Summary
인간 폐 질환의 상태를 본뜬 모델의 사용은 특정 질환의 병태 생리학 및 / 또는 병인을 연구 및 치료 적 개입을 개발에 중요하다. 여기에 직접 마우스의 폐에 외인성 물질을 제공 할 수있는 비 침습적 인 기관 내 삽관 방법이 제시된다.
Abstract
인간 폐 질환의 상태를 본뜬 모델의 사용은 특정 질환의 병태 생리학 및 / 또는 병인을 연구 및 치료 적 개입을 개발에 중요하다. 함께 유전 정보의 광대 한 양의 녹아웃 및 유전자 변형 파생 상품의 증가 가용성, 마우스는 폐 질환의 병리 생리학의 기초가되는 분자 메커니즘을 연구하는 가장 좋은 모델 중 하나를 제공합니다. 흡입, 비강 내 점적, 기관 내 점안 및 기관 내 삽관 마우스 폐에 그 자료를 관리 할 수있는 연구자들에 의해 가장 널리 사용되는 기술이다. 연구의 목적에 따라 각각의 기술에 대한 장점과 단점이 있습니다. 여기에 직접 마우스의 폐에 외인성 물질을 제공 할 수있는 비 침습적 인 기관 내 삽관 방법이 제시된다. 이 기술은 폐 섬유증을 연구하는 모델로 마우스의 폐에 블레오 마이신을 관리하기 위해 적용되었다. </ P>
Introduction
폐는 많은 파괴적인 질병은 일반적으로 진단 기관이다. 그 중에서도, 폐암은 남성과 여성 모두에서 두 번째로 가장 암 진단, 암 사망의 가장 흔한 원인이다. 또한 폐기종과 만성 기관지염으로 알려진 만성 폐쇄성 폐 질환은 매우 심각한 질환과 미국에서 사망의 세 번째 주요 원인이다. 2011 년, 그것은 25900000 미국인이 18 세 미만의 710 만 어린이를 포함, 천식을 한 것으로 추정되었다. 천식은 15 일 (미국 폐 협회, 세 미만의 어린이들에게 입원의 세 번째 주요 원인이다 http://www.lung.org ). 이러한 파괴적인 질병과 그 기본 메커니즘의 병태 생리 및 / 또는 원인을 연구하기 위해, 정확한 모델의 사용은 폐 관심을 다양한 재료의 편리하고 비 침습적 인 관리와 함께 중요합니다. 쥐에게 최고의 모델 중 하나를 제공때문에 녹아웃 및 형질 전환 마우스 및 사용 가능한 유전 정보의 광대 한 양의 증가 가용성의 병리 및 폐 질환의 생리의 기초가되는 분자 메커니즘을 연구.
다양한 방법 흡입, 비강 내 점적, 기관 내 점안 및 기관 내 삽관 1-4를 포함하여 마우스의 폐에 그 자료를 제공하기 위해 다른 설정에서 수사관들에 의해 사용되어왔다. 이를 수행하기 다소 어려운 것으로 간주되기 때문에 후자의 과정은 일상적으로 사용되지 않았다. 여기에 기술 기관 내 삽관 법은 유전자 발현 패턴, 병리 및 / 또는 폐 5의 생리에 전달 물질의 효과를 연구하기 위해 마우스의 폐에 대한 관심의 자료를 제공 할 수있는 비 침습적 간단하고 빠른 방법입니다. 이 기술은 전체 폐에 외인성 물질의 전달을 보장하고 생존 수술을 포함하지 않으며, 따라서 likel 것Y는 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 것이어야합니다.
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Protocol
다음 프로토콜은 마우스의 폐에 그 자료를 제공 할 수있는 비 침습적, 간단하고 빠른 방법을 설명합니다. 이 절차는 국립 암 연구소 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 마취
- 먼저, 케타민 (ketamine)과 자일 라진 (각각 100 ㎎ / kg 체중 및 10 ㎎ / kg 체중)의 혼합물을 사용하여 마우스를 마취. 이 ACUC 마취 및 복용량을 권장합니다. 이 금액으로, 마우스는 적어도 ~ 20 분에 대한 의식이 있습니다.
- 마취 동안 눈의 건조를 방지하기 위하여 마우스 눈 수의사 연고를 적용한다.
- 몇 분 후, 의식을 확인하기 위해 마우스의 다리를 꼬집어. 일단 의식 확인, ~ 60 °로 각도 삽관 스탠드에 마우스를 놓고 받침대의 상단에있는 작은 고무 밴드를 통해 상부 앞니를 후킹하여 제자리에 고정.
