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Immunology and Infection

में आनुवंशिक हेरफेर Published: July 12, 2013 doi: 10.3791/50598
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, The Geisel School of Medicine at Dartmouth

Summary

यहाँ हम प्रकार मैं और प्रकार द्वितीय का उपयोग करने के लिए एक विधि की रिपोर्ट

Introduction

Toxoplasma gondii कि अक्सर एक आम लाचार इंट्रासेल्युलर प्रोटोजोआ परजीवी है और लंबे समय से पशुओं और मनुष्यों 5 की एक विस्तृत श्रृंखला को संक्रमित करता है. यह इस रोगज़नक़ द्वारा अधिक से अधिक 1 अरब मनुष्य है कि वर्तमान में अनुमान लगाया गया है और लंबे समय से संक्रमित है. टी. के कारण बीमारी के महत्व के अलावा इन विट्रो विकास और उत्कृष्ट माउस मॉडल में टी. बना दिया की gondii संक्रमण, प्रयोगात्मक उपकरण, शक्तिशाली जीनोमिक्स संसाधनों 6 की बढ़ती उपलब्धता, आसानी gondii इंट्रासेल्युलर यूकेरियोटिक रोगजनकों और इस तरह के मलेरिया (प्लाज्मोडियम सपा.) और Cryptosporidiosis (क्रिप्टोस्पोरिडियम) 5,7 के रूप में घातक रोगों का कारण है कि अन्य महत्वपूर्ण Apicomplexan परजीवी के व्यापक अध्ययन के लिए एक प्रमुख मॉडल प्रणाली. एक मॉडल के रूप में जीव Toxoplasma gondii का एक महत्वपूर्ण सीमा आनुवंशिक जोड़तोड़ लक्षित ले कि संतान के अकुशल वसूली की गई है. इस समस्याओं केजीन लक्ष्यीकरण में मीटर टी. के जंगली प्रकार उपभेदों में nonhomologous पुनर्संयोजन की बहुत उच्च आवृत्ति के सापेक्ष मुताबिक़ पुनर्संयोजन के एक कम आवृत्ति की वजह से है व्यापक डीएनए अनुरूपता आनुवंशिक अध्ययन 2 में इस्तेमाल किया डीएनए अणु लक्ष्य में प्रदान की जाती है gondii भी जब.

हमने हाल ही में आनुवंशिक प्रकार में nonhomologous पुनर्संयोजन के प्रमुख मार्ग अवरुद्ध, KU80 प्रोटीन 1,2 एन्कोडिंग जीन को हटाने से मैं और प्रकार द्वितीय Toxoplasma gondii के उपभेदों. मैं और प्रकार द्वितीय Δ KU80 उपभेदों सामान्य विकास दर, आकार और इन विट्रो में और vivo में इन विट्रो में tachyzoite और bradyzoite चरणों के दौरान और इन विवो में दोनों व्यवहार प्रदर्शित परिणामस्वरूप प्रकार, हालांकि, इन उपभेदों अनिवार्य रूप से एक 100% मुताबिक़ पुनर्संयोजन की आवृत्ति और इस प्रदर्शन फेनोटाइप कई यद्यपि करने के लिए कई सौ द्वारा लक्षित आनुवंशिक जोड़तोड़ की तेजी अलग इच्छित संतान की संभावना बढ़ जाती हैUSand गुना 1,2,4. हाल के समुदाय चौड़ा मैं और प्रकार द्वितीय Δ KU80 उपभेदों गति काफी ramped है प्रकार के उपयोग, विविधता, साथ ही टी में लक्षित आनुवंशिक दृष्टिकोण की सफलता दर gondii 1-4,8-13. यहाँ हम टी. के Δ KU80 उपभेदों में लक्षित जीन विलोपन, जीन प्रतिस्थापन, और जीन टैगिंग के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल का वर्णन gondii. हम डिजाइन और मज़बूती से Toxoplasma gondii की Δ KU80 उपभेदों में विशिष्ट जीन या आनुवंशिक loci के लिए आनुवंशिक जोड़तोड़ लक्षित करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है.

Protocol

1. ब्याज की एक जीन नष्ट करने के लिए लक्ष्य निर्धारण जीन

इस प्रोटोकॉल का एक परिभाषित आनुवंशिक ठिकाना पर एक लक्षित जीन विलोपन है कि एक उत्परिवर्ती तनाव के कुशल पीढ़ी के लिए बनाया गया है. पहले से वर्णित टी. gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) चयन मार्कर mycophenolic एसिड और xanthine (एमपीए + X) का चयन 14-16 निम्नलिखित सुरक्षित और विश्वसनीय मार्कर प्रविष्टि के लिए इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है. इस प्रोटोकॉल खमीर recombinational क्लोनिंग 17,18 के आधार पर डीएनए को लक्षित अणुओं के निर्माण के लिए एक मान्य और लागत प्रभावी विधि का उपयोग करता है. कई वैकल्पिक प्रोटोकॉल विट्रो recombinational क्लोनिंग तरीकों, या संलयन पीसीआर में, बैक्टीरियल recombinational क्लोनिंग तरीकों का उपयोग करके पुनः संयोजक को लक्षित अणुओं के निर्माण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. नीचे वर्णित प्रोटोकॉल क्लोन उबरने पारस के उच्चतम समग्र दक्षता और विश्वसनीयता प्रदान करता हैटी. के Δ KU80 उपभेदों में एक लक्षित जीन विलोपन रखने आईटीईएस gondii.

डीएनए को निशाना बनाने का 1.1 तैयारी

  1. ToxoDB 6 (प्रवेश http://www.toxodb.org ब्याज की जीन (भारत सरकार) के लिए जीनोमिक दृश्यों प्राप्त करने के लिए).

नोट: जीनोमिक दृश्यों की जा रही छेड़छाड़ तनाव के सबसे करीब है कि ToxoDB डेटाबेस में टाइप मैं, द्वितीय या तृतीय जीनोम अनुक्रम से प्राप्त किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए: प्रु लिए आरएच और ME49 के लिए GT1.

  1. 5 और 3 'खमीर शटल के साथ एक 33 बीपी ओवरलैप शामिल हित के जीन (भारत सरकार) के जीनोमिक लक्षित कर फ्लैंकों बढ़ाना कि डिजाइन विशिष्ट ओवरलैप प्राइमरों वेक्टर pRS416 (या वैकल्पिक रूप से pRS426) और चयन मार्कर के साथ एक 33 बीपी ओवरलैप शामिल ( HXGPRT) (आंकड़े 1 ए, बी). 5 'एक के दोनों सिरों पर प्रत्येक प्राइमर में एक अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम साइट जोड़ें33 बीपी ओवरलैप और टी. के बीच रखा एन डी 3 'जीनोमिक लक्षित कर flanks, gondii विशेष प्राइमर अनुक्रम (ओं) (आंकड़े 1 ए, बी).

नोट: एक 30 बीपी ओवरलैप से अधिक कुशल खमीर पुनर्संयोजन क्लोनिंग के लिए आवश्यक है. 5 और 3 'जीनोमिक लक्षित कर फ्लैंकों 800 और एक लक्षित विलोपन परिभाषित है कि 1,400 बीपी के बीच विशिष्ट डीएनए टुकड़े बढ़ाना तैयार कर रहे हैं. छोटे flanks काफी Δ KU80 Δ hxgprt पृष्ठभूमि 2 में दक्षता को लक्षित कम हो जाएगा अवगत रहें.

  1. पीसीआर 5 'प्राइमर एफ 1 और R1 उपयोग कर लक्ष्य पडता है और पीसीआर 3 बढ़ाना' बढ़ाना जीनोमिक डीएनए 3 से प्राइमर F2 और आर 2 (आंकड़े 1 ए सी) का उपयोग कर लक्ष्य पार्श्व. उधर, पीसीआर जुड़े 5 'और 3' dhfr प्राइमरों HXF और HXR उपयोग कर HXGPRT सीडीएनए pminiHXGPRT कैसेट 14 के क्षेत्रों flanking सहित ~ 2 KBP HXPGRT जीन बढ़ाना(आंकड़े 1 बी सी).

नोट: ट्रांसफ़ेक्ट हो माता पिता का तनाव से जीनोमिक डीएनए का उपयोग कर लक्ष्य फ्लैंकों बढ़ाना.

नोट: 5 और 3 'डीएनए ऐसे बाधित लोकस से HXGPRT की लक्षित हटाने के रूप में बाद में कुशल आनुवंशिक जोड़तोड़, सुविधाजनक बनाने के लिए किनारों को निशाना बनाने के सापेक्ष आगे अभिविन्यास में रखें HXGPRT मार्कर.

  1. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा सही पीसीआर उत्पाद आकार सत्यापित करें और agarose जेल मानकों का प्रयोग डीएनए टुकड़ा एकाग्रता या डीएनए एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एक अन्य विधि का अनुमान है.
  2. के रूप में GIETZ और Schiestly 17 में वर्णित सक्षम खमीर aliquots के उत्पन्न करता है.
  3. 5 से 50 एनजी 'जीनोमिक को लक्षित ओर, 3 की 50 एनजी' जीनोमिक को लक्षित ओर, HXGPRT चयन मार्कर के 100 एनजी, और 10 के अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए बाँझ एच 2 ओ के साथ linearized शटल वेक्टर की 50 एनजी जुडा है -20 μl. तीन पीसीआर उत्पादों और खमीर-E के साथ सक्षम खमीर रूपांतरण GIETZ और Schiestly 17 से वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग recombinational क्लोनिंग के लिए कोलाई शटल वेक्टर. प्लेट uracil शून्य से कम से कम मध्यम अगर प्लेटों पर खमीर तब्दील और 2 के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते - 3 दिन.

