Summary
L'uso di un modello che simula la condizione di malattie polmonari nell'uomo è fondamentale per lo studio della fisiopatologia e / o eziologia di una particolare malattia e per lo sviluppo di un intervento terapeutico. Ecco un metodo non invasivo intubazione endotracheale in grado di fornire direttamente i materiali esogeni ai polmoni del mouse è presentato.
Abstract
L'uso di un modello che simula la condizione di malattie polmonari nell'uomo è fondamentale per lo studio della fisiopatologia e / o eziologia di una particolare malattia e per lo sviluppo di un intervento terapeutico. Con la crescente disponibilità di knockout e transgenici derivati, insieme ad una grande quantità di informazioni genetiche, i topi forniscono una delle migliori modelli per studiare i meccanismi molecolari alla base della patologia e fisiologia delle malattie polmonari. Inalazione, instillazione intranasale, instillazione, e l'intubazione endotracheale sono le tecniche più utilizzate da un numero di investigatori per amministrare i materiali di interesse per i polmoni del mouse. Ci sono pro e contro per ogni tecnica a seconda degli obiettivi di uno studio. Ecco un metodo non invasivo intubazione endotracheale in grado di fornire direttamente i materiali esogeni ai polmoni del mouse è presentato. Questa tecnica è stata applicata ad amministrare bleomicina ai polmoni topo come modello per lo studio della fibrosi polmonare. </ P>
Introduction
Polmone è un organo in cui molte malattie devastanti sono comunemente diagnosticati. Tra questi, il cancro del polmone è la seconda più cancro diagnosticati in uomini e donne, e la causa più comune di morte per cancro. Malattia cronica polmonare ostruttiva, noto anche come enfisema e bronchite cronica, è una malattia molto grave e la terza causa di morte negli Stati Uniti. Nel 2011, è stato stimato che 25,9 milioni di americani avevano l'asma, tra cui 7,1 milioni di bambini al di sotto dei 18 anni. L'asma è la terza causa di ospedalizzazione tra i bambini al di sotto dei 15 anni (American Lung Association, http://www.lung.org ). Per studiare la fisiopatologia e / o eziologia di queste malattie devastanti e dei loro meccanismi sottostanti, l'uso di modelli accurati è critica in congiunzione con somministrazione conveniente e non invasiva di vari materiali di interesse per polmone. I topi forniscono uno dei migliori modelli distudiare i meccanismi molecolari alla base della patologia e fisiologia delle malattie polmonari a causa della crescente disponibilità di eliminazione diretta e topi transgenici e una grande quantità di informazioni genetiche disponibili.
Vari metodi sono stati utilizzati da un certo numero di ricercatori in contesti diversi per fornire materiali di interesse per i polmoni del mouse, tra cui inalazione, instillazione intranasale, instillazione, e l'intubazione endotracheale 1-4. Quest'ultima procedura non è stato utilizzato di routine perché è considerato piuttosto difficile da eseguire. Intubazione endotracheale qui descritto è un metodo non invasivo, semplice e pratica per fornire materiali di interesse ai polmoni di topo per studiare l'effetto dei materiali consegnati sul pattern di espressione genica, patologia e / o la fisiologia del polmone 5. Questa tecnica garantisce la consegna di materiali esogeni per un intero polmone e non comporta alcun intervento chirurgico sopravvivenza e quindi sarà likely essere approvato da tutti i comitati per la cura degli animali e uso istituzionale.
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Protocol
Il seguente protocollo descrive un metodo non invasivo, semplice e veloce per fornire materiali di interesse per i polmoni del mouse. Tale procedura è stata approvata dalla cura degli animali e del Comitato Usa National Cancer Institute.
1. Anestesia
- Primo, anestetizzare il mouse usando una miscela di chetamina e xilazina (100 mg / kg di peso corporeo e 10 mg / kg di peso corporeo, rispettivamente). Questo è il ACUC raccomandato anestesia e dose. Con questo importo, i topi sono incosciente, almeno per ~ 20 min.
- Applicare vet unguento agli occhi del mouse per evitare l'essiccazione degli occhi durante l'anestesia.
