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Immunology and Infection

Manipulation génétique Published: July 12, 2013 doi: 10.3791/50598
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, The Geisel School of Medicine at Dartmouth

Summary

Nous rapportons ici une méthode d'utilisation de type I et de type II

Abstract

Manipulation génétique ciblée utilisant la recombinaison homologue est la méthode de choix pour l'analyse génomique fonctionnelle pour obtenir une vue détaillée de la fonction des gènes et le phénotype (s). Le développement de souches mutantes présentant des délétions ciblées de gènes, les mutations ciblées, la fonction des gènes complété et / ou des gènes marqués fournit de puissantes stratégies pour aborder la fonction des gènes, en particulier si ces manipulations génétiques peuvent être ciblées efficacement pour le locus du gène d'intérêt en utilisant la médiation d'intégration en double traverser la recombinaison homologue.

En raison des taux très élevés de recombinaison non homologue, l'analyse génomique fonctionnelle de Toxoplasma gondii a été précédemment limitée par l'absence de méthodes efficaces pour cibler la délétion de gènes et les remplacements de gènes de loci génétiques spécifiques. Récemment, nous avons aboli la principale voie de recombinaison non homologue de type I et souches de T. type II gondii en supprimant le gène encoding le 1,2 de protéine Ku80. Les souches Δku80 se comportent normalement pendant tachyzoite (aiguë) et bradyzoïte (chronique) Cycle in vitro et in vivo et présentent essentiellement une fréquence de 100% de la recombinaison homologue. Les souches Ku80 Δ font des études génomiques fonctionnelles faisable sur le gène unique ainsi que sur l'échelle du génome 1-4.

Ici, nous rapportons méthodes d'utilisation de type I et de type II souches Δku80Δhxgprt d'avancer méthodes de ciblage de gènes dans T. gondii. Nous présentons des méthodes efficaces pour engendrer des délétions de gènes, les remplacements de gènes, et les gènes marqués par insertion ciblée ou la suppression de la phosphoribosyltransferase (HXGPRT) marqueur de sélection hypoxanthine-xanthine-guanine. Le gène décrit le ciblage protocole peut être utilisé dans une variété de façons Δku80 souches pour faire avancer l'analyse fonctionnelle du génome du parasite et de développer des souches uniques qui portentmultiple ciblé manipulations génétiques. L'application de cette méthode génétique et tests phénotypiques suivantes révélera des aspects fondamentaux et unique de la biologie de T. gondii et des agents pathogènes humains importants liés qui causent le paludisme (Plasmodium sp.) et la cryptosporidiose (Cryptosporidium).

Introduction

Toxoplasma gondii est un parasite obligatoire de protozoaire intracellulaire commun que fréquemment et infecte chroniquement un large éventail d'animaux et les humains 5. On estime que plus de 1 milliard d'êtres humains sont actuellement et chroniquement infectés par ce pathogène. En plus de l'importance de la maladie causée par T. gondii infection, la disponibilité croissante des outils expérimentaux, les ressources génomiques puissantes 6, la facilité de croissance in vitro et d'excellents modèles de souris ont fait T. gondii un système modèle de premier plan pour l'étude plus large de pathogènes eucaryotes intracellulaires et d'autres parasites apicomplexes importants qui causent des maladies dévastatrices comme le paludisme (Plasmodium sp.) et la cryptosporidiose (Cryptosporidium) 5,7. Une limitation importante de Toxoplasma gondii comme un organisme modèle a été la récupération inefficace des descendants qui transportent ciblé manipulations génétiques. Ce problem en ciblage génique est due à une faible fréquence de recombinaison homologue par rapport à la très haute fréquence de recombinaison non homologue dans les souches de type sauvage de T. gondii, même quand une homologie de l'ADN est prévu dans des molécules cibles d'ADN utilisées dans les études génétiques 2.

Nous avons récemment génétiquement bloqué la principale voie de recombinaison non homologue de type I et souches de Toxoplasma gondii de type II par la suppression du gène codant pour la protéine de 1,2 Ku80. Le type résultant I et Ku80 souches Δ type II présentent des taux de croissance normale, la taille et le comportement à la fois in vitro et in vivo au cours de tachyzoite et étapes bradyzoïte in vitro et in vivo, cependant, ces souches présentent essentiellement une fréquence de 100% de la recombinaison homologue et cette phénotype augmente la probabilité d'isoler rapidement la progéniture désirée de manipulations génétiques ciblées par plusieurs centaines à plusieurs thoUSand fois 1,2,4. À l'échelle communautaire utilisation récente de type I et de type II souches Δ Ku80 a considérablement intensifié le rythme, la variété, ainsi que le taux de réussite des approches génétiques ciblées dans T. gondii 1-4,8-13. Nous décrivons ici un protocole complet pour la suppression ciblée des gènes, le remplacement d'un gène, et le marquage des gènes dans Δ Ku80 souches de T. gondii. Nous démontrons comment concevoir et cibler de manière fiable les manipulations génétiques à des gènes spécifiques ou loci génétiques dans Δ Ku80 souches de Toxoplasma gondii.

Protocol

1. Gene Targeting pour supprimer un gène d'intérêt

Ce protocole est conçu pour la génération efficace d'une souche mutante qui a une délétion du gène ciblé à un locus génétique défini. L'décrit précédemment T. gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransférase (HXGPRT) marqueur de sélection est utilisé dans ce protocole pour l'insertion de marqueurs sûre et fiable à la suite de l'acide mycophénolique et la xanthine (MPA + X) Sélection 14-16. Ce protocole utilise une méthode validée et efficace pour construire des molécules d'ADN de ciblage basé sur la levure clonage par recombinaison 17,18. Plusieurs protocoles alternatifs sont disponibles dans le commerce pour construire des molécules ciblant recombinantes en utilisant des méthodes de clonage de recombinaison bactériennes, dans les méthodes de clonage de recombinaison in vitro ou fusion PCR. Le protocole décrit ci-dessous donne le rendement global le plus élevé et la fiabilité de la récupération cloné paragraphesites possédant une délétion du gène ciblé dans Δ Ku80 souches de T. gondii.

1.1 Préparation du ciblage de l'ADN

  1. Accès ToxoDB 6 ( http://www.toxodb.org ) pour obtenir des séquences génomiques du gène d'intérêt (GOI).

Remarque: les séquences génomiques peuvent être obtenus auprès de type I, II ou III séquence du génome de la base de données ToxoDB qui est plus proche de la souche d'être manipulé. Par exemple: GT1 pour des RH et ME49 pour Pru.

  1. Conception chevauchement des amorces spécifiques qui amplifient la 5 'et 3' flancs ciblant génomiques du gène d'intérêt (GOI) incorporant un chevauchement 33 pb avec la navette de levure vecteur pRS416 (ou encore pRS426) et intégrer un chevauchement 33 pb avec le marqueur de sélection ( HXGPRT) (Figures 1A-B). Ajouter un site d'enzyme de restriction unique dans chaque amorce aux deux extrémités de la partie 5 'd'unflancs ciblant génomiques nd 3 ', placées entre le chevauchement 33 pb et le T. séquence de l'amorce gondii spécifique (s) (Figures 1A-B).

