Genetisk manipulering i Published: July 12, 2013 doi: 10.3791/50598

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Leah M. Rommereim¹, Miryam A. Hortua Triana¹, Alejandra Falla¹, Kiah L. Sanders¹, Rebekah B. Guevara¹, David J. Bzik¹, Barbara A. Fox¹

¹Department of Microbiology and Immunology, The Geisel School of Medicine at Dartmouth

Summary

Her rapporterer vi en metode for å bruke type I og type II

Abstract

Målrettet genetisk manipulasjon hjelp homolog rekombinasjon er metoden for valg for funksjonell genomisk analyse for å få en detaljert visning av gen-funksjon og fenotype (s). Utviklingen av mutantstammer med målrettede genet slettinger, målrettede mutasjoner, supplert genet funksjon, og / eller kodede gener gir kraftige strategier for å løse gen-funksjon, spesielt hvis disse genetiske manipulasjoner kan være effektivt målrettet til genet locus av interesse å bruke integrering mediert ved å dobbeltklikke krysse over homolog rekombinasjon.

På grunn av meget høy forekomst av ikkehomologe rekombinasjon, funksjonell analyse av genomisk Toxoplasma gondii tidligere har vært begrenset av fravær av effektive metoder for målretting genet slettinger og gen utskiftinger til spesifikke genetiske loci. Nylig avskaffet vi de store vei av ikkehomologe rekombinasjon i type I og type II stammer av T. gondii ved å slette genet encoding den KU80 protein ^1,2. De Δku80 stammer oppføre seg normalt under tachyzoite (akutt) og bradyzoite (kroniske) stadier in vitro og in vivo, og oppviser en tilnærmet 100% hyppighet av homolog rekombinasjon. De Δ ku80 stammer gjør funksjonelle genomisk studier gjennomførbart på enkelt gen samt på genomet skala ^1-4.

Her rapporterer vi metoder for bruk av type I og type II Δku80Δhxgprt stammer å avansere gene targeting tilnærminger i T. gondii. Vi skissere effektive metoder for å generere genet slettinger, Gene utskiftninger, og tagget gener ved målrettet innsetting eller sletting av hypoxanthin-xanthine-guanin phosphoribosyltransferase (HXGPRT) seleksjonsmarkør. Den beskrevne gene targeting protokollen kan brukes på en rekke forskjellige måter i Δku80 stammer å avansere funksjonell analyse av parasitten genomet, og for å utvikle enkle stammer som bærerflere målrettede genetiske manipulasjoner. Anvendelsen av denne genetiske metode og etterfølgende fenotypiske analyser vil avdekke fundamentale og unike aspekter av biologien til T. gondii og relaterte betydelige menneskelige patogener som forårsaker malaria (Plasmodium sp.) og cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Introduction

Toxoplasma gondii er en vanlig obligat intracellulær protozoan parasitt som ofte og kronisk infiserer et bredt utvalg av dyr og mennesker ^5. Det er anslått at mer enn 1 milliard mennesker er i dag og kronisk infisert av dette patogenet. I tillegg til viktigheten av sykdom forårsaket av T. gondii infeksjon, økt tilgjengelighet av eksperimentelle verktøy, kraftige genomikk ressurser ^6, enkel in vitro vekst og gode musemodeller har gjort T. gondii en ledende modellsystem for det bredere studie av intracellulære eukaryote patogener og andre vesentlige apicomplexan parasitter som forårsaker ødeleggende sykdommer som malaria (Plasmodium sp.) og cryptosporidiosis (Cryptosporidium) ^5,7. En vesentlig begrensning av Toxoplasma gondii som modell organisme har vært ineffektiv gjenvinning av avkom som bærer målrettet genetiske manipulasjoner. Dette problemområderm i genet targeting er på grunn av en lav frekvens av homolog rekombinasjon i forhold til den meget høye frekvens av ikkehomologe rekombinasjon i villtype-stammer av T. gondii selv når omfattende DNA-homologi er gitt i DNA-mål-molekyler som benyttes i genetiske studier ^2.

Vi har nylig genetisk blokkert den viktigste veien for ikkehomologe rekombinasjon i type I og type II stammer av Toxoplasma gondii ved å slette genet som koder for KU80 protein ^1,2. Den resulterende type I og type II Δ ku80 stammer oppviser normale vekstrater, størrelse og oppførsel både in vitro og in vivo under tachyzoite og bradyzoite stadier in vitro og in vivo, er imidlertid disse stammer oppviser en tilnærmet 100% hyppighet av homolog rekombinasjon og denne fenotype øker sannsynligheten for raskt å isolere ønsket avkom av målrettede genetiske manipulasjoner med flere hundre til flere thousand-fold ^1,2,4. Nylig community-utstrakte bruken av type I og type II Δ ku80 stammer har betydelig trappet opp tempoet, variasjonen, samt suksessrate på målrettede genetiske tilnærminger i T. gondii ^1-4,8-13. Her beskriver vi en omfattende protokoll for målrettet genet sletting, genet utskifting, og genet tagging i Δ ku80 stammer av T. gondii. Vi demonstrerer hvordan å designe og pålitelig målrette genetiske manipulasjoner til bestemte gener eller genetiske loci i Δ ku80 stammer av Toxoplasma gondii.

Protocol

En. Gene Målrette å slette en Gene of Interest

Denne protokollen er utformet for effektiv generering av en mutant stamme som har en målrettet genet sletting ved en definert genetisk locus. Den tidligere beskrevne T. gondii hypoksantin-xanthine-guanin phosphoribosyltransferase (HXGPRT) seleksjonsmarkør er brukt i denne protokollen for sikker og pålitelig markør innsetting etter mykofenolsyre og xanthine (MPA + X) utvalg ^14-16. Denne protokollen benytter en validert og kostnadseffektiv metode for å konstruere DNA målretting molekyler basert på gjær recombinational kloning ^17,18. Flere alternative protokoller er kommersielt tilgjengelig for bygging av rekombinant målretting molekyler ved hjelp av bakterielle recombinational kloning metoder, in vitro recombinational kloning metoder, eller fusion PCR. Protokollen er beskrevet nedenfor gir høyest samlet effektivitet og pålitelighet for å utvinne klonet parasites besitter en målrettet genet sletting i Δ ku80 stammer av T. gondii.

1.1 Utarbeidelse av målretting DNA

1. Tilgang ToxoDB ⁶ ( http://www.toxodb.org ) for å oppnå genomiske sekvenser til genet av interesse (GOI).

Merk: Genomiske sekvenser bør innhentes fra Type I, II eller III genomsekvens i ToxoDB database som er nærmest den belastningen blir manipulert. For eksempel: GT1 for RH og ME49 for Pru.

2. Design bestemte overlapping primere som forsterker 5 'og 3' genomisk rettet mot flankene av genet av interesse (GOI) som omfatter en 33 bp overlapping med gjær shuttle vektor pRS416 (eller alternativt pRS426) og innlemme en 33 bp overlapping med valgbar markør ( HXGPRT) (Tall 1A-B). Legg et unikt restriksjonsenzymsete i hver primer i begge ender av den 5 'and 3 'genomisk rettet mot flankene, plassert mellom de 33 bp overlapping, og T. gondii-spesifikk primer-sekvens (er) (figur 1A-B).