- Dopo alcuni minuti, pizzicare un piede del mouse per controllare la coscienza. Una volta confermata inconscio, posizionare il mouse su un supporto intubazione angolato a ~ 60 ° e tenerlo in posizione agganciando i suoi incisivi superiori su una piccola banda di gomma situato nella parte superiore dello stand.
2. Intubazione endotracheale
Nota: Per avere la corretta lunghezza di catetere da inserire, inizialmente misurare la lunghezza tra la bocca e il punto di biforcazione bronchiale utilizzando un mouse pratica di dimensioni simili in anticipo (Figura 1). La lunghezza dipende in gran parte dalla dimensione del mouse. Inserimento del catetere deve smettere di sopra del punto di biforcazione (circa 1,5 cm per mouse con ~ 25 g di peso corporeo). Questo assicura che il materiale intubato andrà a tutti lobi. Almeno il 50 pratica mice può essere richiesto per una persona che esegue la intubazione per diventare esperti nella tecnica (avanzato significa che il tasso di successo di intubazione è superiore al 95%).
- Una volta inserito il catetere, rimuovere rapidamente la guida di luce a fibre ottiche dal catetere per permettere all'animale di respirare normalmente. Quando il sistema intubazione illuminazione non viene utilizzata, inserire direttamente un catetere come descritto.
- Aggiungere una soluzione contenente materiali di interesse ad un catetere. Assicurarsi che la soluzione viene aspirata nei polmoni subito dopo l'aggiunta. Cinquanta microlitri per ~ 25 g di peso corporeo del mouse viene abitualmente utilizzati.
3. Il recupero degli animali
- Non appena la soluzione viene aspirata nei polmoni, prendere giù il mouse dal cavalletto, e rimetterlo nella gabbia originale.
- Osservare il mouse fino a quando non inizia a muoversi.
- Una volta confermato che il mouse è in buone condizioni, riportare la gabbia di un rack.
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Representative Results
Inizialmente, soluzione verde-tinto è stato usato per intubare topi per la pratica. Il polmone è stato asportato immediatamente dopo l'intubazione per esaminare come uniformemente il colore è stato distribuito nel polmone (Figura 2). Questa tecnica è stata applicata per studiare la fibrosi polmonare indotta da bleomicina utilizzando C57BL / 6 topi. Quando i topi sono stati intratracheale intubati con 1,2 U / kg di bleomicina o soluzione fisiologica come controllo e necroscopia dopo 3 settimane, i topi sviluppato fibrosi indotta da bleomicina tutta la loro polmoni, sostenuta da istologia e l'aumento del contenuto di idrossiprolina (Figura 3). L'area danneggiata è stata valutata utilizzando obiettivo 20X creato le immagini del polmone e una griglia di reticolo 121 punti. Il numero di intersezioni (punti) di cui sopra le zone fibrose sono stati contati ed espressa come percentuale del totale (121) punti. La percentuale delle zone danneggiate quindi contati era proporzionale alla quantità di bleomicina somministrata (Figura 4).
