Summary
השימוש במודל המחקה את המצב של מחלות ריאה בבני האדם הוא קריטי ללימוד הפתופיזיולוגיה ו / או אטיולוגיה של מחלה מסוימת ולפתח התערבות טיפולית. הנה שיטת אינטובציה intratracheal לא פולשנית שיכול ישירות לספק חומרים אקסוגניים לריאות עכבר מוצגת.
Abstract
השימוש במודל המחקה את המצב של מחלות ריאה בבני האדם הוא קריטי ללימוד הפתופיזיולוגיה ו / או אטיולוגיה של מחלה מסוימת ולפתח התערבות טיפולית. עם הזמינות הגוברת של נגזרים בנוקאאוט ומהונדסים, יחד עם כמות עצומה של מידע גנטי, עכברים לספק אחד הדגמים הטובים ביותר כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הפתולוגיה והפיסיולוגיה של מחלות ריאה. שאיפה, החדרה אפי, החדרת intratracheal, ואינטובציה intratracheal הן הטכניקות ביותר בשימוש נרחב על ידי מספר החוקרים לניהול חומרים המעניינים את ריאות עכבר. ישנם יתרונות וחסרונות לכל שיטה בהתאם למטרות מחקר. הנה שיטת אינטובציה intratracheal לא פולשנית שיכול ישירות לספק חומרים אקסוגניים לריאות עכבר מוצגת. טכניקה זו יושמה כדי לנהל bleomycin לריאות עכבר כמודל ללמוד פיברוזיס ריאתי. </ P>
Introduction
ריאות היא איבר שבו רבות במחלות הרסניות הם מאובחנים כלל. ביניהם, סרטן הריאות הוא הסרטן השני הכי מאובחן בגברים והן נשים, והגורם השכיח ביותר למוות מסרטן. מחלת ריאות חסימתית כרונית, המכונה גם נפחת או ברונכיטיס כרוני, היא מחלה קשה מאוד והגורם השלישי למוות בארצות הברית. ב2011, הוערך כי היו לי 25.9 מיליון אמריקאים אסתמה, כוללים 7.1 מיליון ילדים מתחת לגיל 18. אסטמה היא הגורם השלישי לאשפוז בקרב ילדים מתחת לגיל 15 (איגוד ריאות אמריקאי, http://www.lung.org). על מנת ללמוד את הפתופיזיולוגיה ו / או אטיולוגיה של מחלות הרסניות אלה והמנגנונים הבסיסיים שלהם, השימוש במודלים מדויקים הוא קריטי בשיתוף עם ממשל נוח ולא פולשנית של חומרים שונים המעניינים את הריאות. עכברים לספק אחד הדגמים הטובים ביותרלחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הפתולוגיה והפיסיולוגיה של מחלות ריאה בגלל הזמינות הגוברת של נוקאאוט ועכברים הטרנסגניים וכמות עצומה של מידע גנטי זמין.
שיטות שונות שנוצלו על ידי מספר החוקרים במסגרות שונות, כדי לספק חומרים המעניינים את ריאות עכבר, כולל שאיפה, החדרה אפי, החדרת intratracheal, ואינטובציה intratracheal 1-4. ההליך זה האחרון לא היה בשימוש באופן שגרתי, כי זה נחשב די קשה לביצוע. אינטובציה Intratracheal המתוארת כאן היא שיטה לא פולשנית, פשוטה, ומהירה כדי לספק חומרים המעניינים את ריאות בעכבר כדי לחקור את ההשפעה של החומרים מועברים על דפוסי ביטוי גנים, פתולוגיה ו / או פיזיולוגיה של ריאות 5. טכניקה זו מבטיחה האספקה של חומרים אקסוגניים לכל ריאה ואינה כרוכה בניתוח הישרדות ובכך יהיה likely להיות מאושר על ידי כל ועדות טיפול בבעלי החיים ושימוש מוסדיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול הבא מתאר שיטה לא פולשנית, פשוטה, ומהירה כדי לספק חומרים המעניינים את ריאות עכבר. נוהל זה אושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש במכון הלאומי לסרטן.
1. הרדמה
- ראשית, להרדים את העכבר באמצעות תערובת של קטמין ו xylazine (100 מ"ג / קילוגרם משקל גוף ו10 מ"ג / קילוגרם משקל גוף, בהתאמה). זהו ACUC מומלץ הרדמה ומינון. עם סכום זה, עכברים הם מודעים לפחות ל~ 20 דקות.
- החל משחה וטרינר לעיניים של העכבר על מנת למנוע התייבשות של העיניים במהלך הרדמה.
- לאחר כמה דקות, לצבוט רגל של העכבר כדי לבדוק את הכרתו. ברגע שאשר את ההכרה, הנח את העכבר על דוכן אינטובציה זווית ב ~ 60 ° ולהחזיקו במקום ידי משדלת החותכות העליונות שלה מעל גומייה קטנה הממוקמת בחלק העליון של המעמד.