नोट: प्लाज्मिड, 5 'लक्ष्य दिशा, HXGPRT मार्कर, और 3' लक्ष्य दिशा का आदेश दिया विधानसभा डीएनए टुकड़े (आंकड़े 1 ए बी) के बीच इंजीनियर 33 बीपी ओवरलैप से मदद की है और में मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा मध्यस्थता है खमीर.

  1. Uracil शून्य से प्लेटों को 2x YPAD के 2 मिलीलीटर जोड़ने और धीरे अगर बाधा पहुँचा के बिना कालोनियों बेदखल scraping द्वारा फसल खमीर. 5000 XG पर 5 मिनट के लिए खमीर समाधान अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  2. RNaseA युक्त एक मेजबान बफर के 250 μl में खमीर गोली Resuspend और 50 को जोड़ने - एक के 100 μlसमाधान के लिए सीआइडी धोया ग्लास मनकों. खमीर कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए सबसे ज्यादा तेजी से कम 5 मिनट के लिए भंवर.
  3. कांच के मोती ट्यूब के नीचे बसा है और एक 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण करने की अनुमति दें.
  4. ~ 100 μl के अंतिम मात्रा में resuspending, एक Miniprep डीएनए अलगाव किट का उपयोग खमीर डीएनए अलग.
  5. DH10B इलेक्ट्रोपोरेशन सक्षम ई. के 40 μl के साथ 2 μl खमीर डीएनए (~ 50 एनजी) मिक्स कोली बर्फ पर रखा.
  6. एक ठंडा 2 मिमी अंतराल electroporation क्युवेट के लिए समाधान स्थानांतरण और 2.4 केवी और 129 Ω पर बैक्टीरियल कोशिकाओं electroporate.
  7. प्रत्येक क्युवेट और एक 14 मिलीलीटर तस्वीर टोपी फाल्कन ट्यूब को हस्तांतरण समाधान के लिए 0.8 मिलीलीटर समाज शोरबा जोड़कर बचाव कोशिकाओं. 60 मिनट - 40 के लिए एक रोलर ड्रम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं.
  8. प्लेट ई. 2XYT + एम्पीसिलीन (एएमपी) प्लेटों पर कोलाई और 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात प्लेटें सेते हैं.
  9. ~ चुनें 6 - 8 एकल कालोनियों और 37 डिग्री सेल्सियस पर ~ 16 घंटे के लिए 3 मिलीग्राम 2XYT + एएमपी में हो जाना
    10. ई. के एक 30% ग्लिसरॉल फ्रीजर स्टॉक तैयार कोली क्लोन.
  10. ई. से प्लाज्मिड pΔGOI पृथक कोली क्लोन ~ 100 μl के अंतिम मात्रा में resuspending, एक Miniprep किट का उपयोग कर.
  11. प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग कर pΔGOI डीएनए प्लाज्मिड आकार को मापने और उम्मीद pΔGOI डीएनए पैटर्न बैंडिंग सत्यापित करने हज़म मान्य करें.
  12. डीएनए 5 'और 3' में जीनोम अनुक्रम डेटा के आधार पर 100% डीएनए अनुक्रम को सत्यापित करने के लिए जीनोमिक लक्षित कर फ्लैंकों का अनुक्रमण द्वारा pΔGOI की मान्यता को अंतिम रूप देने http://www.ToxoDB.org .

नोट: पास सही अनुक्रम अनुरूपता प्रत्येक आधार जोड़ी अंतर सही समरूपता की लंबाई में एक इसी कटौती के गठन के बाद से दक्षता 3 को लक्षित जीन को अधिकतम करने के लिए आवश्यक है.

नोट: प्रु पैतृक सेंट पर आधारित प्रकार द्वितीय Δku80 तनाव का जीनोम अनुक्रमबारिश के इस समय उपलब्ध नहीं है. इस काम के प्रकार द्वितीय Δ KU80 तनाव के लिए किराए के जीनोम के रूप में प्रकार द्वितीय ME49 जीनोम अनुक्रम का उपयोग करता है. आनुवंशिक loci के एक नंबर पर अनुक्रम डेटा के आधार पर, यह ME49 जीनोम और प्रु जीनोम ~ 1 10,000 प्रति nucleotides, या कम की एक आवृत्ति पर एकल nucleotide बहुरूपताओं कि प्रदर्शन का अनुमान है.

  1. एक मान्य ई. से ग्लिसरॉल शेयरों के साथ एक ~ 250 मिलीलीटर 2XYT + एएमपी रातोंरात संस्कृति inoculating द्वारा pΔGOI शेयर की> 200 ग्राम उत्पन्न कोली Miniprep क्लोन.
  2. ~ 1000 μl के अंतिम मात्रा में resuspending एक maxiprep डीएनए अलगाव किट का उपयोग कर बड़े संस्कृति से pΔGOI प्लास्मिड डीएनए अलग.
  3. पहले अभिकर्मक के लिए सही लक्षित कर डीएनए अणु को सत्यापित करने के pΔGOI maxiprep के डीएनए अनुक्रमण प्रतिबंध एंजाइम हज़म, या डीएनए दोहराएँ.
  4. अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम एक्स (RE.X) का उपयोग 5 'अंत में ~ 15 ग्राम pΔGOI Linearizeपचाने साइट 5 'लक्ष्य पार्श्व (आंकड़े 1 बी) में बनाया गया है.

नोट: टी. में लक्षित जीन gondii ब्याज 2 के जीन ठिकाना पर घटनाओं को निशाना बनाने का एक कुशल आवृत्ति प्राप्त करने के लिए डीएनए को निशाना बनाने का ~ 10 ग्राम की एक न्यूनतम आवश्यकता है.

  1. PΔGOI के linearization मान्य और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन या एक वैकल्पिक विधि से डीएनए एकाग्रता का निर्धारण.

नोट: 5 पर प्रतिबंध एंजाइम पाचन 'पार्श्व पूरी linearization उपज नहीं है, बनाया गया 3' यदि अनूठा RE.Y पचाने साइट pΔGOI के linearization के लिए एक वैकल्पिक स्थल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

नोट: एक पूरी तरह से linearized को लक्षित डीएनए अणु Δ KU80 उपभेदों में मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा लक्षित कर सफल जीन के लिए आवश्यक है.

  1. Incubat द्वारा प्रतिबंध एंजाइम बेअसर15 के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर आईएनजी - 20 मिनट.
  2. बाँझ एच 2 ओ के 100 μl में linearized प्लाज्मिड के कम से कम 15 ग्राम तैयार अभिकर्मक के समय तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर linearized pΔGOI.

टी. के 1.2 तैयारी gondii परजीवी, अभिकर्मक, चयन, subcloning, सत्यापन, अभिलेखीय और आनुवंशिक रूप से चालाकी से उपभेदों का रखरखाव

टी. की संस्कृति और हेरफेर के लिए सामान्य तरीके मानव चमड़ी fibroblast (HFF) कोशिकाओं में gondii 19-21 वर्णित हैं. Δ KU80 Δ hxgprt उपभेदों परजीवी संक्रमण मध्यम (ईगल्स न्यूनतम आवश्यक मध्यम (EMEM) 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% कवकनाशी-एंटीबायोटिक एक 100x स्टॉक से पतला के साथ पूरक मध्यम विकास) 1,2 में सामान्य रूप से नकल. Toxoplasma gondii साथ सभी काम जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रक्रियाओं का उपयोग किया जाना चाहिए. टी. gondii RHΔ KU80 2 छाँटनाntal तनाव Roos लैब 14 से RHΔ hxgprt तनाव से उत्पन्न किया गया था. PruΔku80 1 माता पिता का तनाव एक स्थिरतापूर्वक एकीकृत कैट चयन मार्कर और bradyzoite चरण विशिष्ट प्रमोटर LDH2 के नियंत्रण में एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) संवाददाता जिसमें PruΔhxgprt (प्रु gniaud तनाव BSG-4 22) से उत्पन्न किया गया था.

  1. 1 एक्स 10 6 व्यवहार्य प्रकार मैं आरएच Δ KU80 Δ hxgprt परजीवी के साथ मिला हुआ HFF कोशिकाओं से युक्त एक 25 सेमी 2 फ्लास्क टीका लगाना, या 2 एक्स 10 6 व्यवहार्य प्रकार द्वितीय Prugniaud (प्रु) Δ KU80 Δ hxgprt परजीवी के साथ दो 25 सेमी 2 बोतल टीका लगाना.

नोट: व्यवहार्य परजीवी हौसले से बाहर lysed है कि बाह्य परजीवी के रूप में परिभाषित कर रहे हैं.

ध्यान दें:

  1. Δ KU80 Δ hxgprt संक्रमित संस्कृतियों का निरीक्षण ~ 68-72 घंटे के बाद संक्रमण. अभिकर्मक की सटीक समय की योजना के लिए HFF कोशिकाओं के 95% सेल - व्यवहार्य परजीवी और ~ 90 की उपस्थिति को सत्यापित करें.

नोट: कम परजीवी व्यवहार्यता जीन लक्ष्यीकरण दक्षता समाप्त होगा क्योंकि हौसले egressed परजीवियों का अलगाव इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए आवश्यक है.