Note: A plus de 30 chevauchement BP est nécessaire pour l'efficacité levure recombinaison clonage. Le 5 'et 3' des flancs de ciblage génomique sont conçus pour amplifier des fragments d'ADN spécifiques entre 800 et 1400 pb qui définissent une délétion ciblée. Soyez conscient que les flancs courts permettra de réduire considérablement l'efficacité du ciblage dans le Δ Δ Ku80 HXGPRT fond 2.

  1. Amplifier par PCR la région 5 'flanc cible en utilisant des amorces F1 et R1, et amplifier par PCR la région 3' flanc de la cible en utilisant une amorce et R2 F2 (figures 1A-C) à partir de l'ADN génomique 3. Séparément, amplifier par PCR le gène 2 kpb ~ HXPGRT dont l'associé en 5 'et 3' dhfr régions du HXGPRT cassette de pminiHXGPRT 14 ADNc en utilisant des amorces flanquant HXF et HXR(Figures 1B-C).

Remarque: Amplification flancs cibles en utilisant l'ADN génomique de la souche parentale à transfecter.

Remarque: Placez le marqueur HXGPRT dans l'orientation vers l'avant par rapport à la 5 'et 3' ADN de ciblage flancs pour faciliter les manipulations génétiques efficaces ultérieures, telles que la suppression ciblée de HXGPRT du locus perturbé.

  1. Vérifier les tailles des produits de PCR correctes par électrophorèse sur gel d'agarose et d'estimer la concentration de fragments d'ADN sur gel d'agarose en utilisant des normes ou à un autre procédé de détermination de la concentration d'ADN.
  2. Générer des portions de levure compétentes telles que décrites dans Gietz et Schiestly 17.
  3. Moissonneuse 50 ng de 5 'flanc ciblage génomique, 50 ng de 3' flanc ciblage génomique, 100 ng de marqueur de sélection HXGPRT, et 50 ng de vecteur navette linéarisé avec H 2 O stérile pour obtenir un volume final de 10 -20 pl. Transformez levure compétente avec les trois produits de PCR et la levure E. vecteur navette coli pour le clonage par recombinaison selon le protocole décrit par Gietz et Schiestly 17. Plate transformé levure sur gélose de milieu minimal uracile moins et incuber à 30 ° C pendant 2 - 3 jours.

Remarque: L'ensemble ordonné de le plasmide, 5 'flanc cible, le marqueur HXGPRT et 3' flanc cible est facilitée par les 33 chevauchement des pb d'ingénierie entre les fragments d'ADN (Figures 1A-B) et est médiée par recombinaison homologue dans levure.

  1. levure de récolte en ajoutant 2 ml de 2x YPAD aux plaques uracile moins et en grattant doucement pour déloger les colonies sans perturber l'agar-agar. Centrifuger la solution de levure pendant 5 min à 5000 xg et jeter le surnageant.
  2. Reprendre la levure culot dans 250 ul d'un tampon de remise en suspension contenant RNaseA et ajouter 50 - 100 pi d'uneperles de verre cid à ​​la chaux à la solution. Vortex pendant 5 min à la vitesse la plus élevée pour briser les cellules de levure.
  3. Permettre aux billes de verre de se déposer au fond du tube et de transférer le surnageant dans un tube Eppendorf de 2 ml.
  4. Isoler l'ADN de levure en utilisant un kit d'isolation d'ADN miniprep, remise en suspension dans un volume final de 100 pl ~.
  5. Mélanger 2 pl ADN de levure (~ 50 ng) avec 40 pl de DH10B électroporation compétente E. coli conservés dans la glace.
  6. Transférer la solution dans une réfrigéré 2 mm écart cuvette d'électroporation et l'électroporation des cellules bactériennes à 2,4 kV et 129 Ω.
  7. cellules de sauvetage en ajoutant 0,8 ml de bouillon SOC à chaque cuvette et une solution de transfert dans un tube Falcon à bouchon 14 ml. Incuber les cellules à 37 ° C sur un tambour de rouleau de 40 - 60 min.
  8. Plate E. coli sur 2XYT + ampicilline plaques (AMP) et incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
  9. Choisissez ~ 6 - 8 colonies isolées et de grandir dans 3 ml 2XYT + AMP pour ~ 16 heures à 37 ° C.
    10. E. clone coli.
  10. Isoler pΔGOI plasmide de E. clones de E. coli en utilisant un kit miniprep, remise en suspension dans un volume final de 100 pl ~.
  11. Valider la pΔGOI en utilisant l'enzyme de restriction digère pour mesurer la taille du plasmide d'ADN et vérifier l'ADN pΔGOI attendu profils de bandes.
  12. Finaliser la validation de pΔGOI par séquençage de l'ADN 5 'et 3' ciblant les flancs génomiques pour vérifier séquence d'ADN de 100% sur la base des données de séquences génomiques dans http://www.ToxoDB.org .

Remarque: environs parfaite homologie de séquence est essentiel pour optimiser l'efficacité de ciblage de gène 3 depuis chaque différence de paire de base constitue une découpe correspondante de la longueur de l'homologie parfaite.

Note: La séquence du génome de la souche de type II Δku80 basé sur le Pru parental stpluie n'est pas disponible en ce moment. Ce travail utilise la séquence de type II ME49 du génome que le génome de substitution pour la souche de type II Δ Ku80. Basé sur des données de séquence à un certain nombre de loci génétiques, on estime que le génome ME49 et le génome Pru présentent polymorphismes nucléotidiques simples à une fréquence de ~ 1 pour 10.000 nucléotides ou moins.

  1. Générer> 200 pg de stock pΔGOI en inoculant une ~ 250 ml 2XYT + AMP culture de la nuit avec des stocks de glycérol à partir d'un E. validé coli miniprep clone.
  2. Isoler l'ADN plasmidique pΔGOI de la grande culture en utilisant un kit d'isolation d'ADN maxiprep, remise en suspension dans un volume final de ~ 1000 ul.
  3. Répéter enzyme de restriction digère, ou le séquençage d'ADN de l'ADN maxiprep pΔGOI pour vérifier la molécule d'ADN de ciblage correcte avant la transfection.
  4. Linéariser ~ 15 pg pΔGOI à l'extrémité 5 'en utilisant l'enzyme de restriction unique X (RE.X)Site digest construit en 5 'flanc cible (figures 1B).

Note: Le ciblage génique en T. gondii nécessite un minimum d'environ 10 ug d'ADN de ciblage afin d'obtenir une fréquence efficace de cibler un événement dans le locus du gène d'intérêt 2.

  1. Valider linéarisation de pΔGOI et déterminer la concentration d'ADN par électrophorèse sur gel d'agarose ou une autre méthode.

Note: Si la restriction digestion enzymatique à l'extrémité 5 'flanc ne donne pas linéarisation terminée, le 3 conçu «le site digest RE.Y unique peut être utilisé comme un site alternatif pour la linéarisation de pΔGOI.

Note: Une molécule d'ADN de ciblage complètement linéarisé est essentielle pour génique efficace de ciblage par recombinaison homologue dans les souches Ku80 Δ.

  1. Neutraliser l'enzyme de restriction par Incubattion à 68 ° C pendant 15 - 20 min.
  2. Préparer au moins 15 ug de plasmide linéarisé dans 100 pi de stériles H 2 O. Magasin linéarisé pΔGOI à -20 ° C jusqu'au moment de la transfection.