2. אינטובציה Intratracheal
הערה: על מנת לקבל את האורך הנכון של קטטר כדי להיות מוכנסים, בתחילה למדוד את האורך בין הפה ונקודת הסתעפות הסימפונות באמצעות עכבר בפועל בגודל דומה מראש (איור 1). האורך תלוי במידה רבה בגודל של העכבר. החדרת קטטר צריכה להפסיק מעל לנקודת הסתעפות (~ 1.5 סנטימטר לעכבר עם ~ 25 גרם של משקל גוף). הדבר זה מבטיח שהחומר מחובר לצינורות ילך לכל האונות. לפחות 50 מיקרופון בפועלדואר עשוי להידרש לאדם ביצוע אינטובציה כדי להיות בקיא בטכניקה (בקיאים אומר כי שיעור ההצלחה של אינטובציה הוא יותר מ 95%).
- ברגע שהצנתר מוחדר, להסיר במהירות את ספר אור בסיבים אופטיים מקטטר כדי לאפשר לבעלי החיים לנשום כרגיל. כאשר מערכת אינטובציה תאורה אינה משמשת, במישרין להכניס קטטר כפי שתואר.
- הוספת תמיסה המכילה חומרים המעניינים את הקטטר. ודא כי הפתרון הוא נשאב לתוך הריאות מייד לאחר בנוסף. חמישים מיקרוליטר ל~ משמש 25 משקל גוף עכבר גרם באופן שיגרתי.
3. שחזור בעלי החיים
- ברגע שהפתרון נשאב לתוך הריאות, לקחת את העכבר מהדוכן, והחזרת אותו לכלוב המקורי.
- שים לב לעכבר עד שהוא מתחיל לזוז.
- ברגע שאשר שהעכבר הוא במצב טוב, להחזיר את הכלוב למדף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בתחילה, פתרון ירוק צבוע שימש לצנרר עכברים לאימון. הריאות שעברו כריתה מייד לאחר אינטובציה לבחון כיצד באופן שווה את הצבע הופץ בריאה (איור 2). טכניקה זו יושמה ללמוד פיברוזיס ריאתי מושרה bleomycin באמצעות עכברי C57BL / 6. כאשר העכברים היו מחוברים לצינורות intratracheally עם 1.2 U / ק"ג bleomycin או מלוח בקרה ו3 שבועות שלאחר המוות מאוחר יותר, העכברים פיתחו סיסטיק-Induced bleomycin ברחבי הריאות שלהם, נתמכים על ידי היסטולוגיה ותוכן hydroxyproline המוגבר (איור 3). האזור הפגוע הוערך באמצעות אובייקטיבי 20X יצר תמונות ריאות ורשת סריג 121-נקודות. מספר צמתים (נקודות) נופלים על האזורים סיביים נספר והביע כאחוז (121) נקודות בסך הכל. אחוז מהאזורים שנפגעו וכך נספרו היה פרופורציונאלי לכמות bleomycin מנוהל (איור 4).
"Jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
איור 1. איור של קנה הנשימה עכבר. הברים וחיצים האדומים מציינים את האורך שבו המדידה צריכה להילקח לפני אינטובציה באמצעות עכבר בפועל. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. מראה של ריאה ימנית לאחר שמחובר לצינורות עם צבע ירוק. אם צבע הצבע שניתן לראות ברוב חלקי הריאה, אינטובציה נחשבת מוצלחת. ad/50601/50601fig2highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. נציג תמונות של ריאות fibrotic הנגרמות על ידי אינטובציה intratracheal של bleomycin. עכברי C57BL / 6 היו מחוברים לצינורות עם 1.2U/kg של bleomycin (B, D) או מלוח בקרה (A, C) והריאות שלהם נבדקו בהיסטולוגיה ביום 21 ממשל פוסט bleomycin. הגדלה: A, B: 40X, C, D: 100X. (ה) Hydroxyproline תוכן לריאות נמדד ביום 21 לבקרה ולריאות bleomycin שטופל. N = 6, ***:. P <0.001 לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
ילדה = "jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
איור 4. קשר בין מינון bleomycin ואזור פגוע של ריאה. מינון מוגבר של bleomycin (0.5, 1, ו 2 U / קילוגרם) באופן יחסי הגדיל את אחוז האזורים שנפגעו. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אינטובציה Intratracheal המתוארת כאן היא שיטה לא פולשנית פשוטה, אך מצוינת, כדי לספק באופן שווה חומרים המעניינים את ריאות עכבר. שיטה זו מאפשרת מחקר ההשפעה ו / או התפקיד של החומר מנוהל על הפיסיולוגיה ו / או פתולוגיה של ריאה. החומרים יכולים להיות מנוהלים על מולקולות אנדוגני כגון ציטוקינים, או חומרים אקסוגניים כגון כימיקלים / תרופות xenobiotic, חומרים מסרטנים, מזהמים, אלרגנים, או וירוסים הגורמים לתנאי ריאות שונים שיכול לייצג מודל לחקר מחלות אנושיות שונות 6-10. גם טכניקה זו יכולה לשמש בשילוב עם adenovirus או lentivirus רקומביננטי להציג את ביטוי יתר או מחיקה של גנים של עניין בתאי האפיתל בדרכי הנשימה כדי לחקור את תפקידם של גנים אלה בהומאוסטזיס, פיזיולוגיה, פתולוגיה, ו / או סרטן ריאות. השיבוש של גן יכול להיות מושגת על ידי להתבטאות recombinase Cre בתאי האפיתל לשבש גן floxed של בterest בתאי האפיתל 11.