Bemerk: En større enn 30 bp overlapping er nødvendig for effektiv gjær rekombinasjon kloning. De 5 'og 3' genomisk målretting flanker er utformet for å forsterke spesifikke DNA fragmenter mellom 800 og 1400 bp som definerer en målrettet sletting. Vær oppmerksom på at kortere flankene vil redusere målretting effektivitet i Δ ku80 Δ hxgprt bakgrunn ^2.

3. PCR forsterke 5 'target flanke bruke primere F1 og R1, og PCR forsterke 3'-target flanke ved hjelp av primer F2 og R2 (figur 1A-C) fra genomisk DNA ^tre. Separat, PCR forsterke ~ 2 KBP HXPGRT genet inkludert tilknyttede 5 'og 3' dhfr flankerer regioner av HXGPRT cDNA pminiHXGPRT kassett ¹⁴ bruker primere HXF og HXR(Fig. 1B-C).

Merk: Forsterke målet flankene med genomisk DNA fra foreldrenes belastning å bli tilført.

Merk: Plasser HXGPRT markør i forover orientering i forhold til den 5 'og 3' DNA målretting flankene for å lette påfølgende effektive genetiske manipulasjoner, slik som målrettet fjerning av HXGPRT fra forstyrret locus.

4. Verifisere korrekte PCR-produktet størrelser ved agarose-gelelektroforese og estimere DNA-fragment under anvendelse av agarosegel-standarder eller en annen metode for å bestemme DNA-konsentrasjon.
5. Generere kompetente gjær porsjoner som beskrevet i Gietz og Schiestly ^17.
6. Kombiner 50 ng av 5 'genomisk målretting flanke, 50 ng 3' genomisk målretting flanke, 100 ng av HXGPRT seleksjonsmarkør, og 50 ng av linearisert shuttle vector med sterilt _H2O for å oppnå et sluttvolum på 10 -20 pl. Transform kompetent gjær med de tre PCR-produkter og gjær-E. coli shuttle vektor for recombinational kloning hjelp av protokollen beskrevet av Gietz og Schiestly ^17. Plate transformert gjær på uracil-minus minimalt medium agarplater og inkuber ved 30 ° C i 2 - 3 dager.

Bemerk: Den beordret montering av plasmidet, 5'-target flanke, den HXGPRT markør, og den 3 'target flanke lettes av konstruerte 33 bp overlapping mellom DNA-fragmentene (figurene 1A-B) og er mediert av homolog rekombinasjon i gjær.

7. Harvest-gjær ved å tilsette 2 ml av 2x YPAD til uracil-minus-plater og forsiktig skraping å løsne kolonier uten å forstyrre agar. Sentrifuger gjær løsningen i 5 min ved 5000 xg og kast supernatanten.
8. Resuspender pelleten gjær i 250 ul av en buffer inneholdende resuspensjon RNaseA og tilsett 50 - 100 ul av encid-vasket glassperler til løsningen. Vortex i 5 min ved den høyeste hastighet til å knuse gjærcellene.
9. Tillat glassperlene faller til ro på bunnen av røret og supernatanten overføres til et 2 ml Eppendorf-rør.
10. Isoler gjær DNA ved hjelp av en Miniprep DNA isolering kit, resuspendering i et endelig volum på ~ 100 ul.
11. Bland 2 ul gjær DNA (~ 50 ng) med 40 pl av DH10B elektroporering kompetent E. coli holdt på is.
12. Overfør løsningen til et kjølt 2 mm gap elektroporering kyvette electroporate bakteriecellene ved 2,4 kV og 129 Ω.
13. Rescue celler ved å legge 0,8 ml SOC buljong til hver cuvette og overføring løsning til en 14 ml snap-cap Falcon tube. Inkubere cellene ved 37 ° C på en valse trommel i 40 - 60 min.
14. Plate E. coli på 2XYT + ampicillin (AMP) og platene inkuberes platene ved 37 ° C over natten.
15. Velg ~ 6-8 enkeltkolonier og vokse i 3 ml 2XYT + AMP til ~ 16 t ved 37 ° C.
E. coli-klone.
16. Isolere plasmid pΔGOI fra E. coli-kloner ved hjelp av en Miniprep kit, resuspendering i et endelig volum på ~ 100 ul.
17. Validere pΔGOI hjelp begrensning enzym fordøyer å måle DNA plasmid størrelse og verifisere den forventede pΔGOI DNA banding mønstre.
18. Sluttføre validering av pΔGOI av DNA sekvensering av 5 'og 3' genomisk målretting flankene for å kontrollere 100% DNA sekvens basert på genomsekvens data i http://www.ToxoDB.org .

Merk: I nærheten av perfekt sekvenshomologi er avgjørende for å maksimere gene targeting effektivitet ^tre siden hver basepar forskjellen utgjør et tilsvarende kutt i lengden perfekt homologi.

Merk: genomsekvens av type II Δku80 belastning basert på Pru foreldrenes stregn er ikke tilgjengelig på dette tidspunktet. Dette arbeidet bruker type II ME49 genomsekvens som surrogat genomet for den type II Δ ku80 belastning. Basert på sekvensdata ved flere genetiske steder, er det anslått at ME49 genomet og den Pru genom oppviser enkelt-nukleotid polymorfismer ved en frekvens på ~ en per 10.000 nukleotider, eller mindre.

20. Genererer> 200 mikrogram pΔGOI lager ved å inokulere en ~ 250 ml 2XYT + AMP natten kultur med glyserol aksjer fra en validert E. coli minipreparering klone.
21. Isoler pΔGOI plasmid-DNA fra den store kultur ved hjelp av en maxiprep DNA isolering kit, resuspendering i et sluttvolum på 1000 pl ~.
22. Gjenta begrensning enzym fordøyer, eller DNA sekvensering av pΔGOI maxiprep DNA for å kontrollere riktig målgruppe DNA molekyl før transfeksjon.
23. Linearize ~ 15 mikrogram pΔGOI på 5 'enden hjelp av den unike begrensning enzym X (RE.X)fordøye nettsted bygget inn i fem "target flanke (Tall 1B).

Merk: Gene targeting i T. gondii krever et minimum på ~ 10 pg av DNA-rettet til å skaffe en effektiv frekvens for å målrette annonsene hendelser på genet locus av interesse ^2..

24. Valider linearisering av pΔGOI og bestemme DNA-konsentrasjon ved agarose-gelelektroforese eller en alternativ metode.

Merk: Hvis begrensning enzym fordøyelsen på 5 'flanke ikke gir fullstendig linearisering, det utformet tre' kan unike RE.Y fordøye området brukes som et alternativt sted for linearisering av pΔGOI.

Merk: En helt lineært målretting DNA molekylet er avgjørende for vellykket gene targeting ved homolog rekombinasjon i Δ ku80 stammer.