1.2 Préparation de T. parasites Toxoplasma, la transfection, la sélection, sous-clonage, la validation, l'archivage et l'entretien des souches génétiquement modifiées

Méthodes générales pour la culture et la manipulation de T. gondii dans les cellules de fibroblastes de prépuce humain (HFF) sont décrits 19-21. Les souches Δ Δ Ku80 HXGPRT reproduisent normalement en milieu d'infection parasite (Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) de milieu de culture supplémenté avec 1% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% dilué dans un stock 100x antimycosique-antibiotique) 1,2. Tout le travail avec Toxoplasma gondii doit être effectuée à l'aide du niveau de biosécurité 2 procédures. Le T. gondii RHΔ Ku80 2 PareNTAL souche a été générée à partir de la souche RHΔ HXGPRT du Roos Lab 14. Le PruΔku80 une souche parentale été générée à partir PruΔhxgprt (souche gniaud Pru BSG-4 22) qui contient un marqueur sélectionnable CAT intégré de façon stable et d'une protéine fluorescente (GFP) journaliste verte sous la commande de l'étage de LDH2 promoteur spécifique bradyzoite.

  1. Inoculer un flacon de 25 cm2 contenant des cellules HFF confluentes avec 1 x 10 6 RH Δ Ku80 Δ HXGPRT parasites de type viable I, ou inoculer deux flacons de 25 cm2 avec 2 x 10 6 viable II Prugniaud Type (Pru) Δ Ku80 Δ HXGPRT des parasites.

Note: parasites viables sont définies comme des parasites extracellulaires qui ont fraîchement lysées out.

Remarque:

  1. Inspecter les cultures infectées Δ Δ Ku80 HXGPRT ~ 68 à 72 heures après l'infection. Vérifiez la présence de parasites viables et ~ 90 - 95% de lyse des cellules HFF à planifier le calendrier précis de la transfection.

Note: L'isolement des parasites fraîchement sortis de l'avion est essentiel pour le succès de ce protocole parce que la faible viabilité du parasite abolira gène-efficacité du ciblage.

  1. Agiter parasites viables dans la solution en fermant le couvercle plug-joint sur ​​le flacon de 25 cm2 et agiter vigoureusement le flacon avant et en arrière pour agiter les parasites hors de la surface de croissance sans éclaboussures liquide sur l'intérieur du couvercle ou le col du flacon .

Note: Parasite récolte ne nécessite pas un protocole de libération seringue-aiguille pour le type I outaper Ku80 souches Δ II.

  1. Transvaser la solution parasite à une seringue 10 fixée à un porte-filtre contenant une membrane de 3 pm et placer l'unité de filtre au-dessus d'un tube à vis de 15 ml bouchon ouvert. Filtrer les parasites seringue dans le tube à vis du bouchon 15 ml.

Note: Le filtrage des parasites à travers la membrane élimine les cellules infectées et les débris cellulaires.

  1. Déterminer la concentration parasite (formes tachyzoïte par ml) en utilisant un hématimètre.

Note: En option: Utilisation de la solution de parasite, mis en place une unité de formation de plaques (UFP) de dosage 21 qui sera lu 7 - 8 jours plus tard pour déterminer la viabilité adéquate des parasites transfectées (PFU à tachyzoïte ratio ≥ 0,2).

  1. Pellet parasites pendant 7 min à 1400 xg et recueillir le surnageant à ~ 0,4 ml sans perturber le culot parasite. Faites tourner pendant 2 min à 1,400 XG et aspirer surnageant restant à ~ 0,01 ml sans perturber le culot parasite.
  2. Reprendre le culot parasitaire en effleurant le fond du tube 23 et ajouter immédiatement tampon de CYTOMIX (1.33x concentration) pour le parasite pastille pour obtenir une concentration parasitaire de 4 - 5 x 10 7 / ml CYTOMIX parasites.

NB: Omettre l'ajout d'ATP et de glutathion à CYTOMIX depuis ces ajouts ne s'améliorent pas l'efficacité du ciblage de gène.

  1. Décongeler les 100 aliquote de l'linéarisé pΔGOI du protocole 1.1 (étape 26).
  2. Transférer 0,3 ml de la solution de CYTOMIX parasite (~ 1,3 - 1,6 x 10 7 parasites) au 100 ul de linéarisé pΔGOI du protocole 1.1 (étape 26), et transférer immédiatement la totalité 0,4 ml parasite + pΔGOI mélange à une réfrigéré écart de 2 mm cuvette d'électroporation.
  3. Électroporer les parasites à 1,4 kV et 24 Ω.
  4. Rest la cuvette de transfection à la température ambiante pendant environ 5 min puis transférer la totalité du contenu de la cuvette de transfection dans un flacon de 150 cm 2 contenant des cellules HFF confluentes avec 30 milieu d'infection ml et incuber la culture infectée pendant la nuit.
  5. Début sélection dans l'acide mycophénolique + xanthine (MPA + X) ~ 20 heures après la transfection (figure 2A) en remplaçant le milieu de l'infection par le MPA + X milieu de sélection (MPA (25 pg / ml) et de la xanthine (50 pg / ml) dans moyen infection).

Note: Ne pas déranger le MPA incubation + X ballon de sélection.

  1. Estimer le nombre total de PFU dans la MPA + X flacon de sélection ~ 8 jours post-transfection en inspectant visuellement la monocouche. Vérifier la présence de développer les zones UFP et sain de l'infection par microscopie optique.

Remarque: Si les plaques ne sont pas visibles par jour 8, maintenir la sélection et surveiller les signes de contaminerions depuis souches mutantes peuvent avoir un taux de réplication réduit.

Note: Les souches Δ Δ Ku80 HXGPRT parasites ont un très faible bruit de fond des événements indésirables non ciblés, ce qui permet un isolement réussi de souches mutantes avec assez sévère, mais des défauts de croissance non létales. Si un gène est essentiel et il ne peut pas être supprimé, la transfection primaire, ou par la suite passé population de parasite, peut révéler un phénotype où les parasites cessent de se multiplier pendant la sélection que la population décide de KO ciblées.

  1. Agiter le flacon comme à l'étape 3 pour déloger les parasites extracellulaires de la monocouche [après plaques visibles ont développé] pour générer une solution parasite. Transfert ~ 0,5 ml de la solution parasite de l'AMP + X sélection flacon de 25 cm2 une AMP + X ballon de sélection contenant cellules HFF confluentes (désigner cette culture passe 1A).
  2. Déloger parasites dans l'original de 150 cm 2 MPA + X sélection flacon ~ 3 jours plus tard et le transfert ~ 0,5 ml de solution parasite à un second 25 cm 2 MPA + X flacon de sélection contenant des cellules HFF confluentes (désigner cette culture passe 1B).
  3. Permettre aux zones d'infection de se développer dans passe 1A et / ou passent flacons 1B pendant environ 5 jours. Vérifier visuellement par microscopie optique qui 1A de passe et flacons 1B contiennent un minimum de 25 UFP viables avec des zones saines de l'infection.
  4. Choisissez soit le 1A de passe ou flacon 1B de passage pour le passage continu en + X milieu de sélection AMP en flacons de 25 cm2. Maintenir passage sous MPA + X sélection.