  1. 25 सेमी 2 फ्लास्क पर प्लग मुहर ढक्कन बंद करके समाधान में व्यवहार्य परजीवी आंदोलन और सख्ती ढक्कन के अंदर या कुप्पी की गर्दन पर तरल splashing बिना विकास सतह के परजीवी को आंदोलन करने के लिए आगे और पीछे कुप्पी हिला .

नोट: परजीवी फसल प्रकार मैं या के लिए एक सिरिंज की सुई रिलीज प्रोटोकॉल की आवश्यकता नहीं हैद्वितीय Δ KU80 उपभेदों लिखें.

  1. एक 3 माइक्रोन झिल्ली युक्त एक फिल्टर धारक से जुड़ी एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के लिए परजीवी समाधान स्थानांतरण और खुले 15 मिलीलीटर पेंच टोपी ट्यूब के शीर्ष पर फिल्टर यूनिट जगह है. सिरिंज 15 मिलीलीटर पेंच टोपी ट्यूब में परजीवी फिल्टर.

नोट: झिल्ली के माध्यम से परजीवी छनन संक्रमित कोशिकाओं और सेलुलर मलबे को हटा.

  1. एक hemocytometer का उपयोग परजीवी एकाग्रता (मिलीग्राम प्रति tachyzoite रूपों) निर्धारित करते हैं.

नोट: वैकल्पिक: परजीवी समाधान का उपयोग करना, एक पट्टिका गठन इकाई (pfu) 7 पढ़ा होगा कि परख 21 की स्थापना - 8 दिन बाद ट्रांसफ़ेक्ट परजीवी की पर्याप्त व्यवहार्यता (pfu ≥ 0.2 के अनुपात tachyzoite के लिए) निर्धारित करने के लिए.

  1. 7 1400 XG पर मिनट और परजीवी गोली परेशान बिना ~ 0.4 मिलीलीटर तैरनेवाला aspirate के लिए गोली परजीवी. 1,40 पर 2 मिनट के लिए स्पिन0 XG और aspirate परजीवी गोली परेशान बिना ~ 0.01 मिलीलीटर तैरनेवाला शेष.
  2. ट्यूब के नीचे flicking द्वारा परजीवी गोली Resuspend और तुरंत 4 के एक परजीवी एकाग्रता प्राप्त करने के लिए परजीवी गोली cytomix 23 बफर (1.33x एकाग्रता) जोड़ - 5 10 x 7 परजीवी / एमएल cytomix.

नोट: इन अतिरिक्त जीन को निशाना बनाने की दक्षता में सुधार नहीं करते हैं क्योंकि cytomix को एटीपी और glutathione के अलावा न आना.

  1. प्रोटोकॉल 1.1 (26 चरण) से linearized pΔGOI के 100 μl विभाज्य पिघलना.
  2. परजीवी cytomix समाधान (~ 1.3-1.6 10 x 7 परजीवी) के 0.3 मिलीलीटर स्थानांतरण प्रोटोकॉल 1.1 (26 चरण), से linearized pΔGOI के 100 μl के लिए और तुरंत एक ठंडा 2 मिमी के अंतर को पूरा 0.4 मिलीलीटर परजीवी + pΔGOI मिश्रण स्थानांतरण electroporation क्युवेट.
  3. 1.4 केवी और 24 Ω पर परजीवी Electroporate.
  4. रेसटी ~ 5 मिनट तो 30 मिलीलीटर संक्रमण माध्यम के साथ मिला हुआ HFF कोशिकाओं से युक्त 150 सेमी 2 फ्लास्क में अभिकर्मक क्युवेट की संपूर्ण सामग्री के हस्तांतरण और रातोंरात संक्रमित संस्कृति सेते के लिए कमरे के तापमान पर अभिकर्मक क्युवेट.
  5. Mycophenolic एसिड में चयन शुरू हो + xanthine (एमपीए + X) का ~ 20 घंटा के साथ संक्रमण मध्यम जगह से बाद अभिकर्मक (2A चित्रा) एमपीए + एक्स चयन मध्यम (एमपीए (25 माइक्रोग्राम / एमएल) और xanthine (50 माइक्रोग्राम / एमएल) में संक्रमण मध्यम).

नोट: + एक्स चयन कुप्पी incubating एमपीए को परेशान मत करो.

  1. नेत्रहीन monolayer के निरीक्षण से एमपीए + एक्स चयन कुप्पी ~ 8 दिन बाद अभिकर्मक में PFUs की कुल संख्या का अनुमान है. प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा संक्रमण के PFUs और स्वस्थ क्षेत्रों के विकास की उपस्थिति को सत्यापित करें.

नोट: सजीले टुकड़े सुबह 8 से दिखाई नहीं कर रहे हैं, संक्रमित के संकेत के लिए चयन और निगरानी बनाए रखने केउत्परिवर्ती उपभेदों के बाद से आयन एक कम प्रतिकृति दर हो सकती है.

नोट: Δ KU80 Δ hxgprt परजीवी उपभेदों काफी गंभीर के साथ उत्परिवर्ती उपभेदों के सफल अलगाव के लिए अनुमति देता है जो अवांछित nontargeted घटनाओं की एक अत्यंत कम पृष्ठभूमि है, लेकिन घातक नहीं वृद्धि दोष. एक जीन आवश्यक है और इसे हटाया नहीं जा सकता है, तो प्राथमिक अभिकर्मक, या बाद में परजीवी जनसंख्या पारित, आबादी लक्षित knockouts को हल के रूप में परजीवी के चयन के दौरान दोहराने के लिए संघर्ष जहां एक phenotype प्रकट हो सकता है.

  1. Monolayer से बाह्य परजीवी बेदखल करने के लिए चरण 3 में के रूप में कुप्पी हिला [दिखाई सजीले टुकड़े विकसित किया है के बाद] एक परजीवी समाधान उत्पन्न करने के लिए. स्थानांतरण ~ से परजीवी समाधान के 0.5 मिलीलीटर एमपीए + एक 25 सेमी 2 से एक्स चयन कुप्पी एमपीए + मिला हुआ HFF कोशिकाओं (इस संस्कृति पास 1 ए नामित) युक्त एक्स चयन कुप्पी.
  2. परजीवी बेदखलमूल 150 सेमी में 2 एमपीए + एक्स चयन ~ 3 दिन बाद फ्लास्क और हस्तांतरण ~ एक दूसरा 25 सेमी 2-0.5 मिलीलीटर परजीवी समाधान एमपीए + मिला हुआ HFF कोशिकाओं (इस संस्कृति पास 1 बी नामित) युक्त एक्स चयन कुप्पी.
  3. संक्रमण के क्षेत्रों के पास 1 ए और / या विकसित ~ 5 दिनों के लिए 1 बी बोतल पारित करने की अनुमति दें. नेत्रहीन पास 1 ए और 1 बी बोतल संक्रमण के स्वस्थ क्षेत्रों के साथ 25 व्यवहार्य PFUs की एक न्यूनतम के होते हैं कि प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा सत्यापित.
  4. 25 सेमी 2 बोतल में एमपीए + एक्स चयन मध्यम में निरंतर पारित होने के लिए पास 1 ए या पास 1 बी कुप्पी या तो चुनें. एमपीए + एक्स चयन के तहत पारित होने बनाए रखें.

नोट: परजीवियों से पहले subcloning को आबादी से nonintegrated बने episomes हटाने के लिए पीढ़ियों के लिए पर्याप्त संख्या के लिए संवर्धित किया जाना चाहिए. प्रकार मैं आरएच Δ KU80 Δ hxgprt, या पहले 25 दिनों के बाद अभिकर्मक करने के लिए पहले 20 दिनों के बाद अभिकर्मक को subcloning प्रदर्शन नहीं करतेप्रकार द्वितीय प्रु Δ KU80 Δ hxgprt परजीवी nonintegrated episomes 1,2 कमजोर करने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति.

  1. एमपीए + एक्स चयन माध्यम के साथ मिला हुआ HFF कोशिकाओं से युक्त एक 96 अच्छी तरह से थाली में Subclone परजीवी. 1 परजीवी / अच्छी तरह से और 2 परजीवी / अच्छी तरह से की एकाग्रता में एक दूसरी ट्रे की एकाग्रता में एक ट्रे की तैयारी.

नोट: हाल ही में (~ 90-25 सेमी 2 फ्लास्क में HFF कोशिकाओं के 95%) lysed है कि Subclone परजीवी परजीवी उच्च व्यवहार्यता है यह सुनिश्चित करने के लिए.

नोट: subcloning के लिए इष्टतम समय सीमा के बाद अभिकर्मक सफलतापूर्वक निशाना बनाया परजीवी चयनित जनसंख्या 1 में एक उच्च आवृत्ति पर उठता है कैसे तेजी से मापने के द्वारा स्थापित किया गया था.

  1. पारित होने के लिए जारी संक्रमण के एक साप्ताहिक मार्ग अनुसूची का उपयोग एमपीए + एक्स चयन मध्यम में ट्रांसफ़ेक्ट परजीवी की प्राथमिक आबादीपरजीवी समाधान के 10 μl के साथ एक 25 सेमी 2 HFF कुप्पी.

नोट: लक्षित जीन विलोपन (knockouts) ले जाने क्लोन कदम 18, resubclone लगातार बनाए रखा आबादी से परजीवी में पहली subcloning से प्राप्त नहीं कर रहे हैं ~ 10 - 12 सप्ताह बाद अभिकर्मक.