25. Nøytralisere restriksjonsenzymet av incubating ved 68 ° C i 15 - 20 min.
26. Forbered minst 15 pg av linearisert plasmid i 100 mikroliter sterilt _H2O Butikken lineær pΔGOI ved -20 ° C inntil tidspunktet for transfeksjon.

1.2 Utarbeidelse av T. gondii parasitter, transfeksjon, valg, subkloning, validering, arkivering og vedlikehold av genetisk manipulerte stammer

Generelle metoder for kulturen og manipulering av T. gondii i menneskelige forhuden fibroblast (HFF) celler er beskrevet ^19-21. De Δ ku80 Δ hxgprt stammer replikere normalt i parasitt infeksjon medium (Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) vekst medium supplert med 1% kalvefosterserum (FBS) og 1% Anti-fungal-antibiotika utvannet fra en 100x lager) ^1,2. Alt arbeid med Toxoplasma gondii må utføres ved hjelp av biosikkerhet nivå to prosedyrer. T. gondii RHΔ ku80 ^to parental belastningen ble generert fra RHΔ hxgprt belastningen fra Roos Lab ^14. Den PruΔku80 ^en foreldrenes belastningen ble generert fra PruΔhxgprt (Pru gniaud belastning BSG-4 ²²⁾ som inneholder et stabilt integrert CAT valgbar markør og en grønn fluorescerende protein (GFP) reporter under kontroll av den bradyzoite scenen promoter LDH2.

1. Vaksinere en 25 cm ² kolbe som inneholder konfluerende HFF celler med 1 x 10 ⁶ levedyktig type I RH Δ ku80 Δ hxgprt parasitter, eller vaksinere to 25 cm ² kolber med 2 x 10 ⁶ levedyktig type II Prugniaud (Pru) Δ ku80 Δ hxgprt parasitter.

Merk: Levedyktige parasitter er definert som ekstracellulære parasitter som har fersk lysert ut.

Merk:

2. Inspiser Δ ku80 Δ hxgprt smittet kulturer ~ 68-72 timer etter infeksjon. Verifisere tilstedeværelsen av levedyktige parasitter og ~ 90 - 95% lysis av HFF celler til å planlegge den nøyaktige timingen av transfeksjon.

Merk: Isolering av fersk egressed parasitter er avgjørende for å lykkes med denne protokollen fordi lav parasitt levedyktighet vil avskaffe genet målretting effektivitet.

3. Agitere levedyktige parasitter i løsning ved å lukke plug-tetningen lokket på 25 cm ^2-kolbe og kolben ristes kraftig frem og tilbake for å agitere parasitter av av vekst overflate uten å sprute væske på innsiden av lokket eller halsen av kolben .

Merk: Parasitt avling krever ikke en sprøyte-nål frigjøring protokoll for den type I ellerType II Δ ku80 stammer.

4. Overfør den parasitt-løsning til en 10 ml sprøyte festet til en filterholder som inneholder et 3 mikrometer membran og plassere filterenheten på toppen av en åpen 15 ml skrukork-røret. Sprøyte filtrere parasittene inn i 15 ml skrukork tube.

Merk: Filtrering parasitter gjennom membranen fjerner infiserte celler og cellulært avfall.

5. Bestem parasitten konsentrasjon (tachyzoite skjemaer per ml) med en hemocytometer.

Merk: Valgfritt: Ved hjelp av parasitten løsning, sette opp en plakett forming unit (PFU) analysen ²¹ som vil bli lest 7-8 dager senere for å bestemme tilstrekkelig levedyktighet av transfekterte parasitter (PFU å tachyzoite forholdet mellom ≥ 0,2).

6. Pellet parasitter for 7 min ved 1400 xg og aspirer supernatanten til ~ 0,4 ml uten å forstyrre parasitten pellet. Spinn i 2 min på 1,400 xg og aspirate gjenværende supernatanten til ~ 0,01 ml uten å forstyrre parasitten pellet.
7. Resuspender pelleten parasitt ved å sveipe bunnen av røret, og umiddelbart tilføre cytomix ²³ buffer (1.33x konsentrasjon) til parasitten pellet for å oppnå en parasitt konsentrasjon av 4 - 5 x 10 ⁷ parasitter / ml cytomix.

Merk: Utelat tillegg av ATP og glutation til cytomix siden disse tilleggene ikke forbedre effektiviteten av genet målgruppe.

8. Tine 100 pl alikvot av det lineariserte pΔGOI fra protokoll 1.1 (trinn 26).
9. Overfør 0,3 ml av parasitten cytomix løsning (~ 1.3 til 1.6 x 10 ⁷ parasitter) til 100 mL av lineariserte pΔGOI fra protokoll 1.1 (trinn 26), og umiddelbart overføre hele 0,4 ml parasitt + pΔGOI blanding til en kjølt 2 mm gap elektroporering cuvette.
10. Electroporate parasitter på 1,4 kV og 24 Ω.
11. Rest transfeksjon kyvetten ved romtemperatur i ~ 5 min og deretter overføre hele innholdet i kyvetten transfeksjon inn i en 150 cm kolbe inneholdende ² konfluente HFF-celler med 30 ml infeksjon medium og inkuber den infiserte kulturen over natten.
12. Begynn seleksjon i mykofenolsyre + xantin (MPA + X) ~ 20 timer post-transfeksjon (figur 2A) ved å erstatte mediet med infeksjon MPA + X utvalg medium (MPA (25 ug / ml) og xantin (50 ug / ml) i infeksjon medium).

Merk: Du må ikke forstyrre incubating MPA + X utvalg kolbe.

13. Beregn det totale antall PFUs i MPA + X utvalg kolbe ~ 8 dager etter transfeksjon ved visuelt å inspisere monolaget. Verifisere tilstedeværelse av å utvikle PFUs og sunn soner av infeksjon ved lysmikroskopi.

Merk: Hvis plakk ikke er synlige etter dag 8, opprettholde utvalg og skjermen for tegn på smitteIon siden mutantstammer kan ha en redusert replikasjon hastighet.

Merk: Δ ku80 Δ hxgprt parasitt stammer har en ekstremt lav bakgrunn av uønskede nontargeted hendelser, som gjør det mulig for en vellykket isolering av mutantstammer med ganske alvorlig, men ikke dødelige vekst defekter. Hvis et gen er viktig, og det kan ikke slettes, den primære transfeksjon, eller senere vedtatt parasitt befolkningen, kan avsløre en fenotype der parasittene slutte å gjenskape under valget som befolkningen vedtar å målrettede knockouts.