Note: Les parasites doivent être cultivées pour un certain nombre de générations suffisant pour supprimer qu'épisomes persistantes non intégrés de la population avant le sous-clonage. Ne pas effectuer le sous-clonage avant 20 jours post-transfection de type I RH Δ Δ Ku80 HXGPRT, ou avant 25 jours post-transfection pourII Pru Δ Δ Ku80 HXGPRT parasites de type prévoir un délai suffisant pour diluer qu'épisomes non intégrés 1,2.

  1. parasites du sous-clone dans un plateau de 96 puits contenant des cellules HFF confluentes avec + X milieu de sélection AMP. Préparer un plateau à une concentration de 1 parasite / puits et un second plateau à une concentration de 2 parasites / puits.

Note: les parasites du clone qui ont récemment lysées (~ 90 - 95% des cellules HFF dans le flacon de 25 cm2) de veiller à ce que les parasites ont une viabilité élevée.

Note: Le délai optimal post-transfection pour le sous-clonage a été établi en mesurant la rapidité avec laquelle les parasites ciblés avec succès surviennent à une fréquence élevée dans la population sélectionnée 1.

  1. Continuer au passage la population principale de parasites transfectées dans un milieu de sélection + MPA X en utilisant un calendrier de passage hebdomadaire d'infecterun cm 2 HFF flacon de 25 à 10 pi de la solution de parasite.

Remarque: Si clones portant la délétion du gène ciblé (KO) ne sont pas obtenus à partir de la première sous-clonage dans l'étape 18, resubclone les parasites de la population maintenue en permanence, ~ 10 - 12 semaines après la transfection.

Note: Une des raisons pour lesquelles une délétion du gène n'est pas obtenu découle de la persistance épisomal de certains plasmides pΔGOI. Persistance épisomal est déterminée par les séquences contenues dans la 5 'et 3' ciblant les flancs génomiques et ne semble pas provenir de l'élément génétique HXGPRT. Environ 5 à 10% des plasmides ciblant présentent persistance épisomal importante qui nécessite un temps plus tard de sous-clonage pour permettre à la population parasite un nombre suffisant de temps de génération de diluer les qu'épisomes persistantes et résoudre la population à intégrants essentiellement stables.

    Score du 96 puits plateau 6 - 7 jours post-sous-clonage (parasites de type I) ou 7-8 jours après sous-clonage (parasites de type II) pour les puits qui contiennent un seul PFU, identifié comme une zone unique de l'infection dans la microscopie optique à soit 40X ou 60X puissance. Marquer un petit point sur le couvercle du bac à 96 puits à désigner l'emplacement de la PFU dans le puits.
  1. Mélanger le contenu de chaque puits contenant un seul PFU en utilisant une pipette fixé à 50 l (200 pointe ul) en dirigeant l'écoulement de fluide au cours de la PFU pour disperser les parasites dans le puits.

Note: Le mélange du bien accélère la lyse du parasite de la monocouche HFF. Type I souches RH lysera le bien ~ 4 jours après le mélange, II Pru parasites de type lyseront le bien ~ 5 jours après le mélange.

  1. Sélectionnez une douzaine lysées puits (clones) et zéro au bas de chacun de ces puits lysées en utilisant un 0,5-10 pipette ul tandis que simultanément dessin-up 6 pi de solution parasite. Transfer le 6 pi de solution parasite à un puits dans un plateau de 24 puits contenant des cellules HFF confluentes dans 1 ml MPA + X de milieu de sélection.

Note: Il est essentiel de se gratter le fond du puits pour maintenir l'ouverture portait sur ​​la pointe de la pipette en contact constant avec les parasites qui résident au fond du puits.

  1. Surveiller le plateau de 24 puits pour la lyse des cellules HFF.

Remarque: le type I parasites RH sera généralement lyse le bien dans le format de 24 puits dans ~ 4 jours. Type II Pru parasites seront généralement lyse bien dans ~ 5 jours.

  1. Transfert 2 ul de solution viable parasite rayé du fond de chaque puits dans le format à 24 puits pour le puits correspondant d'un nouveau plateau de 24 puits contenant des cellules HFF confluentes et 1 ml d'AMP + X milieu de sélection par puits.

Note: Tous les parasites clones et les lignes peuvent être continuellement principalecontenues en passant 2 pl de solution de parasite viable tous les 7 jours dans ce format de plateau de 24 puits.

  1. Vérifiez que les parasites ont été transférés avec succès à un nouveau plateau de 24 puits par inspection visuelle avec la microscopie optique environ 18 heures post-passage.
  2. parasites de récolte des puits lysées du plateau de 24 puits de l'étape 23 - 24 en utilisant soit un 1 ml ou 10 ml pipette et transférer la solution parasite dans un tube Eppendorf.
  3. Pellet les parasites à 1400 x g pendant 7 minutes, rincer une fois dans 1 ml de tampon phosphate salin (PBS), et à granulés de nouveau à 1400 x g pendant 3 min.
  4. Aspirer PBS à partir du culot, puis ajouter 200 l de PBS dans le culot de remettre en suspension les parasites. Congeler la solution parasite à -80 ° C jusqu'au moment de l'isolement de l'ADN.
  5. Isoler l'ADN du parasite à partir de chaque clone en utilisant un isolement MINIKIT ADN des tissus.
  6. Valider la suppression du gène ciblé (KO) par PCR utilisant des amorces de validation (Figures 2A-C). Test de l'l'absence de la région codante fonctionnelle du gène d'intérêt et en utilisant le CxF amont et des amorces d'ADN génomique CxR aval (figures 2A-B) test de la présence de produits de PCR qui couvrent les flancs de ciblage génomique et HXGPRT de démontrer correcte en 5 'et 3 intégration du gène HXGPRT 'ciblée dans le locus du gène supprimé.

Note: Les amorces pour la validation doivent être uniques au gène d'intérêt ou un faux résultat positif peut être obtenu. conception d'amorce peut être validé sur http://www.toxodb.org par projection des séquences d'amorces dans le génome (s) pour vérifier les amorces sont uniques.

  1. Passage clones de parasites sur un horaire hebdomadaire comme décrit dans l'étape 24. Une fois la suppression ciblée a été validé, la sélection continue dans MPA + X est facultative.
  2. Archive parasite clones en préparant des stocks de congélation. Pellet parasites extracellulairesà partir de cellules HFF lysées dans un cm 2 flacon de culture 25, retirer le support et doucement resuspendre culot parasitaire dans un milieu de congélation de la culture cellulaire à une concentration parasitaire> 4 x 10 7 parasites par ml. Transfert portions de cryovials et les parasites des magasins indéfiniment dans l'azote liquide, ou à -80 ° C.

2. Suppression de HXGPRT

Ce protocole est conçu pour éliminer le marqueur HXGPRT de son site d'intégration dans le génome d'une souche génétiquement modifiée Δ Ku80. Suppression des HXGPRT permet la récupération de marqueur et la génération de souches multiples manipulations génétiques en utilisant uniquement des sélections basées sur HXGPRT 1-3. Alors que le protocole détaillé ci-dessous décrit la méthode de re-cibler un locus de supprimer HXGPRT, il convient de noter que la suppression de HXGPRT au niveau du locus du gène d'intérêt permet aussi simultanément re-intégration du gène de type sauvage (complementation), ré-intégration d'un gène mutant, ainsi que la réintégration d'un gène marqué (N-ou C-terminale de la GFP, HA étiquette, etc), ce qui permet une variété de manipulations génétiques. Les mécanismes d'action et ciblant 24 protocoles utilisant sélections de 6 thioxanthine ont été décrits précédemment 1-3,15.