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Figura 1. Illustrazione di topo trachea. Le barre rosse e le frecce indicano il periodo in cui la misura dovrebbe essere presa prima intubazione utilizzando un mouse pratica. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 2. Aspetto del polmone destro dopo essere stato intubato con colorante verde. Se il colore colorante può essere visto in molte parti del polmone, intubazione viene considerata corretta.ad/50601/50601fig2highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Immagini rappresentative della polmoni fibrotici indotte da intubazione tracheale di bleomicina. Topi C57BL / 6 sono stati intubati con 1.2U/kg di bleomicina (B, D) o soluzione fisiologica come controllo (A, C) e loro polmoni furono esaminate istologicamente al giorno 21 post-somministrazione bleomicina. Ingrandimento: A, B: 40X, C, D: 100X. (E) Hydroxyproline contenuto per polmone misurata al giorno 21 per il controllo e bleomicina trattati polmoni. N = 6, ***:. P <0.001 Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 4. Relazione tra dose di bleomicina e l'area danneggiata del polmone. Aumento della dose di bleomicina (0,5, 1 e 2 U / kg) proporzionalmente aumentato la percentuale di aree danneggiate. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
Intubazione endotracheale qui descritto è un metodo semplice, ma ottima non invasivo per fornire in modo uniforme i materiali di interesse per il mouse del polmone. Questo metodo permette studio dell'effetto e / o il ruolo del materiale somministrato sulla fisiologia e / o patologia polmonare. I materiali possono essere somministrati molecole endogene come le citochine, o materiali esogeni, quali sostanze chimiche xenobiotiche / farmaci, sostanze cancerogene, inquinanti, allergeni, o virus che provocano varie malattie polmonari che possono rappresentare un modello per lo studio di varie malattie umane 6-10. Questa tecnica può anche essere utilizzato in combinazione con adenovirus ricombinante o lentivirus introdurre sovraespressione o delezione di geni di interesse in cellule epiteliali delle vie aeree per studiare il ruolo di questi geni nell'omeostasi, fisiologia, patologia, e / o di carcinogenesi polmonare. La rottura di un gene può essere ottenuto transitoriamente esprimere ricombinasi Cre in cellule epiteliali di interrompere un gene di floxed inTERESSE nelle cellule epiteliali 11.
Un catetere può facilmente essere erroneamente inserito nell'esofago, che si giustappone alla trachea. Nel metodo qui descritto, il sistema di illuminazione Intubation fornisce una guida per la corretta posizione in cui il catetere deve essere inserito 5. Il sistema è costituito da una fibra ottica che è stabilmente collegato ad una sorgente luminosa, ed un sistema ottico in miniatura appositamente progettato che permette alla luce di focalizzare sulla fibra ottica. All'estremità di erogazione della fibra ottica si inserisce i cateteri endovenosi monouso che vengono utilizzati come tubi endotracheali. Questo sistema fornisce l'illuminazione diretta del dell'orofaringe, consentendo chiara visualizzazione della laringe durante l'intubazione. Una volta che si diventa abile nel condurre questa tecnica utilizzando il sistema di illuminazione, l'uso del sistema non è più necessario. La procedura può essere eseguita in modo efficiente con solo un catetere, e l'intero pROCEDURA richiede solo pochi minuti. Lo stesso metodo esatto può essere utilizzato per i ratti con maggiori dimensioni del sistema di illuminazione o catetere.
Tre punti sono fondamentali per distribuire uniformemente il materiale nel polmone. Primo, misurare sempre la distanza tra la bocca e il punto di biforcazione bronchiale prima intubazione per avere un'idea di quanto in profondità il catetere deve essere inserito utilizzando un mouse pratica (Figura 1). Da questa dipende in gran parte dalla dimensione del mouse, la stessa lunghezza di inserimento può essere utilizzato quando si determina per i topi di una certa dimensione. In secondo luogo, assicurarsi che la soluzione aggiunta al tubo di intubazione viene aspirata subito dopo la sua aggiunta. Se il tubo di intubazione è erroneamente inserito nell'esofago, la soluzione non viene aspirata immediatamente e quindi rimanere nel tubo. Se questo accade, ripetere l'intero processo di intubazione. Questo processo di conferma assicura che la soluzione è nella trachea, ma non nellaesofago. L'operatore può provare 3x al massimo per ripetere l'intera procedura di intubazione se la soluzione non viene aspirato nel polmone. Tuttavia, se questo accade di frequente, si consiglia di tornare alla pratica di acquisire più alto tasso di successo. Infine, i topi dovrebbero essere incosciente durante l'intubazione, il che assicura che il mouse non avrebbe espettorare ciò che è stato intubato. In questo senso, non è raccomandato l'uso di isoflurano con un cono, che possono anche interferire fisicamente con intubazione.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale del National Cancer Institute, Center for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KetaVed | Vedco | Ketamine | |
| AnaSed Injection 20 mg | LLOYD | Xylazine | |
| BioLite Stand | Braintree Scientific | RIS100 | For mice |
| BioLite Intubation Illumination System | Braintree Scientific | BIO MI-KIT | For mice |
| 22 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2225CA | For mice below 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
| 20 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2025CA | For mice over 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
References
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