14. Rist kolbe som i trinn 3 for å løsne ekstracellulære parasitter fra monolaget [etter synlige plakk har utviklet] for å generere en parasitt løsning. Transfer ~ 0,5 ml av parasitten løsning fra MPA + X utvalg kolbe til en 25 cm ² MPA + X utvalg kolbe som inneholder konfluerende HFF celler (utpeke denne kulturen pass 1A).
15. Løsne parasitts i de opprinnelige 150 cm ² MPA + X utvalg kolbe ~ 3 dager senere og overføring ~ 0,5 ml parasitt-løsning til et andre 25 cm ^{2 MPa} + X utvalg kolbe inneholdende konfluente HFF-celler (utpeke denne kulturen pass 1B).
16. Tillate soner på infeksjon å utvikle seg i pass 1A og / eller passere 1B kolber for ~ 5 dager. Visuell kontroll ved lysmikroskopi som passerer 1A og 1B kolber inneholde minimum 25 levedyktige PFUs med sunne soner av infeksjon.
17. Velg enten pass 1A eller pass 1B kolbe for videre passasje i MPA + X utvalg medium i 25 cm ² kolber. Opprettholde passasje i henhold MPA + X valg.

Merk: Parasitter må dyrkes for et tilstrekkelig antall generasjoner å slette ikke-integrerte vedvarende episomes fra befolkningen før subkloning. Ikke utfør subkloning før 20 dager etter transfeksjon for type I RH Δ ku80 Δ hxgprt, eller før 25 dager etter transfeksjon fortype II Pru Δ ku80 Δ hxgprt parasitter å gi tilstrekkelig tid til å fortynne ikke-integrerte episomes ^1,2.

18. Subclone parasitter i en 96-vel magasinet som inneholder konfluerende HFF celler med MPA + X utvalg medium. Tilbered en skuff i en konsentrasjon på 1 parasitt / brønn, og et andre magasin ved en konsentrasjon på 2 parasitter / brønn.

Merk: subklon parasitter som nylig har lysert (~ 90 - 95% av HFF celler i 25 ^cm2 kolbe) for å sikre at de parasitter har høy levedyktighet.

Merk: Den optimale tidsramme post-transfeksjon for subkloning ble etablert ved å måle hvor raskt lykkes målrettede parasitter oppstår på en høy frekvens i den valgte befolkningen ^en.

19. Fortsett til passasjen den primære befolkningen i transfekterte parasitter i MPA + X utvalg medium med en ukentlig passasje tidsplan for å infisereen 25 cm ^to HFF kolbe med 10 ul av parasitt-løsning.

Merk: Hvis kloner som bærer målrettet genet sletting (knockouts) ikke er hentet fra den første subkloning i trinn 18, resubclone parasitter fra kontinuerlig vedlikeholdes befolkningen ~ 10-12 uker etter transfeksjon.

Merk: En av grunnene til et gen sletting er ikke innhentet oppstår fra episomal utholdenhet av noen pΔGOI plasmider. Episomal utholdenhet bestemmes av sekvensene som finnes i 5 'og 3' genomisk rettet mot flankene og ser ikke ut til å oppstå fra HXGPRT genetisk element. Ca 5 - 10% av målretting plasmider viser betydelig episomal utholdenhet som nødvendiggjør et senere tidspunkt av subkloning å la parasitten befolkningen et tilstrekkelig antall generasjon ganger for å fortynne vedvarende episomes og løse befolkningen primært stabile integranter.

Resultat 96-brønns brett 6 - 7 dager etter subkloning (Type I parasitter) eller 7-8 dager etter subkloning (type II parasitter) for brønner som inneholder en enkelt PFU, identifisert som en enkelt sone av infeksjon i lysmikroskopi ved enten 40X eller 60X makt. Mark et lite punkt på 96-brønns brett lokk for å utpeke plasseringen av PFU i brønnen.
1. Bland innholdet i hver brønn inneholdende en enkelt PFU ved hjelp av en pipette satt til 50 ul (200 ul tip) ved å rette fluidstrøm over PFU å dispergere parasitter i brønnen.

Merk: Blanding brønnen akselererer parasitten lyse av HFF monolayer. Type I RH-stammer vil lyse brønnen ~ 4 dager etter blanding, blir type II Pru parasitter lyse brønnen ~ 5 dager etter blanding.

22. Velg et dusin lysert brønner (kloner) og bunnen langs bunnen av hver av disse lyserte brønner ved hjelp av en 0,5 - 10 mL pipettespiss samtidig som det trekkes opp 6 pl av parasitt-løsning. Transfer den 6 ul av parasitten løsning til en brønn i en 24-vel magasinet som inneholder konfluerende HFF cellene i 1 ml MPA + X utvalg medium.

Merk: Det er viktig å skrape bunnen av brønnen for å holde åpningen boringen i pipettespissen i konstant kontakt med parasitter som oppholder seg på bunnen av brønnen.

23. Overvåke 24-vel skuffen for lyse av de HFF celler.

Merk: Type I RH parasitter vil typisk lyse brønnen i 24-brønnen format i ~ 4 dager. Type II Pru parasitter vil typisk lyse brønnen i ~ 5 dager.

24. Overføring 2 mL av levedyktig parasitt løsning skrapet fra bunnen av hver brønn i 24-brønns-format til den tilsvarende brønn i en ny 24-brønns brett inneholdende konfluente HFF-celler og 1 ml MPA + X utvalg medium per brønn.

Merk: Alle parasitter kloner og linjer kan være kontinuerlig viktigsteopprettholdes ved å passere to ul av levedyktig parasitt løsning hver 7. dag i denne 24-brønnen skuffen format.

25. Kontroller at parasitter er blitt overført til en ny 24-vel skuffen ved å visuelt inspisere med lysmikroskopi ~ 18 timers post-passasjen.
26. Høste parasitter fra lyserte brønner på 24-brønnen skuffen fra trinn 23-24 ved hjelp av enten en 1 ml eller 10 ml pipette og overføre parasitten løsning på en Eppendorf tube.
27. Pellet parasittene ved 1400 x g i 7 min, skylles en gang i 1 ml fosfat-bufret saltvann (PBS), og pelleten på nytt ved 1400 x g i 3 min.
28. Sug PBS fra bunnfallet, deretter tilsett 200 pl av PBS til pelleten for å resuspendere parasitter. Fryse parasitten løsning ved -80 ° C inntil DNA-isolasjon.
29. Isolere parasitten DNA fra hver klone med en vev DNA Minikit.
30. Validere målrettet genet sletting (knockout) ved PCR ved hjelp av validering primere (Tall 2A-C). Test forFraværet av den funksjonelle kodende region av genet av interesse, og ved hjelp av oppstrøms-og nedstrøms CXF CXR genomisk DNA primere (figurene 2A-B) test for tilstedeværelse av PCR-produkter som spenner over de genomiske målretting flankene og HXGPRT om riktig 5 'og 3 "målrettet integrering av HXGPRT genet i den slettede genet locus.

Merk: primere for valideringen må være unikt til genet av interesse eller et falskt positivt resultat kan oppnås. Grunning design kan valideres på http://www.toxodb.org ved sprengning primer sekvenser til genomet (e) for å verifisere primere er unike.