2.1 Supprimer HXGPRT

  1. Accise le marqueur de sélection HXGPRT de pΔGOI par digestion avec RE.Z de couper dans les sites d'enzymes de restriction uniques flanquant le HXGPRT (figure 1B).
  2. Vérifier la digestion complète de l'ADN par électrophorèse sur gel d'agarose. Isoler le plus grand des deux bandes à partir du gel d'agarose.

Remarque: le plus grand des deux bandes contient le plasmide avec le 5 'et 3' des flancs de cibles d'ADN, mais pas le gène HXGPRT.

  1. Placez la section agarose contenant la bande d'ADN plus grand dans une colonne layin de sping Le plat de gel sur la membrane. Faites tourner la colonne à 13000 x g pendant 4 min à température ambiante. Ajouter stériles H 2 O à la accréditives pour porter le volume à 100 pi.

Remarque: D'autres méthodes commerciales sont disponibles pour isoler l'ADN à partir d'agarose.

  1. Concentrer l'ADN par précipitation par EtOH, la remise en suspension de l'ADN dans un volume final de 18 ul stériles H 2 O.
  2. Mélanger 1 pl de l'ADN concentré avec 7 ml H 2 O, 1 pl de tampon de ligature 10x et 1 pl de l'ADN ligase T4 (5 unités) et placez la réaction à 4 ° C pendant la nuit pour générer pΔGOIc (pΔGOIclean) (figure 3A).

Note: fragments d'ADN avec RE.Z contenant des extrémités d'ADN peuvent être conçus et inclus à cette étape pour créer plasmides appropriés pour ré-intégration ciblée du gène de type sauvage (complémentation), re-intégration d'un gène mutant ciblé ainsi que ciblée réintégration d'un gène marqué(N-ou C-terminale de la GFP, HA étiquette, etc.)

  1. Diluer le 2x réaction avec H 2 O stérile avant électroporation.
  2. Transformez pΔGOIc dans E. coli que dans le protocole 1.1 pour clone, d'isoler et de valider le plasmide ciblage. Puis linéariser pΔGOIc en préparation pour la transfection (voir les étapes 1.1.11 à 1.1.26).
  3. Répétez le protocole de transfection parasite tel que décrit dans le protocole 1.2 (étapes 1 à 11).

Note: Avant d'effectuer les étapes 1 à 8, vérifier que la suppression ciblée de HXGPRT est faisable dans la souche mutante. Infecter un cm 2 flacon de cellules HFF confluentes 150 à 1 x 10 6 tachyzoïtes de la souche mutante à l'aide de 6 thioxanthine (6TX) du milieu de sélection (200 ug / 6TX en milieu d'infection ml) et placer le ballon dans un essai PFU. Inspecter le flacon 8 jours plus tard pour vérifier qu'aucun (ou très peu; <10) PFU sont visibles, ce qui est essentiel pour établir que le potentielgène tiel ciblage efficacité va dépasser une réversion spontanée potentiel de la souche mutante d'un phénotype à l'expression de HXGPRT réduite (un phénotype de résistance 6TX).

Note: Environ 5 - 10% des sites d'intégration HXGPRT présentent une fréquence significative et spontanée de résistance 6TX même si le marqueur HXGPRT est toujours intégré au site ciblé (voir la section Résultats de représentant pour l'explication).

  1. Début sélection 6TX ~ 20 heures après la transfection en changeant le milieu dans le flacon de 150 cm 2 de milieu de sélection 6TX.

Note: Ne pas déranger le ballon pendant ~ 10 jours post-transfection.

  1. Inspectez le ballon pour la formation PFU à jour 10 - 12 post-transfection (parasites de type I) ou le jour 10 - 16 post-transfection (parasites de type II).

Note: ParasiTES être ciblés pour la suppression de HXGPRT vont pas commencer à croître sous sélection 6TX jusqu'à ce que le gène HXGPRT et l'ARNm sont supprimées, et la protéine de HXGPRT résiduelle est inactivée.

  1. Agiter le flacon de sélection pour créer une solution parasite, et le transfert de 0,5 à 1,0 ml de la solution parasite à un nouveau flacon de 25 cm2 contenant des cellules HFF confluentes et 5 moyennes de sélection 6TX ml. Répétez le transfert des primaires 150 cm 2 de nouveaux flacons de 25 cm2 une fois par jour pendant deux jours de plus.

Note: L'échantillonnage multiple augmente les chances de capture de parasites ciblés viables qui ont perdu le gène HXGPRT.

  1. Inspecter les 25 cm 2 flacons ~ 5 jours après l'infection de vérifier la présence de développer PFU avec des zones de parasites réplication sains. Choisissez une ou deux flacons contenant des zones d'infection.

Remarque: HXGPRT à un taux de croissance normal en sélection 6TX.

  1. Continuer au passage les parasites dans un milieu de sélection 6TX.
  2. Sous-cloner la population parasitaire après le 25 - 30 jours de sélection. Mettre en place un plateau de 96 puits avec ~ 1 parasite / puits et une autre avec 2 ~ parasites / puits.
  3. Préparer l'ADN du parasite à partir de clones isolés et de maintenir des clones dans une culture en format 24 puits selon le protocole 1.2 (étapes 19 à 29).
  4. Valider la suppression de HXGPRT par PCR en utilisant la stratégie décrite dans les figures 3A-B.

3. Tagging C-terminal des protéines

Ce protocole est conçu pour C-terminal de marquage des protéines en ciblant le tag pour l'intégration par double croix sur la recombinaison homologue au locus génomique du gène à l'aide MPA + X 2,4 sélection. Ce protocole fonctionne de manière efficace parce que la séquence 5 'dhfr de l' 2,4.

3.1 le marquage direct C-terminale des protéines à des loci génétiques endogènes

  1. Créer ciblage pΔGOItag construction plasmidique en utilisant des levures clonage par recombinaison (figure 4) et les méthodes décrites dans le protocole 1.1. Le 5 'flanc ciblage génomique contient les 800 à 1.200 dernières pb de la région codante (ou ADN génomique) du RBE, à l'exception du codon de terminaison est déplacé vers une position 3' de la balise de choix (HA, étiquette Myc, His , etc)
  2. Création de l'insertion ciblée de l'étiquette C-terminale au niveau du locus du gène endogène codant pour la protéine en suivant la procédure décrite dans le protocole 1.1 et 1.2 en utilisant la stratégie décrite (figure 4).
  3. Vérifier l'insertion de la balise C-terminale au niveau du locus du gène endogène à l'aide d'une stratégie PCR.
  4. Recibler le locus du gène utilisant les méthodes décrites dans les protocoles 1 et 2 à Delete le marqueur sélectionnable HXGPRT pour créer un locus de gène endogène régulé précisément qui exprime une protéine marquée. Ce protocole récupère également le marqueur de sélection HXGPRT qui peut être utilisé à nouveau pour un autre locus cible dans la souche marqué (voir protocole 1).