नोट: एक जीन विलोपन प्राप्त नहीं है कारणों में से एक कुछ pΔGOI plasmids के episomal दृढ़ता से उत्पन्न होती है. Episomal हठ 5 में निहित दृश्यों और 3 'जीनोमिक लक्षित कर flanks के द्वारा निर्धारित किया जाता है और HXGPRT आनुवंशिक तत्व से उत्पन्न होती प्रतीत नहीं होता है. लगभग 5 - लक्षित कर plasmids के 10% परजीवी जनसंख्या पीढ़ी समय के लिए पर्याप्त संख्या में बने episomes पतला और मुख्य रूप से स्थिर integrants के लिए आबादी को हल करने के लिए अनुमति देने के लिए subcloning के बाद के समय जरूरी है कि महत्वपूर्ण episomal दृढ़ता दिखा रहे हैं.

    कुल 96 अच्छी तरह से ट्रे 6 - पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी में संक्रमण का एक ही क्षेत्र के रूप में पहचान एक भी pfu होते हैं कि कुओं के लिए 8 दिनों के बाद subcloning (प्रकार द्वितीय परजीवी) - 7 दिनों के बाद subcloning (प्रकार मैं परजीवी) या 7 40X या 60X शक्ति या तो. कुएं में pfu का स्थान निर्दिष्ट करने के लिए 96 अच्छी तरह से ट्रे ढक्कन पर एक छोटे डॉट मार्क.
  1. अच्छी तरह से अच्छी तरह से में परजीवी को फैलाने के लिए pfu से अधिक तरल पदार्थ का प्रवाह निर्देशन द्वारा 50 μl (200 μl टिप) में सेट एक पिपेट का उपयोग कर एक ही pfu जिसमें प्रत्येक की सामग्री मिलाएं.

नोट: अच्छी तरह से मिलाकर देखना HFF monolayer के परजीवी सेल accelerates. मैं आरएच उपभेदों अच्छी तरह lyse जाएगा ~ 4 दिनों के मिश्रण के बाद, प्रकार द्वितीय प्रु परजीवी अच्छी तरह lyse जाएगा ~ 5 दिनों के मिश्रण के बाद टाइप करें.

  1. 10 μl विंदुक टिप परजीवी समाधान के लिए एक साथ ड्राइंग अप 6 μl जबकि - एक 0.5 का उपयोग कर इन lysed कुओं में से प्रत्येक के नीचे भर में एक कुएं (क्लोन) lysed दर्जन और खरोंच का चयन करें. ट्रांस1 मिलीलीटर एमपीए + एक्स चयन मध्यम में मिला हुआ HFF कोशिकाओं से युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली में एक अच्छी तरह से करने के लिए परजीवी समाधान के 6 μl fer.

नोट: यह उद्घाटन अच्छी तरह से नीचे रहने वाले परजीवी के साथ लगातार संपर्क में पिपेट टिप के बोर रखने के लिए अच्छी तरह से नीचे खरोंच करने के लिए आवश्यक है.

  1. HFF कोशिकाओं के सेल के लिए 24 अच्छी तरह से ट्रे मॉनिटर.

नोट: मैं आरएच परजीवी आमतौर पर ~ 4 दिनों में 24 अच्छी तरह प्रारूप में अच्छी तरह से lyse जाएगा टाइप करें. प्रकार द्वितीय प्रु परजीवी आमतौर पर ~ 5 दिनों में अच्छी तरह से lyse जाएगा.

  1. + एक्स चयन मध्यम प्रति अच्छी तरह से मिला हुआ HFF कोशिकाओं और 1 मिलीलीटर एमपीए युक्त एक नया 24 अच्छी तरह से ट्रे की इसी अच्छी तरह से करने के लिए 24 अच्छी तरह प्रारूप में प्रत्येक कुएं के तल से खरोंच व्यवहार्य परजीवी समाधान के 2 μl स्थानांतरण.

नोट: सभी परजीवी क्लोन और लाइनों लगातार मुख्य किया जा सकता हैइस 24 अच्छी तरह से ट्रे प्रारूप में हर 7 दिनों व्यवहार्य परजीवी समाधान के 2 μl गुजर द्वारा tained.

  1. सत्यापित करें कि परजीवी सफलतापूर्वक नेत्रहीन प्रकाश माइक्रोस्कोपी ~ 18 घंटे के बाद बीतने के साथ निरीक्षण के द्वारा एक नया 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए स्थानांतरित कर दिया गया.
  2. या तो एक 1 मिलीग्राम या 10 मिलीलीटर विंदुक और एक Eppendorf ट्यूब परजीवी समाधान हस्तांतरण का उपयोग कर 24 - कदम 23 से 24 अच्छी तरह से थाली के lysed कुओं से हार्वेस्ट परजीवी.
  3. गोली 7 मिनट के लिए, एक बार 1 मिलीलीटर फॉस्फेट में कुल्ला 1400 x जी पर परजीवी 3 मिनट के लिए 1400 x जी पर फिर से खारा (पीबीएस), और गोली बफर.
  4. गोली से aspirate पीबीएस, तो परजीवी resuspend को गोली पीबीएस के 200 μl जोड़ें. डीएनए अलगाव तक -80 में परजीवी समाधान डिग्री सेल्सियस रुक.
  5. एक ऊतक डीएनए अलगाव minikit का उपयोग कर एक क्लोन से परजीवी डीएनए अलग.
  6. सत्यापन प्राइमरों (आंकड़े 2A सी) का उपयोग करते हुए पीसीआर द्वारा लक्षित जीन विलोपन (पीटा) का सत्यापन करें. के लिए टेस्टब्याज की जीन के कार्यात्मक कोडन क्षेत्र की अनुपस्थिति और अपस्ट्रीम CXF और नीचे की ओर CXR जीनोमिक डीएनए प्राइमरों प्रदर्शित करने के लिए जीनोमिक लक्षित कर flanks और HXGPRT कि अवधि पीसीआर उत्पादों की उपस्थिति के लिए (आंकड़े 2A बी) परीक्षण सही 5 'और 3 का उपयोग 'हटाया जीन लोकस में HXGPRT जीन के एकीकरण को निशाना बनाया.

नोट: सत्यापन के लिए प्राइमर प्राप्त किया जा सकता है ब्याज या एक झूठी सकारात्मक परिणाम की जीन को अद्वितीय होना चाहिए. प्राइमर डिजाइन पर मान्य किया जा सकता http://www.toxodb.org प्राइमरों अद्वितीय हैं सत्यापित करने के लिए जीनोम (ओं) के लिए प्राइमर दृश्यों को नष्ट करना है.

  1. एक साप्ताहिक कार्यक्रम पर पारित परजीवी क्लोन के रूप में 24 में वर्णित है. लक्षित हटाए जाने की पुष्टि हो जाने के बाद, एमपीए + एक्स में जारी चयन वैकल्पिक है.
  2. फ्रीजर शेयरों की तैयारी द्वारा पुरालेख परजीवी क्लोन. गोली बाह्य परजीवीएक 25 सेमी 2 संस्कृति फ्लास्क में lysed HFF कोशिकाओं से, एक परजीवी एकाग्रता में सेल संस्कृति ठंड माध्यम से मीडिया को दूर करने और धीरे resuspend के परजीवी गोली> 4 एक्स 10 मिलीलीटर प्रति 7 परजीवी. तरल नाइट्रोजन में अनिश्चित काल के cryovials और दुकान परजीवी को aliquots के हस्तांतरण, या -80 डिग्री सेल्सियस

2. HXGPRT का विलोपन

इस प्रोटोकॉल एक आनुवंशिक चालाकी Δ KU80 तनाव के जीनोम में अपने एकीकरण साइट से HXGPRT मार्कर को दूर करने के लिए बनाया गया है. HXGPRT का हटाया मार्कर वसूली और HXGPRT 1-3 के आधार पर ही चयन के प्रयोग से कई आनुवंशिक जोड़तोड़ के साथ उपभेदों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है. नीचे विस्तृत प्रोटोकॉल फिर से लक्ष्य एक ठिकाना HXGPRT को नष्ट करने के लिए विधि का वर्णन है, यह ब्याज की जीन ठिकाना पर HXGPRT को हटाने की भी जंगली प्रकार के जीन (ग का पुनः एकीकरण एक साथ परमिट दिया जाना चाहिए किomplementation), आनुवंशिक जोड़तोड़ की एक किस्म के लिए अनुमति देता है एक उत्परिवर्ती जीन का पुनः एकीकरण, साथ ही एक टैग जीन (एन या सी टर्मिनल GFP, हा टैग, आदि) का फिर से एकीकरण,. कार्रवाई 24 के तंत्र और 6 thioxanthine चयनों का उपयोग कर प्रोटोकॉल को लक्षित पहले 1-3,15 वर्णित किया गया है.

2.1 हटाएं HXGPRT

  1. HXGPRT (चित्रा 1 बी) flanking अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम स्थलों पर कटौती करने के लिए RE.Z साथ पचा द्वारा pΔGOI से आबकारी HXGPRT चयन मार्कर.
  2. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा डीएनए की पूरी पाचन सत्यापित करें. Agarose जेल से दो बैंड का बड़ा अलग.

नोट: दो बैंड का बड़ा 5 और 3 'डीएनए लक्ष्य flanks, लेकिन नहीं HXGPRT जीन के साथ प्लाज्मिड शामिल हैं.