31. Passasje parasitt kloner på en ukeplan som beskrevet i trinn 24. Når målrettet sletting er validert, er fortsatt utvalget i MPA + X valgfritt.
32. Arkiv parasitt kloner ved å forberede fryser aksjer. Pellet ekstracellulære parasitterfra lyserte HFF celler i en 25 cm ² kultur kolbe, fjerne media og forsiktig resuspender parasitt pellet i cellekultur frysemedium på en parasitt konsentrasjon> 4 x 10 ⁷ parasitter per ml. Overfør delmengder til cryovials og lagre parasitter på ubestemt tid i flytende nitrogen, eller ved -80 ° C.

2. Sletting av HXGPRT

Denne protokollen er designet for å fjerne HXGPRT markør fra sin integrering området i genomet av en genetisk manipulert Δ ku80 belastning. Fjerning av HXGPRT tillater markør utvinning og produksjon av stammer med flere genetiske manipulasjoner med bare valg basert på HXGPRT ^1-3. Mens protokollen beskrevet nedenfor beskriver metoden for å re-målrette et geometrisk sted for å slette HXGPRT, bør det bemerkes at fjerning av HXGPRT ved gen locus av interesse også tillater samtidig re-integrasjon av villtype-genet (complementation), re-integrasjon av et mutert gen, samt re-integrering av et kodet gen-(N-eller C-terminale GFP, ha-koden, etc,), slik at for en rekke genetiske manipulasjoner. Virkningsmekanismer ²⁴ og målretting protokoller som bruker 6-thioxanthine valg har blitt beskrevet tidligere ^1-3,15.

2.1 Slett HXGPRT

1. Avgiftsdirektoratet HXGPRT seleksjonsmarkør fra pΔGOI ved å fordøye med RE.Z å kutte på de unike restriksjonsenzymseter flankerer HXGPRT (figur 1B).
2. Kontroller komplett fordøyelse av DNA ved agarosegel-elektroforese. Isoler den største av de to båndene fra agarosegel.

Bemerk: Den største av de to båndene inneholder plasmidet sammen med 5 'og 3' DNA-mål flanker, men ikke den HXGPRT genet.

3. Plasser agarose delen inneholder større DNA bandet i en spin kolonne laying gelen flate på membranen. Spinn kolonnen ved 13.000 x g i 4 minutter ved RT. Legg sterilt _H2O til gjennomstrømningskanalen for å bringe volumet til 100 pl.

Merk: Andre kommersielle metoder for å isolere DNA fra agarose.

4. Konsentrer DNA ved EtOH nedbør, resuspending DNA i et endelig volum på 18 ul sterilt _H2O
5. Bland 1 mL av konsentrert DNA med 7 ml _H2O, 1 pl 10x ligering buffer og 1 pl T4 DNA-ligase (5 enheter) og plassere den reaksjon ved 4 ° C over natten for å generere pΔGOIc (pΔGOIclean) (Figur 3A).

Merk: DNA-fragmenter med RE.Z som inneholder DNA-endene kan utformes og inkludert på dette trinnet for å lage plasmider egnet for målrettet re-integrasjon av vill-type genet (complementation), målrettet re-integrasjon av en mutant gen samt målrettet re-integrasjon av et kodet genet(N-eller C-terminal GFP, HA tag, etc.).

6. Fortynne reaksjon 2x med steril H ₂ O før electroporation.
7. Transform pΔGOIc i E. coli som i protokollen 1,1 til subclone, isolere og validere målretting plasmid. Deretter linearize pΔGOIc i forberedelse til transfeksjon (se trinn 1.1.11 til 1.1.26).
8. Gjenta parasitten transfeksjon protokollen som beskrevet i protokollen 1.2 (trinn 1-11).

Merk: Før gjennomføre trinn 1 til 8, må du kontrollere at målrettet fjerning av HXGPRT er gjennomførbart i mutant belastningen. Infisere en 150 cm ² kolbe konfluerende HFF celler med 1 x 10 ⁶ tachyzoites av mutant belastningen med 6-thioxanthine (6TX) valg medium (200 mikrogram / ​​ml 6TX i infeksjon medium) og plasser kolben i et PFU-analysen. Inspisere flasken åtte dager senere for å kontrollere at ingen (eller svært få, <10) PFU er synlige, som er avgjørende for å fastslå at potenrende gene targeting effektivitet vil overstige eventuelle spontan reversering av mutant belastningen til en fenotype med redusert HXGPRT uttrykk (et 6TX motstand fenotype).

Merk: Ca 5 - 10% av HXGPRT integrering områder viser en betydelig og spontan frekvens av 6TX motstand selv om HXGPRT markør er fortsatt integreres ved målrettede området (se Representant Resultater avsnitt for forklaring).

9. Begynn 6TX utvalg ~ 20 timer post-transfeksjon ved å endre mediet i 150 cm kolbe ² til 6TX utvalg medium.

Merk: Ikke forstyrr kolben for ~ 10 dager etter transfeksjon.

10. Inspisere flasken for PFU-formasjonen på dag 10-12 etter transfeksjon (type I parasitter) eller dag 10 - 16 post-transfeksjon (type II parasitter).

Merk: Parasites blir målrettet for sletting av HXGPRT vil ikke begynne å vokse under 6TX valg til HXGPRT genet og mRNA blir slettet, og den gjenværende HXGPRT protein er inaktivert.

11. Rist utvalg kolbe for å skape et parasitt-løsning, og overføring 0,5 til 1,0 ml av parasitten løsning til en ny 25 cm ^2-kolbe inneholdende konfluente HFF-celler og 5 ml 6TX utvalg medium. Gjenta overføringen fra de primære 150 cm ² til nye 25 cm ² kolber en gang om dagen i to dager.

Merk: Flere prøvetaking øker sjansene for å fange levedyktige målrettede parasitter som har mistet HXGPRT genet.

12. Inspiser 25 cm ² kolber ~ 5 dager etter smitte å bekrefte tilstedeværelse av å utvikle PFUs med soner av sunne reproduserende parasitter. Pick en eller to kolber inneholdende soner av infeksjon.

Merk: HXGPRT genet replikere til en normal vekst i 6TX utvalg.

13. Fortsett til passasje parasitter i 6TX utvalg medium.
14. Subclone parasitten befolkningen etter 25-30 dager etter valget. Sett opp en 96-brønners brett med ~ en parasitt / brønn og en annen med ~ 2 parasitter / brønn.
15. Forbered parasitt-DNA fra isolerte kloner og kloner vedlikeholde i en 24-brønns format kultur ifølge fremgangsmåte 1.2 (trinnene 19-29).
16. Validere sletting av HXGPRT ved PCR ved hjelp av strategien skissert i figur 3A-B.

3. C-terminal Tagging av Proteiner

Denne protokollen er designet for C-terminal merking av proteiner ved å målrette den koden for integrasjon via dobbel kryss over homolog rekombinasjon på genomisk locus av genet ved hjelp av MPA + X valg ^2,4. Denne protokollen arbeider effektivt fordi den 5 'DHFR-sekvensen til det 2,4.