Representative Results

Un modèle détaillé est prévu pour la construction d'un plasmide de criblage pour supprimer un gène, comprenant la mise en place des sites d'enzymes de restriction et de la génération des amorces qui facilitent le ciblage génétique et la validation de ciblage de gène, ainsi que la construction plasmidique de la suppression subséquente de HXGPRT dans un processus en une seule étape (Figures 1A-C, Figure 2A, figure 3A). Un schéma général est présenté pour faire une délétion du gène ciblé (figure 2A), les paires d'amorces utilisées pour valider la suppression d'un coup de grâce, par exemple, de type I rop18 (figure 2B), et des résultats représentatifs de la validation PCR sont représentées (figure 2C). Ce résultat représentatif est présenté pour illustrer l'éventail des résultats qui peuvent être obtenus à des loci génétiques qui sont relativement difficiles à cibler. Une délétion de gène ciblé avec succès se traduira par l'absence du gène de l'enintérêt produit PCR (PCR 1), la présence de l'extrémité 3 'flanc ciblage génomique (PCR2), et la présence du marqueur sélectionnable HXGPRT correctement intégrée entre l'extrémité 5' et les flancs de ciblage génomique 3 'qui définissent la suppression (PCR3 et PCR4) . Clones 3, 4, 5, 6, 8, 9, et 11 sont validés délétion de gènes ciblés (KO) où HXGPRT a remplacé le GOI (figure 2C).

Un clone qui ne contient pas une délétion du gène peut être représentée par une série de profils de bandes. Typiquement, un clone sans délétion du gène reflétera la souche parentale (modèle parental) avec des bandes observées pour PCR1 et PCR2, mais pas pour PCR3 ou PCR4 comme on le voit pour les clones 1 et 2 (figure 2C). Ce "modèle parental" se pose de quelques mécanismes potentiels. De temps en temps, MPA parasites résistants sélectionnés portent qu'épisomes persistant non intégrés de la pΔGOI ciblant plasmide, et nous notons que la sélection continue oblige souvent ces qu'épisomesà intégrer. On observe également un certain arrière-plan rare dans le type I Δ Ku80 déformation en raison de l'intégration involontaire du pΔGOI ciblage plasmide, qui contient un ADNc HXGPRT exprimée par DHFR 5 'et 3' des éléments promoteurs, soit dans le locus DHFR ou dans l'HXGPRT partiellement délété locus 14. Bien que cet événement rare est une intégration ciblée, ce n'était pas l'intégration prévue et sert de point clé à retenir dans la conception de toute stratégie de remplacement de gènes. ADN homologie supérieure à 120 pb effectuées sur votre pΔGOI ciblage plasmide peut fournir un site alternatif pour la recombinaison dans Ku80 souches Δ 2 qui pourrait redonner un fond indésirable. En Pru souche de type II Δ Ku80 ce contexte est réduit ou inexistant par rapport au type I parce que le marqueur de sélection HXGPRT est basée sur le type I séquences qui ont polymorphismes d'un nucléotide par rapport à l'ADN de type II quidiminue fortement ce fond rare dans les expériences utilisant le type II Pru Δ Ku80 souche 1. Si un locus du gène est essentiel (ne peut pas être supprimé), ou a un gène extrêmement faible ciblage fréquence au niveau du locus, ou s'il persiste [non intégrés] qu'épisomes ne sont pas facilement éliminés par la croissance et de la sélection, ce modèle parental va dominer la tendance observée dans le MPA clones résistants. Sinon, la molécule d'ADN de ciblage est parfois observée à intégrer à seulement 5 'ou 3' flanc ciblage génomique et une bande est observée pour les deux PCR3 ou PCR4 (mais pas les deux) avec PCR1 et PCR2 comme on le voit pour le clone 10 (5 'intégration) et clone 7 (3' intégration) (figure 2C). Ces modèles suggèrent l'apparition fréquente d'une seule croix sur l'intégration de la cible plasmide au niveau du locus qui intègre HXGPRT mais cette intégration ciblée ne supprime pas le gène d'intérêt. Ce modèle (lignes 7 et 10 de la figure 2C) emphasizes la nécessité de communiquer des données de PCR pour vérifier que l'intégration ciblée s'est produite au lieu d'un seul croisement homologue dessus et une seconde intégration non homologue de la molécule de ciblage. Rarement, on observe un mélange génétique représentée par le clone 12 (figure 2C) qui représente à la fois un modèle parental et un motif de suppression ciblée. Cette tendance résulte probablement à l'occasion de deux génotypes parasitaires qui sont présents au même endroit dans un clonage bien.

Un schéma général pour la suppression des HXGPRT de Δ ku80Δgoi :: HXGPRT supprimer HXGPRT de la souche est affichée (figure 3A). La paire d'amorces utilisé pour valider la suppression de HXGPRT de Δ Δ Ku80 GRA2 :: HXGPRT (figure 3B) amplifie une bande de Kbp unique de ~ 1,2 à PCR5 comme on le voit dans les clones 4, 7, 9, 11 et 12 (figure 3C). Si HXGPRT n'est pas retiré de l'locus, a ~ 3.4 bandes Kbp est observée (clones 1, 2, 3, 6, 8, 10, et le contrôle parental). Plusieurs mécanismes agissent pour rendre le retrait de HXGPRT (6TX sélection) plus difficile et moins efficace que l'intégration des HXGPRT (MPA + X sélection). Sélection MPA est tout simplement plus efficace que 6TX sélection 14,16. En outre, la hausse des niveaux d'expression HXGPRT sont nécessaires pour la sélection 6TX que pour les AMP sélections 16,24. En conséquence, les mutations qui peuvent réduire l'activité enzymatique HXGPRT ou mutations ou les changements épigénétiques qui réduisent le niveau d'expression de HXGPRT au locus d'un gène peuvent potentiellement abolir l'efficacité de la sélection 6TX. Même avec ces problèmes de sélection 6TX, le taux de réussite de la sélection des souches 6TX Ku80 Δ est supérieur à 90% à la première tentative 1-3.

Un schéma général pour le marquage C-terminal direct de gènes codant pour des protéines est affichée (Figure 4). Cettesystème utilise une intégration directe via un double croix sur la recombinaison homologue de HXGPRT 3 'du gène marqués et emploie également des stratégies de validation similaires à celles décrites ci-dessus. Quand un gène est soupçonné d'être un gène essentiel ceci peut être vérifié à l'aide d'une deuxième transfection avec un ciblage de l'ADN isolé indépendamment plasmide. D'autres méthodes, comme les systèmes d'expression de gène régulé, sont disponibles pour vérifier davantage si un gène est essentiel 25.