  1. एक स्पिन स्तंभ layin में बड़ा डीएनए बैंड युक्त agarose अनुभाग रखेंजी झिल्ली पर जेल फ्लैट. आरटी पर 4 मिनट के लिए 13,000 एक्स जी पर स्तंभ स्पिन. 100 μl के लिए मात्रा लाने के लिए प्रवाह के माध्यम से करने के लिए बाँझ एच 2 हे जोड़ें.

नोट: अन्य वाणिज्यिक तरीकों agarose से डीएनए को अलग करने के लिए उपलब्ध हैं.

  1. 18 μl बाँझ एच 2 ओ के अंतिम मात्रा में डीएनए resuspending, EtOH के तेज़ी से डीएनए ध्यान लगाओ
  2. 7 मिलीलीटर एच 2 ओ, 1 μl 10x बंधाव बफर और 1 μl टी -4 डीएनए ligase (5 यूनिट) के साथ केंद्रित डीएनए की 1 μl मिक्स और 4 पर प्रतिक्रिया जगह डिग्री सेल्सियस pΔGOIc (pΔGOIclean) (चित्रा 3) उत्पन्न करने के लिए रात भर.

नोट: RE.Z वाले डीएनए के साथ समाप्त होता डीएनए टुकड़े के साथ ही लक्षित के रूप में एक उत्परिवर्ती जीन का पुनः एकीकरण लक्षित जंगली प्रकार के जीन (पूरक) का फिर से एकीकरण लक्षित के लिए उपयुक्त प्लास्मिड बनाने के लिए इस कदम पर बनाया गया है और शामिल किया जा सकता है एक टैग जीन का पुनः एकीकरण(एन या सी टर्मिनल GFP, हा टैग, आदि).

  1. पहले electroporation के लिए बाँझ एच 2 ओ के साथ प्रतिक्रिया 2x पतला.
  2. ई. में pΔGOIc रूपांतरण प्रोटोकॉल 1.1 में के रूप में कोली, subclone अलग, और लक्ष्य प्लाज्मिड मान्य करने के लिए. तब (1.1.26 के लिए कदम 1.1.11 देखें) अभिकर्मक के लिए तैयार करने में pΔGOIc linearize.
  3. के रूप में प्रोटोकॉल 1.2 (चरण 1 से 11) में उल्लिखित परजीवी अभिकर्मक प्रोटोकॉल दोहराएँ.

नोट: पहले 8 से 1 चरणों का आयोजन करने, HXGPRT की कि लक्षित हटाने की पुष्टि उत्परिवर्ती तनाव में संभव है. 6 thioxanthine (6TX) चयन मध्यम (200 माइक्रोग्राम / एमएल संक्रमण मध्यम में 6TX) और एक pfu परख में कुप्पी जगह का उपयोग कर उत्परिवर्ती तनाव के 1 एक्स 10 6 tachyzoites साथ मिला हुआ HFF कोशिकाओं की एक 150 सेमी 2 फ्लास्क संक्रमित. नहीं (या बहुत कम, <10) को सत्यापित करें कि 8 दिन बाद कुप्पी निरीक्षण की स्थापना के लिए आवश्यक है जो pfu दिखाई दे रहे हैं, कि potential जीन दक्षता को लक्षित कम HXGPRT अभिव्यक्ति (एक 6TX प्रतिरोध फेनोटाइप) के साथ एक phenotype के लिए उत्परिवर्ती तनाव के किसी भी संभावित सहज प्रत्यावर्तन से अधिक होगा.

नोट: लगभग 5 - HXGPRT एकीकरण साइटों का 10% HXGPRT मार्कर अभी भी लक्षित साइट (विवरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें) पर एकीकृत है, भले ही 6TX प्रतिरोध का एक महत्वपूर्ण और सहज आवृत्ति दिखा रहे हैं.

  1. 6TX चयन मध्यम से 150 सेमी 2 फ्लास्क में मध्यम बदलकर 6TX चयन ~ 20 घंटे बाद अभिकर्मक शुरू करो.

नोट: ~ 10 दिनों के बाद अभिकर्मक के लिए कुप्पी को परेशान मत करो.

  1. 12 के बाद अभिकर्मक (प्रकार मैं परजीवी) या दिन 10 - 16 - बाद अभिकर्मक (प्रकार द्वितीय परजीवी) सुबह 10 बजे pfu गठन के लिए कुप्पी का निरीक्षण किया.

नोट: ParasiHXGPRT का विलोपन के लिए निशाना बनाया जा रहा tes HXGPRT जीन और mRNA नष्ट कर दिया है जब तक 6TX चयन के तहत विकसित करने के लिए शुरू हो जाएगा, और अवशिष्ट HXGPRT प्रोटीन निष्क्रिय है.

  1. मिला हुआ HFF कोशिकाओं और 5 मिलीलीटर 6TX चयन मध्यम युक्त एक नया 25 सेमी 2 फ्लास्क परजीवी समाधान के 1.0 मिलीलीटर - एक परजीवी समाधान, और हस्तांतरण 0.5 बनाने के लिए चयन फ्लास्क हिलाएँ. दो और दिनों के लिए एक दिन में एक बार नए 25 सेमी 2 बोतल के लिए प्राथमिक 150 सेमी 2 से हस्तांतरण दोहराएँ.

नोट: एकाधिक नमूने HXGPRT जीन खो दिया है कि व्यवहार्य लक्षित परजीवियों पर कब्जा करने की संभावना बढ़ जाती है.

  1. स्वस्थ नकल परजीवी के क्षेत्रों के साथ PFUs के विकास की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए 2 बोतल ~ 5 दिनों के संक्रमण के बाद 25 सेमी का निरीक्षण किया. संक्रमण के क्षेत्रों से युक्त एक या दो बोतल उठाओ.

ध्यान दें: HXGPRT जीन को दोहराने से नष्ट कर दिया.

  1. 6TX चयन माध्यम में पारित होने के परजीवी के लिए आगे बढ़ें.
  2. चयन के 30 दिन - 25 के बाद परजीवी आबादी Subclone. ~ 1 परजीवी / अच्छी तरह से और अच्छी तरह / 2 ~ परजीवी के साथ दूसरे के साथ एक 96 अच्छी तरह से ट्रे सेट करें.
  3. पृथक क्लोन से परजीवी डीएनए तैयार है और (कदम 19-29) प्रोटोकॉल 1.2 के अनुसार एक 24 अच्छी तरह प्रारूप संस्कृति में क्लोन बनाए रखें.
  4. आंकड़े 3A बी में उल्लिखित रणनीति का उपयोग करते हुए पीसीआर द्वारा HXGPRT का विलोपन मान्य करें.

3. प्रोटीन की सी टर्मिनल टैगिंग

इस प्रोटोकॉल एमपीए का उपयोग कर जीन की जीनोमिक ठिकाना पर मुताबिक़ पुनर्संयोजन खत्म डबल क्रॉस के माध्यम से एकीकरण के लिए टैग को लक्षित करके प्रोटीन की सी टर्मिनल टैगिंग के लिए डिज़ाइन किया गया है + एक्स चयन 2,4. इस प्रोटोकॉल कुशलता से काम करता है की वजह से 5 'dhfr अनुक्रम 2,4 के लिए एक पूरी तरह से पुष्टि कार्यात्मक 3 'untranslated क्षेत्र है.

अंतर्जात आनुवंशिक loci में प्रोटीन के 3.1 सीधी सी टर्मिनल टैगिंग

  1. बनाएँ pΔGOItag को लक्षित प्लाज्मिड खमीर recombinational क्लोनिंग (चित्रा 4) और प्रोटोकॉल 1.1 में वर्णित तरीकों का उपयोग निर्माण. चुनाव के टैग (हा टैग, Myc टैग, उनके टैग के लिए 5 'समाप्ति कोडोन एक 3 स्थिति को ले जाया जाता है सिवाय जीनोमिक को लक्षित ओर, भारत सरकार की कोडिंग क्षेत्र के पिछले 800 से 1,200 बीपी (या जीनोमिक डीएनए) शामिल' , आदि)
  2. (चित्रा 4) उल्लिखित रणनीति का उपयोग प्रोटोकॉल 1.1 और 1.2 में चरणों का पालन करके प्रोटीन कोडिंग जीन की अंतर्जात ठिकाना पर सी टर्मिनल टैग की लक्षित प्रविष्टि बनाएँ.
  3. एक पीसीआर रणनीति का प्रयोग अंतर्जात जीन ठिकाना पर सी टर्मिनल टैग की प्रविष्टि की जाँच करें.
  4. घ के लिए प्रोटोकॉल 1 और 2 प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों का उपयोग कर retarget जीन ठिकानाएक टैग प्रोटीन व्यक्त करता है कि एक ठीक विनियमित अंतर्जात जीन ठिकाना बनाने के लिए HXGPRT चयन मार्कर हटाएँ. इस प्रोटोकॉल भी निशान लगाया हुआ तनाव (प्रोटोकॉल 1 देखें) में एक और ठिकाना लक्षित करने के लिए फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है कि HXGPRT चयन मार्कर ठीक हो जाए.