3.1 Direkte C-terminal merking av proteiner ved endogene genetiske steder

1. Lag målretting pΔGOItag plasmidkonstruksjonen bruke gjær recombinational kloning (figur 4) og metodene som beskrives i protokollen 1.1. 5 'genomisk målretting flanke inneholder de siste 800 til 1200 bp av koding regionen (eller genomisk DNA) i GOI, unntatt oppsigelse kodon flyttes til en posisjon 3' til koden av valg (HA tag, Myc tag, Hans tag , osv.)
2. Lag målrettet innsetting av den C-terminale kode på endogene lokus av protein-kodende genet ved å følge trinnene i protokollen 1.1 og 1.2 ved hjelp av strategien beskrevet (figur 4).
3. Bekreft innsetting av C-terminal tag på den endogene genet locus ved hjelp av PCR-strategi.
4. Retarget genet locus etter metoder beskrevet i protokoll 1 og protokoll 2 til delete den HXGPRT valgbar markør for å skape et presist regulert endogene genet locus som uttrykker en tagget protein. Denne protokollen også gjenoppretter det HXGPRT selekterbar markør som kan brukes på nytt for å målrette et annet locus i det kodede stamme (se protokoll 1).

Representative Results

En detaljert mal er gitt for å konstruere et plasmid rettet til å slette et gen, herunder plassering av restriksjonsenzymseter og generering av de primere som letter genetisk målretting og validering av genet målretting, så vel som plasmid-konstruksjon for den etterfølgende sletting i et HXGPRT single-trinns prosess (figur 1A-C, figur 2A, figur 3A). En generell skjematisk er presentert for å lage en målrettet genet sletting (figur 2a), primerpar benyttet for å validere sletting av en utstansing, for eksempel, er type I rop18 (figur 2B), og representative resultater av PCR validering vist (figur 2C). Denne representanten Resultatet vises for å illustrere omfanget av resultater som kan oppnås ved genetiske loci som er relativt vanskelig å målrette. En vellykket målrettet genet sletting vil resultere i fravær av genet av iterest PCR-produkt (PCR 1), tilstedeværelse av 3'-genomisk målretting flanke (PCR2), og tilstedeværelsen av den HXGPRT selekterbar markør ordentlig integrert mellom 5 'og 3' genomisk målretting flanker som definerer slettingen (PCR3 og PCR4) . Kloner 3, 4, 5, 6, 8, 9 og 11 er validert målrettede genet slettinger (knockouts) hvor HXGPRT har erstattet den GOI (figur 2C).

En klone som ikke inneholder et gen sletting kan representeres ved en rekke båndmønstre. Vanligvis vil en klone uten genet sletting speile foreldrenes stamme (foreldrenes mønster) med band observert for PCR1 og PCR2, men ikke for PCR3 eller PCR4 sett for kloner 1 og 2 (figur 2C). Denne "foreldrenes mønster" oppstår fra noen potensielle mekanismer. Av og MPA resistente utvalgte parasitter bære ikke-integrerte vedvarende episomes av pΔGOI rettet plasmid, og noterer vi at fortsatt valg ofte tvinger disse episomeså integrere. Vi har også observere noen sjeldne bakgrunn i type I Δ ku80 belastning på grunn av utilsiktet integrering av pΔGOI målretting plasmid, som inneholder et HXGPRT cDNA uttrykt via DHFR 5 'og 3' promoter elementer, enten i det DHFR-lokus eller inn i den delvis slettet HXGPRT locus ^14. Mens denne sjeldne hendelsen er en målrettet integrasjon, var det ikke den tiltenkte integrering og fungerer som et sentralt punkt å huske når du designer et gen erstatning strategi. DNA homologi større enn 120 bp gjennomført på pΔGOI målrettingen plasmid kan gi et alternativt sted for rekombinasjon i Δ ku80 stammer ^to som kunne gi tilbake en uønsket bakgrunn. I type II Pru Δ ku80 belastningen denne bakgrunn er redusert eller ikke-eksisterende forhold til type I fordi HXGPRT seleksjonsmarkør er basert på type I sekvenser som har nukleotid polymorfismer sammenlignet med type II DNA somreduserer denne sjeldne bakgrunn i eksperimenter med den type II Pru Δ ku80 belastning ^en. Hvis et gen locus er viktig (kan ikke slettes), eller har en ekstremt lav gene targeting frekvens på locus, eller om vedvarende [ikke-integrerte] episomes er ikke lett elimineres via vekst og utvalg, vil dette foreldrenes mønster dominere mønster observert i MPA resistente kloner. Alternativt er rettet mot DNA-molekylet noen ganger observert å integrere ved bare den 5 'eller 3'-genomisk målretting flanke og et band er observert for enten PCR3 eller PCR4 (men ikke begge) sammen med PCR1 og PCR2 som sett for klon 10 (5 'integrasjon) og klone 7 (3' integrasjon) (figur 2C). Disse mønstrene foreslå sjeldne forekomsten av et enkelt kryss over integrering av målretting plasmid ved locus som integrerer HXGPRT men dette målrettet integrering slettes ikke genet av interesse. Dette mønsteret (baner 7 og 10 i figur 2C) emvekt på gjeldende behov for å rapportere PCR-data for å bekrefte at målrettet integrasjon forekom i stedet for en enkelt homolog tvers over og et andre ikkehomologe integrering av målretting molekylet. Sjelden ser vi en genetisk blanding representert ved klone 12 (figur 2C) som representerer både en foreldrekontroll mønster og en målrettet sletting mønster. Dette mønsteret mest sannsynlig oppstår av og til fra to parasitt genotyper som er til stede på det samme sted i et kloning godt.

En generell skjematisk for fjerning av HXGPRT fra Δ ku80Δgoi :: HXGPRT å slette HXGPRT fra belastningen blir vist (figur 3A). Den primerpar brukes til å validere fjerning av HXGPRT fra Δ ku80 Δ gra2 :: HXGPRT (Figur 3B) forsterker en unik ~ 1,2 KBP bandet i PCR5 som sett i kloner 4, 7, 9, 11 og 12 (Figur 3C). Hvis HXGPRT ikke fjernes fra locus, en ~ 3.4 KBP bandet er observert (kloner 1, 2, 3, 6, 8, 10, og foreldrekontroll). Flere mekanismer handle for å gjøre fjerning av HXGPRT (6TX utvalg) mer utfordrende og mindre effektiv enn integrering av HXGPRT (MPA + X utvalg). MPA valget er rett og slett mer effektiv enn 6TX utvalg ^14,16. I tillegg er høyere nivåer av ekspresjon HXGPRT nødvendig for 6TX valg enn for MPA valg ^16,24. Følgelig kan mutasjoner som kan redusere HXGPRT enzymaktivitet eller mutasjoner eller epigenetiske endringer som reduserer uttrykket nivået av HXGPRT på et gen locus potensielt avskaffe effektiviteten av 6TX utvalg. Selv med disse utfordringene i 6TX valg, er suksessraten av 6TX utvalg i Δ ku80 stammer mer enn 90% på første forsøk ^1-3.