קטטר בקלות יכול להיות מוכנס בטעות לתוך הוושט, שנמצא בצמוד לקנה הנשימה. בשיטה המתוארת כאן, מערכת תאורת אינטובציה מספקת הנחיות למיקום הנכון שבו קטטר צריך להיות מוכנס 5. המערכת מורכבת ממערכת עדשות אופטיות זעירה במיוחד מהונדסת המאפשרת לאור להתמקד על גבי הסיבים אופטיים, סיבי סיבי סיבים אופטיים שמחובר ביציבות למקור אור, ו. סוף האספקה של סיבי סיבים האופטיים מתאים לצנתרים תוך ורידי חד פעמי המשמשים כצינורות intratracheal. מערכת זו מספקת תאורה ישירה של הלוע התחתון, מה שמאפשר להדמיה ברורה של הגרון במהלך אינטובציה. ברגע אחד הופך להיות בקיא בביצוע טכניקה זו משתמשת במערכת תאורה, השימוש במערכת הוא כבר לא נחוץ. ההליך יכול להתבצע ביעילות רק עם קטטר, וכל procedure דורש רק כמה דקות. בדיוק באותה השיטה יכולה לשמש לחולדות עם מערכת תאורה גדולה יותר בגודל או קטטר.
שלוש נקודות הן קריטיות לאופן שווה להפיץ את החומר בכל הריאה. ראשית, תמיד למדוד את האורך בין הפה ונקודת הסתעפות הסימפונות לפני אינטובציה כדי לקבל מושג עד כמה עמוק קטטר צריך להיות מוכנס באמצעות עכבר בפועל (איור 1). מאז זה תלוי במידה רבה בגודל של העכבר, באותו אורך ההחדרה ניתן להשתמש פעם אחת הוא נקבע לעכברים בגודל מסוים. שנית, לוודא כי הפתרון הוסיף לצינור אינטובציה נשאב מייד אחרי כן שלה. אם צינור אינטובציה הוכנס בטעות לתוך הוושט, הפתרון לא להישאב באופן מיידי ובכך להישאר בצינור. אם זה יקרה, תחזור על כל התהליך של אינטובציה. תהליך אישור זה מבטיח כי הפתרון הוא בקנה הנשימה, אבל לא בוושט. המפעיל יכול לנסות 3x במקסימום לחזור על ההליך כולו אינטובציה אם הפתרון לא נשאב לתוך הריאות. עם זאת, אם זה קורה לעתים קרובות, מומלץ לחזור למנהג לרכוש שיעור מוצלח גבוה יותר. לבסוף, עכברים צריכים להיות מודעים במהלך אינטובציה, אשר מבטיח שהעכבר לא רקוק מה שמחובר לצינורות. במובן זה, השימוש בisoflurane עם חרטום, אשר עשויים גם להפריע פיזית עם אינטובציה אינו מומלץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תכנית המחקר העירונית של המכון הלאומי לסרטן, המרכז לחקר הסרטן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KetaVed | Vedco | Ketamine | |
| AnaSed Injection 20 mg | LLOYD | Xylazine | |
| BioLite Stand | Braintree Scientific | RIS100 | For mice |
| BioLite Intubation Illumination System | Braintree Scientific | BIO MI-KIT | For mice |
| 22 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2225CA | For mice below 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
| 20 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2025CA | For mice over 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
References
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J. Vis. Exp. (73), e50318 (2013).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7, e31359 (2012).
- Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702 (2011).
- Riesenfeld, E. P., et al. Inhaled salmeterol and/or fluticasone alters structure/function in a murine model of allergic airways disease. Respir. Res. 11, 22 (2010).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).
- Bonniaud, P., et al. Progressive transforming growth factor beta1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor. Am. J. Res. Crit. Care Med. 171, 889-898 (2005).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur. J. Pharm. Biopharm. 61, 214-218 (2005).
- Haegens, A., et al. Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production. J. Immunol. 182, 7990-7996 (2009).
- Jackson, P., et al. Exposure of pregnant mice to carbon black by intratracheal instillation: toxicogenomic effects in dams and offspring. Mutat. Res. 745, 73-83 (2012).
- Bodewes, R., et al. Pathogenesis of Influenza A/H5N1 virus infection in ferrets differs between intranasal and intratracheal routes of inoculation. Am. J. Pathol. 179, 30-36 (2011).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473, 101-104 (2011).