Representative Results

एक विस्तृत खाका प्रतिबंधों एंजाइम साइटों की नियुक्ति और एक में HXGPRT के बाद हटाने के लिए आनुवंशिक को लक्षित और जीन की मान्यता को लक्षित है, साथ ही प्लाज्मिड निर्माण की सुविधा है कि प्राइमरों की पीढ़ी सहित, एक जीन को हटाने के लिए एक लक्षित कर प्लाज्मिड के निर्माण के लिए प्रदान की जाती है एकल कदम प्रक्रिया (आंकड़े 1 ए, सी, चित्रा 2A, चित्रा 3). एक सामान्य योजनाबद्ध उदाहरण के लिए, एक लक्षित जीन विलोपन (2A चित्रा), एक पीटा के हटाए जाने को मान्य किया प्राइमर जोड़े बनाने के लिए प्रस्तुत किया है, प्रकार मैं rop18 (चित्रा 2 बी), और पीसीआर सत्यापन के प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं (चित्रा 2 सी). इस प्रतिनिधि परिणाम लक्ष्य को अपेक्षाकृत मुश्किल हो जाता है कि आनुवंशिक loci में प्राप्त किया जा सकता है कि परिणाम की सीमा को वर्णन करने के लिए दिखाया गया है. एक सफलतापूर्वक लक्षित जीन विलोपन में की जीन के अभाव में परिणाम होगाब्याज पीसीआर उत्पाद (पीसीआर 1), 3 की उपस्थिति 'जीनोमिक लक्षित कर पार्श्व (PCR2), और ठीक से 5 के बीच एकीकृत HXGPRT चयन मार्कर की उपस्थिति' और (PCR3 और PCR4) हटाए जाने को परिभाषित है कि 3 'जीनोमिक लक्षित कर फ्लैंकों . क्लोन 3, 4, 5, 6, 8, 9, और 11 HXGPRT भारत सरकार (चित्रा -2) की जगह है जहां लक्षित जीन विलोपन (knockouts) मान्य हैं.

एक जीन विलोपन शामिल नहीं है कि एक क्लोन बैंडिंग पैटर्न के एक किस्म का प्रतिनिधित्व किया जा सकता है. आमतौर पर, एक जीन विलोपन के बिना एक क्लोन PCR1 और PCR2 के लिए मनाया बैंड के साथ माता पिता का तनाव (पैतृक पैटर्न) दर्पण, लेकिन नहीं क्लोन 1 और 2 (चित्रा -2) के रूप में देखा PCR3 या PCR4 के लिए. जाएगा यह "माता पिता का पैटर्न" कुछ संभावित तंत्र से उत्पन्न होती है. कभी कभी, एमपीए प्रतिरोधी चयनित परजीवी प्लाज्मिड को लक्षित pΔGOI की nonintegrated बने episomes ले, और हम निरंतर चयन अक्सर इन episomes कि सेना ध्यान देंएकीकृत करने के लिए. हम भी मैं Δ pΔGOI के अनपेक्षित एकीकरण के कारण KU80 तनाव DHFR 5 'और 3' प्रमोटर तत्वों, DHFR ठिकाना या तो में या आंशिक रूप से नष्ट कर दिया HXGPRT में के माध्यम से व्यक्त की एक HXGPRT सीडीएनए होता है, जो प्लाज्मिड को लक्षित प्रकार में कुछ दुर्लभ पृष्ठभूमि का निरीक्षण लोकस 14. इस दुर्लभ घटना एक लक्षित एकीकरण है, यह इरादा एकीकरण नहीं था और किसी भी जीन प्रतिस्थापन रणनीति डिजाइन करने में याद करने के लिए एक प्रमुख बिंदु के रूप में कार्य करता है. लक्ष्य को pΔGOI पर किए गए 120 बीपी से अधिक डीएनए अनुरूपता प्लाज्मिड किसी अवांछित पृष्ठभूमि वापस दे सकता है कि Δ KU80 उपभेदों 2 में पुनर्संयोजन के लिए एक वैकल्पिक स्थल उपलब्ध करा सकता है. HXGPRT चयन मार्कर प्रकार द्वितीय प्रकार के डीएनए से तुलना की जाए तो nucleotide बहुरूपताओं है कि मैं दृश्यों पर आधारित है क्योंकि प्रकार द्वितीय प्रु Δ KU80 तनाव में इस पृष्ठभूमि कम या नगण्य मैं टाइप करने के लिए तुलना में है जोबहुत प्रकार द्वितीय प्रु Δ KU80 तनाव 1 का उपयोग कर प्रयोगों में इस दुर्लभ पृष्ठभूमि कम कर देता है. एक जीन ठिकाना (नष्ट नहीं किया जा सकता है) आवश्यक है, या ठिकाना पर आवृत्ति को लक्षित कर, या एक अत्यंत कम जीन है, तो अगर episomes आसानी से वृद्धि और चयन के माध्यम से समाप्त नहीं कर रहे हैं [nonintegrated], यह माता पिता का पैटर्न एमपीए में मनाया पैटर्न पर हावी होगा बने प्रतिरोधी क्लोन. वैकल्पिक रूप से, को लक्षित डीएनए अणु कभी कभी केवल 5 'या 3' जीनोमिक लक्षित कर पार्श्व और एक बैंड (लेकिन दोनों नहीं) क्लोन 10 के रूप में देखा PCR1 और PCR2 के साथ (5 PCR3 या PCR4 या तो के लिए मनाया जाता है में एकीकृत करने के लिए मनाया जाता है 'एकीकरण) और क्लोन 7 (3' एकीकरण) (चित्रा -2). इन नमूनों HXGPRT एकीकृत करता है लेकिन यह लक्षित एकीकरण ब्याज की जीन को नष्ट नहीं करता है कि लोकस पर निशाना प्लाज्मिड के एकीकरण पर एक भी पार की विरल घटना का सुझाव देते हैं. यह पैटर्न (गलियों 7 और चित्रा -2 में 10) उन्हेंकि लक्षित एकीकरण के बजाय हुआ सत्यापित करने के लिए पीसीआर डेटा रिपोर्ट करने की जरूरत है phasizes एक भी मुताबिक़ पार और लक्ष्य अणु के एक nonhomologous दूसरी एकीकरण. शायद ही कभी, हम एक माता पिता का पैटर्न और एक लक्षित विलोपन पैटर्न दोनों का प्रतिनिधित्व करता है कि क्लोन 12 (चित्रा -2) द्वारा प्रतिनिधित्व एक आनुवंशिक मिश्रण का निरीक्षण. यह पद्धति सबसे अधिक संभावना अच्छी तरह से एक क्लोनिंग में एक ही स्थान पर मौजूद हैं कि दो परजीवी जीनोटाइप से इस अवसर पर उठता है.

Δ ku80Δgoi से HXGPRT को हटाने के लिए एक सामान्य योजनाबद्ध :: HXGPRT तनाव से HXGPRT हटाने के लिए (चित्रा 3) दिखाया गया है. क्लोन 4, 7, 9, 11 और 12 (चित्रा -3 सी) के रूप में देखा Δ KU80 Δ gra2 :: HXGPRT (3B चित्रा) से HXGPRT को हटाने को मान्य किया प्राइमर जोड़ी PCR5 में एक अद्वितीय ~ 1.2 KBP बैंड amplifies. HXGPRT ठिकाना, एक ~ 3 से हटा नहीं है.4 KBP बैंड (क्लोन 1, 2, 3, 6, 8, 10, और माता पिता का नियंत्रण) मनाया जाता है. कई तंत्र HXGPRT को हटाने (6TX चयन) और अधिक चुनौतीपूर्ण और HXGPRT का एकीकरण (एमपीए + एक्स चयन) की तुलना में कम कुशल बनाने के लिए काम करते हैं. एमपीए चयन 6TX चयन 14,16 से अधिक आसानी से और अधिक कुशल है. इसके अलावा, HXGPRT अभिव्यक्ति के उच्च स्तर एमपीए सेलेक्शन 16,24 के लिए से 6TX चयन के लिए आवश्यक हैं. नतीजतन, HXGPRT एंजाइम गतिविधि या म्यूटेशन या एक जीन का ठिकाना पर HXGPRT की अभिव्यक्ति के स्तर को कम करने कि epigenetic परिवर्तन को कम कर सकते म्यूटेशनों कि संभवतः 6TX चयन के प्रभाव को समाप्त कर सकते हैं. यहां तक कि 6TX चयन के लिए इन चुनौतियों के साथ, Δ KU80 उपभेदों में 6TX चयन की सफलता की दर 1-3 पहला प्रयास पर 90% से अधिक है.