Figure 1
Figure 1. Vue d'ensemble de la conception d'un ciblage de l'ADN plasmidique. Une. Schématique de la conception chevauchent amorces utilisées pour amplifier par PCR la région 5 'et 3' des flancs de cibles avec 33 pb pour chevauche le vecteur pRS416 de navette et HXGPRT cassette minigène. Amorces décrites dans le schéma ont étéutilisé pour générer en 5 'et 3' des flancs de cibles de pΔROP18 10. B. stratégie globale pour la conception d'une molécule d'ADN de ciblage. L'épine dorsale de pΔGOI est le vecteur pRS416 navette contenant de l'uracile (URA) et l'ampicilline (AMP) marqueurs sélectionnables. Placée dans pRS416 est une ~ 1 kpb 5 'ADN flanc cible amplifié à partir d'ADN génomique avec chevauchement pour la cassette de minigène HXGPRT et pRS416 utilisant les amorces F1 et R1, a ~ 1 kpb 3' ADN flanc cible est amplifiée à partir d'ADN génomique avec chevauchement pour la cassette de minigène HXGPRT pRS416 et en utilisant les amorces F2 et R2 et la cassette d'minigène HXGPRT. Les sites de digestion par des enzymes de restriction uniques suivants sont ajoutés aux amorces: RE.X (l'enzyme de restriction site de coupure X) dans l'amorce F1 à couper le plasmide à l'extrémité 5 'de l'extrémité 5' ADN flanc cible, dans le R2 RE.Y amorce à couper le plasmide à «la fin de la 3 'du 3 ADN flanc cible et RE.Z dans les amorces R1 et F2 pour exciser le HXGPRT minLes séquences des amorces de cassettes de igene. C. utilisées pour générer la construction de ciblage pour la suppression de rop18. Les régions gras correspondent à T. la séquence génomique de Toxoplasma, et les régions non gras correspondent aux sites d'enzymes de restriction et des séquences qui se chevauchent avec pRS416 et la cassette de minigène HXGPRT. La paire d'amorces HX_F et HX_R amplifie le HXGPRT cassettes mini-gène 14. Primaires lus de 5 'à 3'. Tableau adapté de Fentress et al 10. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2. Présentation du protocole pour la suppression d'un gène à l'aide HXGPRT. Une. Disruption d'un GOI dans la souche Δ ku80Δhxgprt par un double croisement homologue d'événement de recombinaison avec une ~ 1 kpb 5 'ADN flanc de la cible et une ~ 1 kpb 3' ADN cible sur le flanc pΔGOI plasmide. Une stratégie PCR en utilisant PCR1, PCR2, PCR3 et PCR4 (pas à l'échelle) est démontré que permet la vérification du génotype de valider clones avec l'intégration ciblée de HXGPRT et la suppression du locus GOI. B. paires d'amorces de représentation destiné à valider la suppression de rop18 . ROP18_DF et ROP18_DR amplifient PCR1, ROP18_ExF et ROP18_CxR amplifient PCR2, ROP18_CxF et DHFR_CxR amplifient PCR3 et DHFR_CxF et ROP18_CxR amplifier PCR4 (voir figure 2A). Primaires lus de 5 'à 3'. Tableau adapté de Fentress et al 10. C. Les résultats représentatifs de la validation d'une délétion du gène ciblé (rop18) en utilisant HXGPRT. Après la transfection d'un plasmide pΔROP18 dans Δ ku80Δhxgprt et la sélection dans MPA +X, MPA + X clones résistants ont été testés pour la suppression de rop18. Le contrôle de la souche parentale est positif pour PCR 1 (~ 400 pb) et PCR 2 (~ 650 pb) produit et négatifs pour PCR 3 (~ 1200 pb) et PCR 4 (~ 1300 pb) produit. Un knock-out GOI ciblée est positif pour les produits PCR2, pCR3 et PCR4 et est négatif pour le 1er produit de PCR (voir figure 2A). Indiqués sont des panneaux représentatifs des résultats de PCR1 et PCR2 (panneau supérieur), pCR3 (panneau du milieu), et PCR4 (panneau du bas). Les clones 3, 4, 5, 6, 8, 9 et 11 présentent le profil de bandes correcte de PCR 1, PCR2, et PCR3 PCR4 qui définit un événement de suppression d'un gène ciblé dans le clone. Les clones 1, 2, 7, 10 et 12 ne sont pas la délétion de gènes, et correspondent à d'autres résultats représentatifs potentiels. (C = souche de contrôle parental Δ ku80Δhxgprt, M = marqueurs de taille). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3
Figure 3. Présentation du protocole de re-ciblage du gène d'intérêt à supprimer HXGPRT. A. La stratégie pour l'élimination du marqueur sélectionnable HXGPRT par un double croisement homologue d'événements de recombinaison dans la souche Δ ku80Δgoi :: HXGPRT utilisant une ~ 1 kpb 5 'ADN flanc de la cible et une ~ 1 kpb 3' ADN flanc cible sur pΔGOIc plasmide. La stratégie PCR pour la vérification du génotype est représenté en utilisant une paire d'amorces pour doser un produit de PCR (PCR5) qui s'étend sur la suppression (et non à l'échelle). B. Une paire d'amorces représentant conçu pour valider l'élimination du marqueur sélectionnable HXGPRT du GRA2 lieu dans la souche Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primaires GRA2 _CLF et GRA2_CxR amplifient PCR5. Primaires lire à partir de 5 'à 3' panneau C. représentatif. des clones 6TX résistants qui peuvent être obtenus suite à la transfection de plasmide dans pΔGOIc Δ ku80Δgoi :: HXGPRT et la sélection dans 6TX. Les clones 4, 7, 9, 11 et 12 présentent le profil de bandes de PCR5 correcte qui correspond à la délétion ciblée du marqueur HXGPRT (~ 1,2 kpb produit qui s'étend sur «flanc avec léger recouvrement avec l'extrémité 5 'du flanc 3 et l'extérieur de l'extrémité 3' flanc). Les clones 1, 2, 3, 6, 8 et 10 (cette bande est la lumière) représentent le motif de bandes attendue de l'ordre de ~ 3,4 kbp qui correspond au génotype de clone parental, même si ces clones présentaient un degré de résistance au 6TX qui ont permis leur choix (ce phénotype peut parfois survenir spontanément par l'arrêt de l'expression HXGPRT (voir la note dans le protocole 2.1 (étape 8) et l'article Résultats de représentant). (c = contrainte de contrôle parental Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = marqueurs de taille).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 4
Figure 4. Conception d'une molécule d'ADN de ciblage pour marquer l'extrémité C-terminale d'une protéine. Cette stratégie repose sur la capacité du marqueur HXGPRT à fonctionner aussi comme région de régulation en aval 3 '. L'épine dorsale de pΔGOItag est le vecteur pRS416 navette contenant l'uracile (URA) et l'ampicilline (AMP) marqueurs sélectionnables. Placée dans pRS416 est une ~ 1 kpb 5 'ADN flanc cible amplifié à partir d'ADN génomique avec chevauchement pour la cassette de minigène HXGPRT et pRS416 utilisant le FGOI et rtag amorces, une ~ 1 kpb 3' ADN flanc cible est amplifiée à partir d'ADN génomique avec chevauchement pour la cassette mini-gène HXGPRT et pRS416 utilisant le F2 et R2amorces et la cassette mini-gène HXGPRT. L'ADN 5 'flanc cible remplace le codon de terminaison de l'étiquette (HA, Myc, His, etc), suivi par un codon de terminaison de remplacement. AMP + X sélection intègre le tag C-terminal et un HXGPRT aval, et déplace la 3 'UTR d'une position à la suite du marqueur HXGPRT. Les sites de digestion par des enzymes de restriction uniques suivants sont ajoutés aux amorces: RE.X (l'enzyme de restriction site de coupure X) dans la couche de fond FGOI pour couper le plasmide à l'extrémité 5 'de l'extrémité 5' ADN flanc cible, et dans le RE.Y R2 apprêt à couper le plasmide à «la fin de la 3 'du 3 ADN flanc cible, et RE.Z dans le rtag et amorces F2 pour exciser la cassette mini-gène HXGPRT pour une utilisation pour la construction du plasmide de re-cibler le locus du gène marqués à supprimer le marqueur HXGPRT qui rétablira le placement de la 3 'UTR.