2. 기관 내 삽관
참고 : 삽입되는 카테터의 적절한 길이를 얻기 위해서는, 처음에 사전에 유사한 크기의 연습 마우스 (도 1)를 사용하여 입과 기관지 분기점 사이의 길이를 측정한다. 길이는 크게 마우스의 크기에 따라 달라집니다. 카테터의 삽입은 분기점 위에 중지해야합니다 (~ 체중 25 ~ G와 마우스 1.5 cm). 이 삽관 물질이 모든 엽 (叶)에 갈 것이라는 점을 보증한다. 적어도 50 연습 마이크전자 기술에 숙달 될 수있는 삽관 법을 수행하는 사람을 위해 요구 될 수있다 (능숙은 삽관의 성공률이 95 % 이상임을 의미합니다).
- 카테터가 삽입되면, 신속하게 동물이 일반적으로 숨을 쉴 수 있도록 카테터에서 광섬유 라이트 가이드를 제거합니다. 삽관 조명 시스템을 사용하지 않을 경우 직접 바와 같이 카테터를 삽입한다.
- 카테터의 관심 물질을 함유하는 용액을 추가. 용액을 즉시 첨가 한 후 폐에 흡입되어 있는지 확인합니다. ~에 대한 쉰 마이크로 리터는 25g의 마우스 체중은 일상적으로 사용됩니다.
3. 동물 복구
- 즉시 솔루션이 폐에 흡입 될 때 받침대에서 마우스를 내려, 원래의 케이지에 다시 넣어.
- 이 이동 시작할 때까지 마우스를 관찰합니다.
- 일단 마우스가 좋은 상태에 있음을 확인, 랙에 케이지를 반환합니다.
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Representative Results
처음에는 녹색으로 염색 한 솔루션은 연습을 위해 마우스를 삽관하는 데 사용되었다. 폐는 색이 폐 (그림 2)에 배포 된 방법을 균일하게 조사 할 삽관 후 즉시 절제했다. 이 기술은 C57BL / 6 마우스를 이용하여 블레오 마이신 유발 폐 섬유증을 연구하기 위해 적용되었다. 마우스가 intratracheally 제어 나중에 부검 삼주로 블레오 마이신 또는 식염수 1.2 U / kg으로 삽관 때, 마우스는 조직학 및 증가 된 하이드 록시 프롤린 내용 (그림 3)에 의해 지원, 폐 전체에 블레오 마이신 유도 성 섬유증을 개발했다. 손상된 영역은 20 배 목표 만든 폐 이미지와 121 점의 격자 격자를 사용하여 평가 하였다. 섬유 분야 떨어지는 교차로 (점)의 수는 총 (121) 점의 비율로 계산 표현했다. 따라서 계산 손상된 부위의 비율은 관리 블레오 마이신의 양 (그림 4)에 비례했다.
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마우스 기관의 그림 1. 그림. 빨간색 막대와 화살표는 측정이 연습 마우스를 사용하여 삽관 전에주의해야한다 길이를 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 오른쪽 녹색 염료로 삽관 된 후 폐의 외관. 염료 색 폐의 대부분의 지역에서 볼 수있는 경우에, 삽관는 성공한 것으로 간주된다.ad/50601/50601fig2highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 블레오 마이신의 기관 내 삽관에 의해 유도 된 섬유 성 폐의 대표 이미지. C57BL / 6 마우스는 블레오 마이신의 1.2U/kg (B, D) 또는 제어로 (A, C) 및 폐는 조직 학적으로 21 일 이후 블레오 마이신 관리에 대한 조사 하였다 식염수로 삽관 하였다. 배율 : A, B : 40 배, C, D : 100X. 제어 및 블레오 마이신 치료 폐를위한 21 일에 측정 한 폐 당 (E) 히드 록시 내용. = 6 N, ***. P <0.001 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
블레오 마이신의 투여 량과 폐의 손상 영역 사이의 그림 4. 관계. 블레오 마이신 (0.5, 1, 2 U / kg)의 증가 용량 비례 적 손상 영역의 비율을 증가 시켰습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
여기에 설명 된 기관 내 삽관은 균등하게 마우스의 폐에 그 자료를 제공 할 수있는 간단하면서도 우수한 비 침습적 인 방법입니다. 이 방법은 폐의 생리 및 / 또는 병리에서 관리 물질의 효과 및 / 또는 역할의 연구를 할 수 있습니다. 관리되는 재료는 사이토 카인, 또는 생체 이물 화학 / 의약품, 발암 물질, 오염 물질, 알레르기, 또는 다양한 인간의 질병 6-10 공부를위한 모델을 나타낼 수있는 다양한 폐 상태가 발생할 바이러스와 같은 이물 등의 내인성 분자가 될 수 있습니다. 이 기술은 또한 항상성, 생리학, 병리 및 / 또는 폐의 발암에 이러한 유전자의 역할을 연구하기 위하여기도 상피 세포에 대한 관심의 유전자의 과발현 또는 결실을 도입하는 재조합 아데노 바이러스 또는 렌티 바이러스와 함께 사용될 수있다. 유전자의 중단은 일시적에서의 floxed 유전자를 방해하는 상피 세포에 Cre 호텔 재조합 효소를 발현에 의해 달성 될 수있다상피 세포 (11)의 terest.