प्रोटीन जीन कोडिंग की सीधी सी टर्मिनल टैगिंग के लिए एक सामान्य योजना (चित्रा 4) दिखाया गया है. यहयोजना निशान लगाया जीन की HXGPRT 3 'के मुताबिक़ पुनर्संयोजन खत्म डबल क्रॉस के माध्यम से प्रत्यक्ष एकीकरण का उपयोग करता है और भी ऊपर वर्णित के समान मान्यता रणनीतियों को रोजगार. एक जीन इस प्लाज्मिड एक स्वतंत्र रूप से अलग लक्ष्यीकरण डीएनए के साथ एक दूसरे अभिकर्मक का उपयोग करते हुए सत्यापित किया जा सकता है एक आवश्यक जीन होने का संदेह होता है. इस तरह विनियमित जीन की अभिव्यक्ति के लिए योजनाओं के रूप में वैकल्पिक तरीकों, एक जीन 25 आवश्यक है तो आगे की पुष्टि करने के लिए उपलब्ध हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्लाज्मिड एक लक्षित कर डीएनए की डिजाइन का अवलोकन. डिजाइनिंग के लिए एक. योजनाबद्ध पीसीआर pRS416 शटल वेक्टर और HXGPRT minigene कैसेट के लिए 33 बीपी overlaps के साथ 5 और 3 'लक्ष्य फ्लैंकों बढ़ाना इस्तेमाल प्राइमरों ओवरलैप. ढांच के रूप में दर्शाया प्राइमर थे5 और 3 'pΔROP18 10 के लक्ष्य फ्लैंकों. एक को लक्षित डीएनए अणु को डिजाइन करने के लिए बी समग्र रणनीति उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया. pΔGOI की रीढ़ pRS416 शटल वेक्टर युक्त uracil (URA) और एम्पीसिलीन (एएमपी) चयन मार्कर है. एक ~ 1 KBP 5 pRS416 में डाला 'एफ 1 और R1 प्राइमरों का उपयोग HXGPRT minigene कैसेट और pRS416 लिए overlaps के साथ जीनोमिक डीएनए से परिलक्षित डीएनए लक्ष्य दिशा, एक ~ 1 KBP 3' डीएनए लक्ष्य पार्श्व के लिए overlaps के साथ जीनोमिक डीएनए से परिलक्षित होता है HXGPRT minigene कैसेट और F2 और R2 प्राइमरों और HXGPRT minigene कैसेट का उपयोग कर pRS416. निम्नलिखित अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम पचाने साइटों प्राइमरों के लिए जोड़ रहे हैं: एफ 1 प्राइमर में RE.X (प्रतिबंध एंजाइम एक्स कटौती साइट) R2 में RE.Y, डीएनए लक्ष्य पार्श्व 5 '5 का अंत' पर प्लाज्मिड कटौती करने के लिए आबकारी HXGPRT मिनट के लिए आर 1 और F2 प्राइमरों में डीएनए लक्ष्य पार्श्व और RE.Z 3 '3 का अंत' पर प्लाज्मिड कटौती करने के लिए प्राइमरrop18 का विलोपन के लिए लक्षित कर निर्माण उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया igene कैसेट. सी. प्राइमर दृश्यों. बोल्ड क्षेत्रों टी. के अनुरूप gondii जीनोमिक अनुक्रम, और nonbold क्षेत्रों pRS416 और HXGPRT minigene कैसेट के साथ ओवरलैप कि प्रतिबंध एंजाइम साइटों और दृश्यों के अनुरूप हैं. HX_F और HX_R प्राइमर जोड़ी HXGPRT minigene कैसेट 14 amplifies. प्राइमर 5 से '3 से' पढ़ा. Fentress एट अल 10 से अनुकूलित टेबल. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. HXGPRT का उपयोग कर एक जीन का विलोपन के लिए प्रोटोकॉल का अवलोकन. ए. Disruption एक डबल विदेशी द्वारा Δ ku80Δhxgprt तनाव में एक भारत सरकार के एक ~ 1 KBP 5 'डीएनए लक्ष्य पार्श्व और एक ~ 1 KBP 3' प्लाज्मिड pΔGOI पर डीएनए लक्ष्य पार्श्व उपयोग कर मुताबिक़ पुनर्संयोजन घटना की. एक पीसीआर PCR1 उपयोग कर रणनीति, PCR2, PCR3, और PCR4 (नहीं पैमाने पर करने के लिए) भारत सरकार लोकस के लक्षित HXGPRT के एकीकरण और विलोपन के साथ क्लोन को मान्य करने के जीनोटाइप सत्यापन सक्षम बनाता है कि दिखाया गया है. बी प्रतिनिधि प्राइमर जोड़े rop18 का विलोपन मान्य बनाया गया . ROP18_DF और ROP18_DR PCR1, ROP18_ExF और ROP18_CxR PCR2, ROP18_CxF और DHFR_CxR PCR4 (2A चित्रा देखें) बढ़ाना PCR3 और DHFR_CxF और ROP18_CxR बढ़ाना बढ़ाना बढ़ाना. प्राइमर 5 से '3 से' पढ़ा. टेबल Fentress एट अल से HXGPRT का उपयोग कर एक लक्षित जीन विलोपन (rop18) की मान्यता के 10. सी. प्रतिनिधि परिणाम अनुकूलित. एमपीए में Δ ku80Δhxgprt और चयन में प्लाज्मिड pΔROP18 के बाद अभिकर्मक +एक्स, एमपीए + एक्स प्रतिरोधी क्लोन rop18 का विलोपन के लिए assayed थे. माता पिता का तनाव नियंत्रण पीसीआर 3 (~ 1,200 बीपी) और पीसीआर के लिए पीसीआर 1 (~ 400 बीपी) और पीसीआर 2 (~ 650 बीपी) उत्पाद के लिए सकारात्मक और नकारात्मक 4 (~ 1300 बीपी) उत्पाद. एक लक्षित भारत सरकार पीटकर PCR2, PCR3 और PCR4 उत्पादों के लिए सकारात्मक है और (2A चित्रा देखें) पीसीआर 1 उत्पाद के लिए नकारात्मक है. दिखाया PCR1 और PCR2 (शीर्ष पैनल) के परिणामों के प्रतिनिधि पैनलों, PCR3 (मध्यम पैनल), और PCR4 (नीचे पैनल) हैं. क्लोन 3, 4, 5, 6, 8, 9 और 11 क्लोन में एक लक्षित जीन विलोपन घटना को परिभाषित करता है कि पीसीआर 1, PCR2, PCR3 और PCR4 की सही बैंडिंग पैटर्न दिखा रहे हैं. क्लोन 1, 2, 7, 10 और 12 जीन विलोपन नहीं कर रहे हैं, और अन्य संभावित प्रतिनिधि परिणामों के अनुरूप हैं. (सी = माता पिता का नियंत्रण तनाव Δ ku80Δhxgprt, एम = आकार मार्कर). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. ब्याज की जीन HXGPRT नष्ट करने के लिए फिर से लक्षित करने के लिए प्रोटोकॉल का अवलोकन. एक डबल विदेशी द्वारा HXGPRT चयन मार्कर को हटाने तनाव Δ ku80Δgoi में मुताबिक़ पुनर्संयोजन घटना :: HXGPRT एक ~ 1 KBP 5 'डीएनए लक्ष्य पार्श्व और एक ~ 1 KBP 3' प्लाज्मिड pΔGOIc पर डीएनए लक्ष्य पार्श्व का उपयोग करने के लिए ए रणनीति. जीनोटाइप के सत्यापन के लिए पीसीआर रणनीति (नहीं पैमाने पर करने के लिए) हटाए जाने तक फैला है कि एक पीसीआर उत्पाद (PCR5) के लिए परख के लिए एक प्राइमर जोड़ी का उपयोग करते हुए दिखाया गया है. बी gra2 से HXGPRT चयन मार्कर को हटाने मान्य बनाया गया एक प्रतिनिधि प्राइमर जोड़ी तनाव Δ ku80Δgra2 में ठिकाना :: HXGPRT. प्राइमर GRA2 _CLF और GRA2_CxR PCR5 बढ़ाना. प्राइमर 5 से 6TX में Δ ku80Δgoi :: HXGPRT और चयन में प्लाज्मिड pΔGOIc के निम्नलिखित अभिकर्मक प्राप्त किया जा सकता है कि 6TX प्रतिरोधी क्लोन की. सी. प्रतिनिधि पैनल 3 'के लिए' पढ़ा. क्लोन 4, 7, 9, 11 और 12 HXGPRT मार्कर के लक्षित विलोपन (~ 1.2 KBP उत्पाद है कि पार्श्व 5 'के साथ मामूली ओवरलैप के साथ दिशा' और 3 'के बाहर 3 spans से मेल खाती है PCR5 की सही बैंडिंग पैटर्न प्रदर्शन पार्श्व). क्लोन 1, 2, 3, 6, 8, और 10 (इस बैंड प्रकाश है) इन क्लोन अनुमति दी है कि 6TX के लिए प्रतिरोध की एक डिग्री का प्रदर्शन किया है, भले ही माता पिता का क्लोन जीनोटाइप से मेल खाती है कि 3.4 KBP ~ आसपास की उम्मीद बैंडिंग पैटर्न का प्रतिनिधित्व उनके चयन (इस phenotype कभी कभी (प्रोटोकॉल 2.1 (चरण 8) में ध्यान दें और प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें) शट डाउन HXGPRT अभिव्यक्ति के द्वारा अनायास पैदा कर सकते हैं. (सी = माता पिता का नियंत्रण तनाव Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, एम = आकार मार्कर).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
4 चित्रा. एक प्रोटीन के सी टर्मिनल अंत टैग करने के लिए एक लक्ष्य डीएनए अणु के डिजाइन. रणनीति भी एक 3 'अनुप्रवाह नियामक क्षेत्र के रूप में कार्य करने के लिए HXGPRT मार्कर की क्षमता पर आधारित है. pΔGOItag की रीढ़ pRS416 शटल वेक्टर युक्त uracil (URA) और एम्पीसिलीन (एएमपी) चयन मार्कर है. डीएनए लक्ष्य पार्श्व के लिए overlaps के साथ जीनोमिक डीएनए से परिलक्षित होता है एक ~ 1 KBP 5 'Fgoi और Rtag प्राइमरों, एक ~ 1 KBP 3 का उपयोग HXGPRT minigene कैसेट और pRS416 लिए overlaps के साथ जीनोमिक डीएनए से परिलक्षित डीएनए लक्ष्य दिशा' है pRS416 में डाला F2 और R2 का उपयोग HXGPRT minigene कैसेट और pRS416प्राइमरों और HXGPRT minigene कैसेट. 5 'डीएनए लक्ष्य दिशा एक प्रतिस्थापन समाप्ति कोडोन द्वारा पीछा टैग (हा, Myc, उसका, आदि) के साथ समापन कोडोन जगह. एमपीए + एक्स चयन सी टर्मिनल टैग और एक बहाव HXGPRT एकीकृत करता है, और HXGPRT मार्कर के बाद एक पद के लिए 3 'UTR चलता है. निम्नलिखित अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम पचाने साइटों प्राइमरों के लिए जोड़ रहे हैं: Fgoi प्राइमर में RE.X (प्रतिबंध एंजाइम एक्स कटौती साइट) डीएनए लक्ष्य पार्श्व 5 '5 का अंत' पर प्लाज्मिड कटौती, और RE.Y में करने के लिए प्लाज्मिड निर्माण के लिए उपयोग करने के लिए फिर से लक्ष्य निशान लगाया जीन ठिकाना नष्ट करने के लिए HXGPRT minigene कैसेट आबकारी करने Rtag और F2 प्राइमरों में डीएनए लक्ष्य पार्श्व 3 '3 का अंत' पर प्लाज्मिड, और RE.Z कटौती करने के लिए आर 2 प्राइमर 3 'UTR की नियुक्ति को बहाल करेंगे जो HXGPRT मार्कर.

