Summary
Использование модели, которая имитирует состояние легочных заболеваний у человека является критическим для изучения патофизиологии и / или этиологию конкретного заболевания и для разработки терапевтического вмешательства. Здесь неинвазивный интратрахеального метод интубации, которые могут непосредственно доставить экзогенные материалы легких мышей представлена.
Abstract
Использование модели, которая имитирует состояние легочных заболеваний у человека является критическим для изучения патофизиологии и / или этиологию конкретного заболевания и для разработки терапевтического вмешательства. С ростом доступности нокаутом и трансгенных производных, вместе с огромным количеством генетической информации, мыши обеспечивают один из лучших моделей для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе патологии и физиологии заболеваний легких. Вдыхание, интраназально закапывания, введение в трахею, и интратрахеального интубации являются наиболее широко используемыми методы по ряду исследователей управляют материалы, представляющие интерес для легких мышей. Есть плюсы и минусы для каждого метода в зависимости от целей исследования. Здесь неинвазивный интратрахеального метод интубации, которые могут непосредственно доставить экзогенные материалы легких мышей представлена. Этот метод был применен для администрирования блеомицин в легких мышей в качестве модели для изучения легочного фиброза. </ Р>
Introduction
Легких является органом, где многие разрушительные болезни, как правило, диагностируется. Среди них, рак легких является второй наиболее диагноз рака у мужчин и женщин, и наиболее распространенной причиной смерти от рака. Хроническая обструктивная болезнь легких, также известный как эмфизема и хронический бронхит, является очень серьезным заболеванием и является третьей основной причиной смертности в Соединенных Штатах. В 2011 году было подсчитано, что 25900 тысяч американцев была астма, в том числе 7,1 млн. детей в возрасте до 18 лет. Астма является третьей ведущей причиной госпитализации среди детей в возрасте до 15 (Американской легочной ассоциации, http://www.lung.org ). С целью изучения патофизиологии и / или этиологию этих разрушительных заболеваний и их основных механизмов, использование точных моделей имеет решающее значение в сочетании с удобной и неинвазивной введения различных материалов, представляющих интерес для легкого. Мыши предоставить один из лучших моделей дляизучить молекулярные механизмы, лежащие в основе патологии и физиологии легочных заболеваний из-за растущей доступности нокаутом и трансгенных мышей и огромного количества доступных генетической информации.
Различные методы были использованы рядом исследователей в различных условиях для доставки материалов, представляющих интерес для легких мышей, в том числе ингаляции, интраназально закапывания, введение в трахею, и интратрахеального интубации 1-4. Последняя процедура не использовалась регулярно, потому что это считается довольно трудно выполнить. Интратрахеального интубация описано здесь является неинвазивным, простой и быстрый способ доставить материалы, представляющие интерес для легких мышей, чтобы изучить эффект поставляемых материалов на паттернов экспрессии генов, патологии и / или физиологии легких 5. Эта техника обеспечивает доставку экзогенных материалов к целому легких и не связаны с какой-либо операции выживания и тем самым будет likelу утверждаются любых организационных уходу и использованию животных комитетов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол описывает неинвазивный, простой и быстрый способ, чтобы доставить материалы, представляющие интерес для легких мышей. Эта процедура была одобрена Комитетом уходу и использованию животных Национального института рака по.
1. Анестезия
- Во-первых, анестезию мыши с использованием смеси кетамина и ксилазина (100 мг / кг массы тела и 10 мг / кг веса тела, соответственно). Это ACUC рекомендуется анестезии и дозы. С этой суммы мыши бессознательного по крайней мере в течение ~ 20 мин.
- Применить ветеринар мазь для глаз мыши, чтобы предотвратить высыхание глаза во время анестезии.
- Через несколько минут, щепотка ногу мыши для проверки сознания. После того, как подтвердил, без сознания, поместите курсор на интубации стенде под углом в ~ 60 ° и удерживать его на месте, зацепив его верхние резцы на небольшой круглой резинкой, расположенной в верхней части подставки.
