Shuttle Vector pRS416	ATCC	87521
DH10B E. coli	Invitrogen	12033-015	SOC broth in kit with E. coli
Resuspension Buffer	Qiagen		Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit
Miniprep Kit	Qiagen	27104	QIAprep Spin Miniprep Kit
Glass Beads	Scientific Industries	SI-BG05	0.5 mm acid-washed
Qiacube Automated Robotic Work Station	Qiagen
Electroporation Cuvette	USA Scientific	9104-5050	2 mm-gap
BTX600 electroporator	BTX
Maxiprep Kit	Qiagen	12662	QIAprep Spin Maxiprep Kit
25 cm2 Canted neck plug seal flask	Corning	430168
150 cm2 Canted Neck plug seal flask	Corning	430823
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells	ATCC	SCRC1041
Swin-lok Filter Holder	Whatman	420200	25-mm-diameter
Membrane	Whatman	110612	Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter
Mycophenolic acid (MPA)	Sigma
Xanthine (X)	Sigma
96-well Tissue Culture Tray	Corning Costar
24-well Tissue Culture Tray	Corning Costar
MEM Eagle Media	Lonza Biowhittaker	12-611F
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-111
Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)	Gibco	15240-062
Spin Column	Primm Labs	PAE-100	Easy Clean DNA Extraction Spin Kit
T4 DNA Ligase	New England Biolabs
6-thioxanthine	Acros Organics
Tissue DNA Minikit	Qiagen	51104	QIAamp DNA Blood Mini Kit
Cell Culture Freeze/Recovery Media	Gibco	126-48-010
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30028.02	minus calcium, minus magensium