Et generelt skjema for direkte C-terminal merking av protein-kodende gener er vist (figur 4). Detteordningen benytter direkte integrasjon via dobbel cross over homolog rekombinasjon av HXGPRT 3 'av det kodede genet og også anvender strategier for validering lik de beskrevet ovenfor. Når et gen som er mistenkt for å være et essensielt gen Dette kan kontrolleres ved hjelp av en andre transfeksjon med et uavhengig plasmid DNA isolert målretting. Alternative metoder, slik som ordninger for regulert genekspresjon, er tilgjengelige for ytterligere å verifisere om et gen som er essensielt ^25..

Figur 1. Oversikt over utformingen av en målretting DNA plasmid. A. Skjematisk for utforming overlapper primere brukes til PCR forsterke 5 'og 3' target flankene med 33 bp overlapper for pRS416 shuttle vektor og HXGPRT minigene kassett. Primere avbildet i skjematisk varbrukes til å generere den 5 'og 3' target flankene av pΔROP18 ^10.. B. Generell strategi for å utforme en målrettende DNA-molekyl. Ryggraden i pΔGOI er pRS416 shuttle vektor som inneholder uracil (URA) og ampicillin (AMP) valgbare markører. Satt inn pRS416 er en ~ en KBP 5 'DNA-mål flanke forsterket fra genomisk DNA med overlapper for HXGPRT minigene kassett og pRS416 hjelp av F1 og R1 primere, en ~ en KBP 3' er DNA-mål flanke forsterket fra genomisk DNA med omlegg for den HXGPRT minigene kassett og pRS416 bruke F2 og R2 primere og HXGPRT minigene kassett. Følgende unike restriksjonsenzymseter fordøye nettsteder er lagt til primere: RE.X (begrensning enzym X cut stedet) på F1 primer å kutte plasmidet på 5 'enden av fem' DNA-mål flanke, RE.Y i R2 primer for å kutte plasmidet ved 3'-enden av den 3'-DNA-mål flanke og RE.Z i R1-og F2-primere å skjære den HXGPRT minigene kassett. C. Primer sekvenser som brukes til å generere målretting konstruere for sletting av rop18. Den dristige regionene tilsvarer T. gondii genomisk sekvens, og nonbold regionene tilsvarer restriksjonsenzymseter og sekvenser som overlapper med pRS416 og HXGPRT minigene kassett. Den HX_F og HX_R primerpar forsterker HXGPRT minigene kassett ^14. Primere lese fra 5 'til 3'. Tabell tilpasset fra Fentress et al ^10. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Oversikt over protokollen for sletting av et gen ved hjelp HXGPRT. A. Disruption av en GOI i Δ ku80Δhxgprt belastningen ved en dobbel crossover homolog rekombinasjon hendelse ved hjelp av en ~ en KBP 5 'DNA-mål flanke og en ~ en KBP 3' DNA-mål flanke på plasmid pΔGOI. En PCR strategi ved hjelp PCR1, PCR2, PCR3, og PCR4 (ikke i målestokk) er vist som gjør at genotype verifisering for å validere kloner med målrettet integrering av HXGPRT og sletting av GOI locus. B. Representative primer parene utviklet for å validere sletting av rop18 . ROP18_DF og ROP18_DR forsterke PCR1, ROP18_ExF og ROP18_CxR forsterke PCR2, ROP18_CxF og DHFR_CxR forsterke PCR3 og DHFR_CxF og ROP18_CxR forsterke PCR4 (se figur 2A). Primere lese fra 5 'til 3'. Tabell tilpasset fra Fentress et al ^10. C. Representative resultater av validering av en målrettet genet sletting (rop18) med HXGPRT. Etter transfeksjon av plasmid pΔROP18 inn Δ ku80Δhxgprt og utvalg i MPA +X, MPA + X resistente kloner ble analysert for sletting av rop18. Den foreldrenes belastning kontroll er positivt for PCR 1 (~ 400 bp) og PCR 2 (~ 650 bp) produkt og negative for PCR 3 (~ 1200 bp) og PCR 4 (~ 1300 bp) produkt. En målrettet GOI knockout er positivt for de PCR2, PCR3 og PCR4 produkter og er negativ for PCR 1 produkt (se figur 2A). Vist er representative paneler av resultatene av PCR1 og PCR2 (øverste panel), PCR3 (midtre panelet), og PCR4 (nederst panel). Kloner 3, 4, 5, 6, 8, 9 og 11 viser den korrekte inndelingsmønster av en PCR, PCR2, PCR3 og PCR4 som definerer en målrettet genet sletting hendelse i klonen. Kloner 1, 2, 7, 10 og 12 er ikke gen-slettinger, og svarer til andre mulige representative resultater. (C = foreldrekontroll belastning Δ ku80Δhxgprt, M = størrelse markører). Klikk her for å se større figur .

Figur 3. Oversikt over protokollen for re-targeting genet av interesse å slette HXGPRT. A. Strategi for fjerning av HXGPRT seleksjonsmarkør av en dobbel crossover homolog rekombinasjon hendelse i belastningen Δ ku80Δgoi :: HXGPRT bruker en ~ en KBP 5 'DNA-mål flanke og en ~ en KBP 3' DNA-mål flanke på plasmid pΔGOIc. PCR-strategi for genotype verifisering er avbildet ved hjelp av et primerpar for å assay for en PCR-produkt (PCR5) som spenner over slettingen (ikke i målestokk). B. Et representativt primerpar konstruert for å validere fjerning av HXGPRT selekterbar markør fra gra2 locus i belastning Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primere GRA2 _CLF og GRA2_CxR forsterke PCR5. Primere lese fra 5 'til 3'. C. Representant panel av 6TX-resistente kloner som kan oppnås følgende transfeksjon av plasmid pΔGOIc inn Δ ku80Δgoi :: HXGPRT og utvalg i 6TX. Kloner 4, 7, 9, 11 og 12 oppviser den riktige inndelingsmønster av PCR5 som tilsvarer målrettet delesjon av den HXGPRT markør (~ 1.2 kbp produkt som spenner over 3 'flanke med liten overlapping med den 5' flanke og utenfor tre ' flanke). Kloner 1, 2, 3, 6, 8 og 10 (dette båndet er lys) representerer forventet inndelingsmønster på ca ~ 3.4 kbp som svarer til den parentale klone genotype, selv om disse kloner oppviste en grad av motstand mot 6TX som tillot deres valg (denne fenotypen tidvis kan oppstå spontant ved nedstenging av HXGPRT uttrykk (se merknad i protokollen 2.1 (trinn 8) og representant Resultater avsnitt). (C = foreldrekontroll belastning Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = størrelse markører).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.