2. Интратрахеального интубации
Примечание: Для того чтобы получить правильную длину катетера, чтобы быть вставлен, сначала измерить длину между ртом и бронхиальной точки бифуркации с помощью практики мышь аналогичного размера заранее (рис. 1). Длина в значительной степени зависит от размера мыши. Введение катетера должен прекратить выше точки бифуркации (~ 1,5 см для мыши с ~ 25 г массы тела). Это гарантирует, что интубировали материал пойдет на всех долях. По меньшей мере 50 практика микрофоне может потребоваться для человека, выполняющего интубации, чтобы стать специалистами в технике (Опытный означает, что вероятность успеха интубации более чем на 95%).
- Как только катетер вставлен, быстро удалить оптоволоконный световод из катетера, чтобы позволить животному нормально дышать. Когда система интубации освещенность не используется, непосредственно вставить катетер, как описано.
- Добавить раствор, содержащий материалы, представляющие интерес для катетера. Убедитесь, что раствор всасывается в легких немедленно после того. Обычно используются в 25 г мыши массы тела Пятьдесят мкл для ~.
3. Восстановление животных
- Как только раствор всасывается в легких, снять мышь со стенда, и положил его обратно в исходное клетке.
- Соблюдайте мышь, пока он не начинает двигаться.
- После того, как подтвердил, что мышь находится в хорошем состоянии, вернуть клетку к стойке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Первоначально, зеленый-окрашенный раствор использовали для интубации мыши на практике. Легкие резекцию сразу после интубации, чтобы изучить, как равномерно цвет был распространен в легких (рис. 2). Этот метод был применен для изучения блеомицин-индуцированного фиброза легких с использованием мышей C57BL / 6. Когда мышам внутритрахеально интубировали 1,2 ед / кг блеомицин или солевым раствором в качестве контроля и вскрывали через 3 недели, мыши начали блеомицином фиброз всей их легких, при поддержке гистологии и увеличением содержания оксипролина (рис. 3). Поврежденный участок оценивали с помощью 20X цель созданного изображения легких и 121-узлах решетки сетки. Число пересечений (точек), приходящихся на протяжении волокнистых областях подсчитывали и выражается в виде процента от общего объема (121) очков. Процент поврежденных участках таким образом, подсчитанных была пропорциональна количеству вводимого блеомицина (рис. 4).
"Jove_content" FO: держать-together.within-страницу = "всегда"> 
Рисунок 1. Иллюстрация мыши трахеи. Красные полоски и стрелки указывают длину, где измерение должно быть принято до интубации с использованием практики мыши. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Появление легкого сразу после того интубировали зеленого красителя. Если цвет красителя можно увидеть в большинстве частей легких, трахеи считается успешным.ad/50601/50601fig2highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3. Представитель изображения фиброзных легких, вызванных интратрахеального интубации блеомицин. C57BL / 6 мышей интубировали 1.2U/kg блеомицина (B, D) или физиологического раствора в качестве контроля (А, С) и их легкие были гистологическое исследование на 21-й день после введения блеомицина. Увеличение: А, В: 40X; C, D: 100X. (Е) Гидроксипролин содержание в легких определяли на 21 день для контроля и блеомицином лечение легких. N = 6, ***:. Р <0,001 Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 4. Отношения между дозой блеомицин и поврежденного участка легкого. Увеличение дозы блеомицина (0,5, 1 и 2 U / кг) пропорционально увеличивается процент поврежденных участков. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Интратрахеального интубация, описанный здесь, простой, но отлично неинвазивный метод, чтобы равномерно поставка материалов, представляющих интерес для мыши легких. Этот метод позволяет исследовать влияние и / или роли материала вводят по физиологии и / или патологии легких. Материалы ведении могут быть эндогенные молекулы, такие как цитокины, или экзогенных материалов, таких как ксенобиотиков химических веществ / препаратов, канцерогенов, загрязняющих веществ, аллергенов, или вирусы, которые приводят к различным условиям легких, которые могут представлять модель для изучения различных человеческих заболеваний 6-10. Этот метод также может быть использован в сочетании с рекомбинантным аденовирусом или лентивирусов ввести сверхэкспрессии или удаление интересующих генов в эпителиальных клетках дыхательных путей исследовать роль этих генов в гомеостазе, физиологии, патологии, и / или канцерогенеза легких. Разрушение гена может быть достигнуто путем временно экспрессирующих Cre рекомбиназу в эпителиальных клетках сорвать floxed ген винтерес в эпителиальных клетках 11.