Discussion

Ici nous fournissons un protocole de gène ciblage efficace dans Δ Ku80 souches de parasites afin de permettre la récupération efficace de la descendance génétiquement manipulés qui possèdent des suppressions ciblées de gènes, les remplacements de gènes et / ou de gènes marqués. L'exécution séquentielle de ces méthodes permet une approche fiable pour l'isolement de mutants de parasites qui contiennent des manipulations génétiques ciblées simples ou multiples 3.1. Alors que la génération d'une délétion ciblée dépend de multiples facteurs, l'utilisation de la souche Δ Ku80 avec la stratégie présentée et le protocole augmente considérablement l'efficacité et la facilité de faire des souches mutantes définies précisément de T. gondii pour les études de génomique fonctionnelle.

Le génome de T. gondii durant les stades asexués est haploïde. Ainsi, une étude à faire lors de la planification de supprimer un gène est que le gène ne doit pas être indispensable in vitro. Néanmoins, l'efficacité de la targeTing KO gènes dans Ku80 souches Δ est extrêmement élevé, ce qui permet l'isolement de souches mutantes avec des taux de réplication avec facultés affaiblies de manière significative. Si un gène ciblé est essentiel, parasites cessent souvent à reproduire lors de la sélection. Un autre facteur essentiel dans la manipulation génétique ciblée est que l'homologie parfaite avec au moins 620 pb du flanc ciblage génomique est nécessaire pour obtenir des intégrations ciblées détectables 2. Régions plus d'homologie produisent des rendements plus élevés du ciblage et de l'aide ciblant les flancs d'ADN d'environ 1000 paires de bases est une méthode fiable et efficace 1-4. Pour cette raison, il est important que les flancs ciblant génomiques sont générées à partir de la même souche de T. gondii (RH, Pru) que la souche qui est génétiquement manipulée. Le manque d'homologie suffisante peut souvent se traduire par l'intégration ciblée d'un flanc de ciblage génomique, mais pas l'autre. Intégration incomplète ou défaut d'obtenir une maîtrise de finaley soyez aussi en raison de la persistance épisomal. Immédiatement après transfection, toutes les molécules de ciblage sont non intégrés qu'épisomes, et parfois molécules ciblant peut persister tant qu'épisomes pour de nombreuses générations. Utilisation de flancs d'ADN cible d'environ 1 kpb et de continuer à faire passer les parasites sous sélection avant ré-sous-clonage a souvent des problèmes liés à la persistance épisomique.

Une fois un coup de grâce est validée et le marqueur HXGPRT est enlevé, la stratégie de ciblage de gène peut être répété sur une deuxième GOI pour générer de multiples suppressions de gènes dans une souche de parasite unique 1-3. La génération des suppressions, des remplacements ou des gènes marqués peut également être réalisé en utilisant différents marqueurs sélectionnables (bléomycine, CAT, pyriméthamine résistant DHFR, etc.) Bien que le CAT marqueur de sélection est actuellement présent dans le type II Δ Ku80 Pru génome 1, ce marqueur peut être enlevé en utilisant le HXGPRT HXGPRT est le plus sûr et le marqueur le plus efficace avec l'efficacité du ciblage le plus élevé où une seule copie insertion ciblée est suffisante pour la sélection robuste MPA + X moyenne. HXGPRT fournit également la seule approche actuellement utile pour la suppression ciblée d'un marqueur de sélection (figure 3) à l'aide de 6 thioxanthine (6TX) 2,3 sélection. Ainsi, ce protocole constitue la seule approche actuelle pour le développement de souches mutantes définis avec plusieurs manipulations génétiques ciblées.

Ce protocole fournit une méthode utile et efficace pour la manipulation génétique ciblée dans Δ Ku80 souches de Toxoplasma gondii et est applicable à l'analyse d'un seul gène, une famille de gènes, ou des études de génomique fonctionnelle du génome entier. Avant la disponibilité de Δ Ku80 souches 1,2, ces approches ne sont pas largement faisable en raison de l'INEFficiency de ces méthodes. Par conséquent, ce protocole est largement applicable pour la manipulation génétique ciblée de Toxoplasma gondii et est accessible à tous les chercheurs intéressés à relever un certain nombre de questions sur la biologie du parasite, la réponse de l'hôte, et la génomique fonctionnelle.

Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH à DJB (AI041930, AI073142, AI075931 et AI091461).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Overlap Primers Integrated DNA Technologies 4 nmole Ultramer DNA oligos
Validation Primers Integrated DNA Technologies 100 nmole DNA Oligo
Yeast Strain #90845 ATCC Designation FY834
Shuttle Vector pRS416 ATCC 87521
DH10B E. coli Invitrogen 12033-015 SOC broth in kit with E. coli
Resuspension Buffer Qiagen Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit
Miniprep Kit Qiagen 27104 QIAprep Spin Miniprep Kit
Glass Beads Scientific Industries SI-BG05 0.5 mm acid-washed
Qiacube Automated Robotic Work Station Qiagen
Electroporation Cuvette USA Scientific 9104-5050 2 mm-gap
BTX600 electroporator BTX
Maxiprep Kit Qiagen 12662 QIAprep Spin Maxiprep Kit
25 cm2 Canted neck plug seal flask Corning 430168
150 cm2 Canted Neck plug seal flask Corning 430823
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells ATCC SCRC1041
Swin-lok Filter Holder Whatman 420200 25-mm-diameter
Membrane Whatman 110612 Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter
Mycophenolic acid (MPA) Sigma
Xanthine (X) Sigma
96-well Tissue Culture Tray Corning Costar
24-well Tissue Culture Tray Corning Costar
MEM Eagle Media Lonza Biowhittaker 12-611F
Fetal Bovine Serum Gibco 26140-111
Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti) Gibco 15240-062
Spin Column Primm Labs PAE-100 Easy Clean DNA Extraction Spin Kit
T4 DNA Ligase New England Biolabs
6-thioxanthine Acros Organics
Tissue DNA Minikit Qiagen 51104 QIAamp DNA Blood Mini Kit
Cell Culture Freeze/Recovery Media Gibco 126-48-010
Phosphate Buffered Saline Hyclone SH30028.02 minus calcium, minus magensium

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References

  1. Fox, B. A., et al. Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection. Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).
  2. Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).
  3. Fox, B. A., Bzik, D. J. Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii. Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).
  4. Hortua Triana, M. A., et al. Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).
  5. Kim, K., Weiss, L. M. Toxoplasma gondii: the model apicomplexan. Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).
  6. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).
  7. Kim, K., Weiss, L. M. Toxoplasma: the next 100 years. Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).
  8. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).
  9. Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility. Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).
  10. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).
  11. Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA. Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).
  12. Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii. PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).
  13. Szatanek, T., et al. Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).
  14. Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation. J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).
  15. Donald, R. G., Roos, D. S. Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis. Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).
  16. Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine. Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).
  17. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).
  18. Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast. Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).
  19. Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation. Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).
  20. Roos, D. S. Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).
  21. Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).
  22. Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).
  23. vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival. Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).
  24. Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine. Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).
  25. Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion. Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).

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Rommereim, L. M., Hortua Triana, M. A., Falla, A., Sanders, K. L., Guevara, R. B., Bzik, D. J., Fox, B. A. Genetic Manipulation in Δku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (77), e50598, doi:10.3791/50598 (2013).

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