카테터는 용이 실수 기관에 병설되어 식도 내로 삽입 될 수있다. 여기에 설명 된 방법에있어서, 삽관 조명 시스템은 카테터 5를 삽입 할 정확한 위치에 대한 지침을 제공한다. 시스템은 안정적으로 광원에 연결되어 광섬유 광섬유 및 광 광섬유 섬유에 집중할 수 있도록 특별히 설계된 소형 광학 렌즈계로 구성된다. 광섬유 섬유의 배달 끝은 기관 내 튜브로 사용되는 일회용 정맥 카테터에 적합하다. 이 시스템은 기관 내 삽관시 후두의 명확한 시각화를 가능하게 구강 인두의 직접 조명을 제공합니다. 하나의 조명 시스템을 사용하여이 방법을 수행 실력이되고 나면, 시스템의 사용은 더 이상 필요 없다. 절차는 효율적으로 전체 P보기에만 카테터로 수행 될 수 있고,rocedure는 단 몇 분을 필요로한다. 동일한 방법은 큰 크기의 조명 시스템 또는 카테터와 함께 쥐에 사용될 수있다.
3 점 균등하게 폐를 통해 자료를 배포하는 중요합니다. 첫째, 항상 카테터 연습 마우스 (그림 1)를 사용하여 삽입하는 방법을 깊은 생각을하기 위해 입과 삽관 전에 기관지 분기점 사이의 길이를 측정합니다. 이것은 주로 마우스의 크기에 의존하기 때문에이 특정 크기의 마우스에 대해 결정되면, 동일한 삽입 길이가 사용될 수있다. 둘째,이 솔루션은 삽관 튜브가 바로 그 외에도 후 흡입에 추가해야합니다. 삽관 튜브가 실수 식도 내로 삽입되는 경우, 용액은 즉시 흡입 따라서 튜브 전해되지 않을 것이다. 이 경우, 삽관의 전체 과정을 반복합니다. 이 확인 처리는 용액 아니지만에서 기관지 것을 보장식도. 오퍼레이터는 용액이 폐에 흡입되지 않은 경우 전체 삽관 절차를 반복 최대 3 회 시도 할 수있다. 이 자주 발생하는 경우에는, 그것은 더 높은 성공률을 얻기 위해 다시 연습에 이동하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 마우스는 마우스가 삽관 된 것을 뱉어하지 않을 것을 보장하는 삽관 동안 의식이 있어야한다. 이러한 의미에서, 물리적으로 삽관을 방해 할 수있는 코 콘과 이소 플루 란의 사용을 권장하지 않습니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 암 연구소 암 연구 센터의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KetaVed | Vedco | Ketamine | |
| AnaSed Injection 20 mg | LLOYD | Xylazine | |
| BioLite Stand | Braintree Scientific | RIS100 | For mice |
| BioLite Intubation Illumination System | Braintree Scientific | BIO MI-KIT | For mice |
| 22 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2225CA | For mice below 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
| 20 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2025CA | For mice over 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
References
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J. Vis. Exp. (73), e50318 (2013).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7, e31359 (2012).
- Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702 (2011).
- Riesenfeld, E. P., et al. Inhaled salmeterol and/or fluticasone alters structure/function in a murine model of allergic airways disease. Respir. Res. 11, 22 (2010).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).
- Bonniaud, P., et al. Progressive transforming growth factor beta1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor. Am. J. Res. Crit. Care Med. 171, 889-898 (2005).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur. J. Pharm. Biopharm. 61, 214-218 (2005).
- Haegens, A., et al. Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production. J. Immunol. 182, 7990-7996 (2009).
- Jackson, P., et al. Exposure of pregnant mice to carbon black by intratracheal instillation: toxicogenomic effects in dams and offspring. Mutat. Res. 745, 73-83 (2012).
- Bodewes, R., et al. Pathogenesis of Influenza A/H5N1 virus infection in ferrets differs between intranasal and intratracheal routes of inoculation. Am. J. Pathol. 179, 30-36 (2011).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473, 101-104 (2011).