Катетер легко может быть ошибочно вставлен в пищевод, который, примыкающего к трахее. В способе, описанном здесь, интубации Системы освещения содержит указания в правильное положение, где катетер должен быть вставлен 5. Система состоит из волоконно-оптической волокна, которое стабильно, подключенного к источнику света, и специально оборудованную миниатюрной оптической системы объектива, что позволяет свет, чтобы сосредоточиться на волоконно-оптической волокна. Конец поставка волоконно-оптического волокна вписывается в одноразовых внутривенных катетеров, используемых в качестве интратрахеального труб. Эта система обеспечивает прямое освещение из ротоглотки, что позволяет четкую визуализацию гортани во время интубации. Как только человек становится опытным в проведении этой методики с использованием Системы освещения, использование системы больше нет необходимости. Процедура может быть эффективно выполнена только с помощью катетера, и вся Procedure требуется всего несколько минут. Точно такой же метод может быть использован для крыс с большего размера Системы освещения или катетера.
Три точки являются критическими для равномерного распределения материала по всей легких. Во-первых, всегда измеряют длину между ртом и бронхиальной точки бифуркации до интубации, чтобы иметь представление о том, насколько глубоко катетер должен быть вставлен с помощью практики мышь (рис. 1). Так как это в значительной степени зависит от размера мыши, такой же длины, вставка может быть использован, когда он будет определяться для мышей определенного размера. Во-вторых, убедитесь, что раствор добавляли в интубации трубки всасывается сразу после его добавления. Если интубации трубка ошибочно вставлен в пищевод, решение не будет всасываться в немедленно и, таким образом остаться в трубке. Если это произойдет, повторите весь процесс интубации. Этот процесс обеспечивает подтверждение, что решение в трахее, но не впищевода. Оператор может попробовать 3x максимально повторить всю процедуру интубации, если решение не всасывается в легких. Однако, если это часто бывает, рекомендуется вернуться к практике, чтобы приобрести больше успешную ставку. Наконец, мыши должны быть без сознания во время интубации, который уверяет, что мышь не будет плевать, что интубировали. В этом смысле, применение изофлуран с носовой конус, который может также физически мешать интубации не рекомендуется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана исследовательской программы Интрамурального Национального института рака, Центр по исследованию рака.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KetaVed | Vedco | Ketamine | |
| AnaSed Injection 20 mg | LLOYD | Xylazine | |
| BioLite Stand | Braintree Scientific | RIS100 | For mice |
| BioLite Intubation Illumination System | Braintree Scientific | BIO MI-KIT | For mice |
| 22 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2225CA | For mice below 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
| 20 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2025CA | For mice over 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
References
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J. Vis. Exp. (73), e50318 (2013).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7, e31359 (2012).
- Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702 (2011).
- Riesenfeld, E. P., et al. Inhaled salmeterol and/or fluticasone alters structure/function in a murine model of allergic airways disease. Respir. Res. 11, 22 (2010).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).
- Bonniaud, P., et al. Progressive transforming growth factor beta1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor. Am. J. Res. Crit. Care Med. 171, 889-898 (2005).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur. J. Pharm. Biopharm. 61, 214-218 (2005).
- Haegens, A., et al. Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production. J. Immunol. 182, 7990-7996 (2009).
- Jackson, P., et al. Exposure of pregnant mice to carbon black by intratracheal instillation: toxicogenomic effects in dams and offspring. Mutat. Res. 745, 73-83 (2012).
- Bodewes, R., et al. Pathogenesis of Influenza A/H5N1 virus infection in ferrets differs between intranasal and intratracheal routes of inoculation. Am. J. Pathol. 179, 30-36 (2011).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473, 101-104 (2011).