Discussion

यहाँ हम लक्षित जीन विलोपन, जीन प्रतिस्थापन, और / या टैग किए गए जीन के अधिकारी है कि आनुवंशिक रूप से चालाकी से संतान के कुशल वसूली को सक्षम करने Δ KU80 परजीवी उपभेदों में लक्षित कुशल जीन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इन तरीकों में से अनुक्रमिक निष्पादन 1-3 एकल या एकाधिक लक्षित आनुवंशिक जोड़तोड़ होते हैं कि परजीवी म्यूटेंट के अलगाव के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है. एक लक्षित हटाए जाने की पीढ़ी के कई कारकों पर निर्भर करता है, प्रस्तुत रणनीति और प्रोटोकॉल के साथ Δ KU80 तनाव का उपयोग बहुत टी. की ठीक से परिभाषित उत्परिवर्ती उपभेदों बनाने की दक्षता और आराम बढ़ जाती है कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन के लिए gondii.

टी. के जीनोम अलैंगिक चरणों के दौरान gondii अगुणित है. इस प्रकार एक जीन को हटाने के लिए योजना बनाते समय बनाने के लिए एक विचार जीन इन विट्रो में आवश्यक नहीं होना चाहिए. बहरहाल, targe की दक्षताΔ KU80 उपभेदों में टिंग जीन knockouts के अत्यंत उच्च है, और यह काफी बिगड़ा हुआ प्रतिकृति दरों के साथ उत्परिवर्ती उपभेदों के अलगाव के लिए सक्षम बनाता है. एक लक्षित जीन आवश्यक है, परजीवी अक्सर चयन के दौरान दोहराने के लिए संघर्ष. लक्षित आनुवंशिक हेरफेर में एक अन्य महत्वपूर्ण कारक जीनोमिक को लक्षित ओर से कम से कम 620 बीपी पता लगाने योग्य लक्षित एकीकरण 2 को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है के साथ कि सही समरूपता है. अनुरूपता की लंबी क्षेत्रों को लक्षित और लगभग 1,000 बीपी के डीएनए किनारों को लक्षित 1-4 एक विश्वसनीय और कारगर तरीका है का उपयोग करने की उच्च क्षमता का उत्पादन. इस कारण यह जीनोमिक लक्षित कर फ्लैंकों टी. का एक ही तनाव से उत्पन्न कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है आनुवंशिक रूप से चालाकी से किया जा रहा है कि तनाव के रूप में gondii (आरएच, प्रु). पर्याप्त अनुरूपता की कमी अक्सर एक जीनोमिक को लक्षित ओर से लक्षित एकीकरण का परिणाम है, लेकिन दूसरे नहीं कर सकते हैं. अधूरा एकीकरण या एक पीटा मा प्राप्त करने के लिए विफलतावाई भी episomal हठ की वजह से हो. इसके तत्काल बाद अभिकर्मक के बाद, को लक्षित अणुओं के सभी episomes nonintegrated कर रहे हैं, और कभी कभी को लक्षित अणुओं कई पीढ़ियों के लिए episomes के रूप में बच सकते हैं. ~ 1 KBP का लक्ष्य डीएनए किनारों का प्रयोग और पूर्व फिर से subcloning के लिए चयन के तहत परजीवी पारित करने के लिए जारी रखने के लिए अक्सर episomal दृढ़ता के साथ जुड़ी समस्याओं को हल करता है.

एक पीटा मान्य है और HXGPRT मार्कर हटा दिया जाता है एक बार, जीन को निशाना बनाने की रणनीति 1-3 एक परजीवी तनाव में एकाधिक जीन विलोपन उत्पन्न करने के लिए एक दूसरा भारत सरकार पर दोहराया जा सकता है. विलोपन, प्रतिस्थापन, या टैग किए गए जीन की पीढ़ी भी अलग चयन मार्कर (bleomycin, कैट, pyrimethamine प्रतिरोधी DHFR, आदि) का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है. कैट चयन मार्कर वर्तमान प्रकार द्वितीय Δ KU80 प्रु जीनोम 1 में मौजूद है, हालांकि, इस मार्कर HXGPRT का उपयोग कर हटाया जा सकता है HXGPRT चयन एक एकल प्रतिलिपि लक्षित प्रविष्टि एमपीए + एक्स मध्यम. HXGPRT में मजबूत चयन के लिए पर्याप्त है, जहां सबसे अधिक लक्षित कर कुशलता के साथ सुरक्षित और सबसे कुशल मार्कर है भी एक के लक्षित हटाने के लिए केवल वर्तमान में उपयोगी दृष्टिकोण प्रदान करता है 6 thioxanthine (6TX) चयन 2,3 का उपयोग कर चयन मार्कर (चित्रा 3). इस प्रकार इस प्रोटोकॉल कई लक्षित आनुवंशिक जोड़तोड़ के साथ परिभाषित उत्परिवर्ती उपभेदों के विकास के लिए केवल वर्तमान दृष्टिकोण प्रदान करता है.

इस प्रोटोकॉल Toxoplasma gondii की Δ KU80 उपभेदों में लक्षित आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक मूल्यवान और कुशल तरीका प्रदान करता है और एक जीन, जीन के एक परिवार, या जीनोम चौड़ा कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन के विश्लेषण के लिए लागू है. पिछले Δ KU80 उपभेदों 1,2 की उपलब्धता के लिए, इन तरीकों ine के कारण व्यापक रूप से व्यवहार्य नहीं थेइन तरीकों में से fficiency. नतीजतन, इस प्रोटोकॉल Toxoplasma gondii के लक्षित आनुवंशिक हेरफेर के लिए व्यापक रूप से लागू है और परजीवी जीव विज्ञान, मेजबान प्रतिक्रिया, और कार्यात्मक जीनोमिक्स पर सवालों की एक श्रृंखला के समाधान में रुचि रखते सभी जांचकर्ताओं के लिए सुलभ है.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस काम में दिल्ली जल बोर्ड के लिए एनआईएच से अनुदान (AI041930, AI073142, AI075931, और AI091461) द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Overlap Primers Integrated DNA Technologies 4 nmole Ultramer DNA oligos
Validation Primers Integrated DNA Technologies 100 nmole DNA Oligo
Yeast Strain #90845 ATCC Designation FY834
Shuttle Vector pRS416 ATCC 87521
DH10B E. coli Invitrogen 12033-015 SOC broth in kit with E. coli
Resuspension Buffer Qiagen Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit
Miniprep Kit Qiagen 27104 QIAprep Spin Miniprep Kit
Glass Beads Scientific Industries SI-BG05 0.5 mm acid-washed
Qiacube Automated Robotic Work Station Qiagen
Electroporation Cuvette USA Scientific 9104-5050 2 mm-gap
BTX600 electroporator BTX
Maxiprep Kit Qiagen 12662 QIAprep Spin Maxiprep Kit
25 cm2 Canted neck plug seal flask Corning 430168
150 cm2 Canted Neck plug seal flask Corning 430823
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells ATCC SCRC1041
Swin-lok Filter Holder Whatman 420200 25-mm-diameter
Membrane Whatman 110612 Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter
Mycophenolic acid (MPA) Sigma
Xanthine (X) Sigma
96-well Tissue Culture Tray Corning Costar
24-well Tissue Culture Tray Corning Costar
MEM Eagle Media Lonza Biowhittaker 12-611F
Fetal Bovine Serum Gibco 26140-111
Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti) Gibco 15240-062
Spin Column Primm Labs PAE-100 Easy Clean DNA Extraction Spin Kit
T4 DNA Ligase New England Biolabs
6-thioxanthine Acros Organics
Tissue DNA Minikit Qiagen 51104 QIAamp DNA Blood Mini Kit
Cell Culture Freeze/Recovery Media Gibco 126-48-010
Phosphate Buffered Saline Hyclone SH30028.02 minus calcium, minus magensium

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References

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में आनुवंशिक हेरफेर<em&gt; Δku80</emके कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के लिए&gt; खींच<em&gt; Toxoplasma gondii</em
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Rommereim, L. M., Hortua Triana, M.… More

Rommereim, L. M., Hortua Triana, M. A., Falla, A., Sanders, K. L., Guevara, R. B., Bzik, D. J., Fox, B. A. Genetic Manipulation in Δku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (77), e50598, doi:10.3791/50598 (2013).

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