Figur 4. Utforming av en målsøkende DNA-molekyl for å kode den C-terminale ende av et protein. Strategien er basert på evnen av den HXGPRT markør til også virke som et 3 'nedstrøms regulatoriske område. Ryggraden i pΔGOItag er pRS416 shuttle vektor som inneholder uracil (URA) og ampicillin (AMP) valgbare markører. Satt inn pRS416 er en ~ en KBP 5 'DNA-mål flanke forsterket fra genomisk DNA med overlapper for HXGPRT minigene kassett og pRS416 bruker Fgoi og Rtag primere, en ~ en KBP 3' DNA-mål flanke er forsterket fra genomisk DNA med omlegg for den HXGPRT minigene kassett og pRS416 bruke F2 og R2primere og HXGPRT minigene kassett. 5 'DNA-mål flanke erstatter oppsigelse kodonet med merkelappen (HA, Myc, Hans, etc.), etterfulgt av en ny oppsigelse kodon. MPA + X utvalg integrerer den C-terminale-kode og en nedstrøms HXGPRT, og beveger den 3 'UTR til en stilling som følge av den HXGPRT markør. Følgende unike restriksjonsenzymseter fordøye nettsteder er lagt til primere: RE.X (begrensning enzym X cut stedet) i Fgoi primer å kutte plasmidet på 5 'enden av fem' DNA-mål flanke, og RE.Y i R2 primer å kutte plasmidet på 3 'enden av 3' DNA-mål flanke, og RE.Z i Rtag og F2 primere til avgiftsdirektoratet HXGPRT minigene kassett til bruk for plasmid konstruksjon for å re-målrette merket genet locus å slette den HXGPRT markør som vil gjenopprette plasseringen av 3 'UTR.

Discussion

Her gir vi en protokoll for effektiv gene targeting i Δ ku80 parasitt stammer for å muliggjøre effektiv utvinning av genetisk manipulert avkom som har målrettede genet slettinger, Gene utskiftninger, og / eller kodede gener. Den sekvensielle utførelse av disse metoder gir en pålitelig metode for isolering av parasitt mutanter som inneholder én eller flere målrettede genetiske manipulasjoner ^1-3. Mens genereringen av en målrettet sletting avhenger av flere faktorer, øker bruken av Δ ku80 stamme med den presenterte strategi og protokollen i stor grad effektiviteten og lette å lage nøyaktig definerte mutante stammer av T. gondii for funksjonell genomisk studier.

Genomet til T. gondii under aseksuelle stadier er haploide. Dermed oppstår et hensyn å ta når du planlegger å slette et gen er at genet ikke må være avgjørende in vitro. Likevel, effektiviteten av innsiktningenterende genet knockouts i Δ ku80 stammer er ekstremt høy, og dette gjør det mulig for isolering av mutantstammer med betydelig svekket replikering priser. Hvis en målrettet genet er viktig, parasitter ofte slutte å gjenskape under valget. En annen kritisk faktor i målrettet genetisk manipulering, er at perfekt homologi med minst 620 bp av det genomiske målretting flanke er nødvendig for å oppnå detekterbare målrettede integrasjoner ^2. Lengre regioner i homologi produsere høyere effektivitet på målretting og bruker målretting DNA flankene av ca 1000 bp er en pålitelig og effektiv tilnærming ^1-4. Av denne grunn er det viktig at genomisk rettet mot flankene genereres fra samme stamme av T. gondii (RH, Pru) som den belastning som blir genetisk manipulert. Mangel på tilstrekkelig homologi kan ofte resultere i at målrettet integrasjon av en genomisk målretting flanke, men ikke den andre. Ufullstendig integrering eller unnlatelse av å få en knockout may også skyldes episomal utholdenhet. Umiddelbart etter transfeksjon, er alle rettet mot molekyler ikke-integrerte episomes, og noen ganger rettet mot molekyler kan vedvare som episomes i mange generasjoner. Ved hjelp av target DNA flankene av ~ en KBP og fortsetter å passere parasitter etter valget før re-subkloning løser ofte problemer forbundet med episomal utholdenhet.

Når en utstansing er validert og den HXGPRT markøren er fjernet, kan genet målrettingsstrategien gjentas på en andre GOI å generere flere genet slettinger i en enkelt parasitt stamme ^1-3. Generering av overstrykninger, utskiftninger, eller tagget gener kan også oppnås ved å bruke ulike valgbare markører (bleomycin, CAT, pyrimethamine motstandsdyktig DHFR, etc.). Selv om CAT valgbar markør for tiden er til stede i type II Δ ku80 Pru genom ^ett, kan denne markøren fjernes ved hjelp av HXGPRT HXGPRT utvalg den sikreste og mest effektive markør med høyest målretting effektivitet der en enkelt-kopi målrettet innsetting er tilstrekkelig for robust valget i MPA + X medium. HXGPRT gir også den eneste tiden nyttig tilnærming for målrettet sletting av en valgbar markør (figur 3) med 6-thioxanthine (6TX) valg ^2,3. Derfor er denne protokollen er den eneste nåværende tilnærming for å utvikle definerte mutantstammer med flere målrettede genetiske manipulasjoner.

Denne protokollen gir en verdifull og effektiv metode for målrettet genetisk manipulasjon i Δ ku80 stammer av Toxoplasma gondii og gjelder til analyse av et enkelt gen, en familie av gener, eller genom-wide funksjonell genomisk studier. Før tilgjengeligheten av Δ ku80 stammer ^1,2, var disse metodene ikke allment gjennomførbart på grunn av inefficiency av disse metodene. Derfor er denne protokollen allment gjeldende for målrettet genetisk manipulering av Toxoplasma gondii og er tilgjengelig for alle etterforskerne interessert i å ta opp en rekke spørsmål om parasitt biologi, vertsrespons og funksjonell genomforskning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Overlap Primers	Integrated DNA Technologies		4 nmole Ultramer DNA oligos
Validation Primers	Integrated DNA Technologies		100 nmole DNA Oligo
Yeast Strain #90845	ATCC		Designation FY834
Shuttle Vector pRS416	ATCC	87521
DH10B E. coli	Invitrogen	12033-015	SOC broth in kit with E. coli
Resuspension Buffer	Qiagen		Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit
Miniprep Kit	Qiagen	27104	QIAprep Spin Miniprep Kit
Glass Beads	Scientific Industries	SI-BG05	0.5 mm acid-washed
Qiacube Automated Robotic Work Station	Qiagen
Electroporation Cuvette	USA Scientific	9104-5050	2 mm-gap
BTX600 electroporator	BTX
Maxiprep Kit	Qiagen	12662	QIAprep Spin Maxiprep Kit
25 cm2 Canted neck plug seal flask	Corning	430168
150 cm2 Canted Neck plug seal flask	Corning	430823
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells	ATCC	SCRC1041
Swin-lok Filter Holder	Whatman	420200	25-mm-diameter
Membrane	Whatman	110612	Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter
Mycophenolic acid (MPA)	Sigma
Xanthine (X)	Sigma
96-well Tissue Culture Tray	Corning Costar
24-well Tissue Culture Tray	Corning Costar
MEM Eagle Media	Lonza Biowhittaker	12-611F
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-111
Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)	Gibco	15240-062
Spin Column	Primm Labs	PAE-100	Easy Clean DNA Extraction Spin Kit
T4 DNA Ligase	New England Biolabs
6-thioxanthine	Acros Organics
Tissue DNA Minikit	Qiagen	51104	QIAamp DNA Blood Mini Kit
Cell Culture Freeze/Recovery Media	Gibco	126-48-010
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30028.02	minus calcium, minus magensium