Summary
A utilização de um modelo que simula a condição de doenças pulmonares em humanos é fundamental para o estudo da fisiopatologia e / ou etiologia de uma doença em particular e para o desenvolvimento da intervenção terapêutica. Aqui um método de intubação orotraqueal não invasivo que pode entregar diretamente materiais exógenos aos pulmões do rato é apresentado.
Abstract
A utilização de um modelo que simula a condição de doenças pulmonares em humanos é fundamental para o estudo da fisiopatologia e / ou etiologia de uma doença em particular e para o desenvolvimento da intervenção terapêutica. Com o aumento da disponibilidade de knockout e transgênicos derivados, juntamente com uma vasta quantidade de informação genética, os ratos fornecer um dos melhores modelos para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à patologia e fisiologia de doenças pulmonares. Inalação, instilação intranasal, instilação endotraqueal, e de intubação orotraqueal são as técnicas mais utilizadas por um número de investigadores para administrar materiais de interesse para os pulmões do rato. Há prós e contras de cada técnica de acordo com os objetivos de um estudo. Aqui um método de intubação orotraqueal não invasivo que pode entregar diretamente materiais exógenos aos pulmões do rato é apresentado. Esta técnica foi aplicada para administrar bleomicina para os pulmões do rato como um modelo para estudar a fibrose pulmonar. </ P>
Introduction
Pulmão é um órgão onde muitas doenças devastadoras são comumente diagnosticados. Entre eles, o câncer de pulmão é o segundo mais câncer diagnosticados em homens e mulheres, ea causa mais comum de morte por câncer. Doença pulmonar obstrutiva crônica, também conhecida como enfisema e bronquite crônica, é uma doença muito grave e a terceira principal causa de morte nos Estados Unidos. Em 2011, estimou-se que 25,9 milhões de americanos tinham asma, incluindo 7,1 milhões de crianças com idade inferior a 18 anos. A asma é a terceira causa de hospitalização entre crianças com menos de 15 anos de idade (American Lung Association, http://www.lung.org ). A fim de estudar a patofisiologia e / ou etiologia destas doenças devastadoras e os seus mecanismos subjacentes, o uso de modelos precisos é crítica em conjunto com a administração conveniente e não-invasiva de uma variedade de materiais de interesse para pulmão. Ratos fornecer um dos melhores modelosestudar os mecanismos moleculares subjacentes à patologia e fisiologia de doenças pulmonares, devido à crescente disponibilidade de nocaute e camundongos transgênicos e uma vasta quantidade de informação genética disponível.
Vários métodos têm sido utilizados por um número de investigadores em diferentes configurações para entregar materiais de interesse para os pulmões do rato, incluindo inalação, instilação intranasal, instilação endotraqueal, intubação orotraqueal e 1-4. Este último procedimento não tem sido utilizado rotineiramente, pois é considerado bastante difícil de executar. Intubação orotraqueal aqui descrito é um método não invasivo, simples e rápido para entregar materiais de interesse para os pulmões do rato para estudar o efeito dos materiais entregues em padrões de expressão genética, patologia e / ou fisiologia do pulmão 5. Esta técnica garante a entrega de materiais exógenos a um pulmão inteiro e não envolve qualquer cirurgia sobrevivência e, portanto, irá likely ser aprovado por todos os cuidados com os animais e uso de comitês institucionais.
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Protocol
O protocolo a seguir descreve um método não invasivo, simples e rápido para entregar materiais de interesse para os pulmões do rato. Este procedimento foi aprovado pelo Comitê Animal Care e Use o Instituto Nacional do Câncer.
1. Anestesia
- Primeiro, anestesiar o rato, utilizando uma mistura de cetamina e xilazina (100 mg / kg de peso corporal e 10 mg / kg de peso corporal, respectivamente). Este é o recomendado ACUC anestesia e dose. Com essa quantidade, os ratos são inconscientes, pelo menos para ~ 20 min.
- Aplicar veterinário pomada para os olhos do rato, a fim de evitar o ressecamento dos olhos durante a anestesia.
- Após vários minutos, beliscar um pé do mouse para verificar se há consciência. Uma vez confirmada inconsciente, coloque o mouse sobre um suporte intubação ângulo de ~ 60 ° e segurá-la no lugar ligando seus incisivos superiores sobre uma pequena faixa de borracha localizado na parte superior do suporte.
2. Intubação orotraqueal
Nota: A fim de obter o comprimento adequado do cateter a ser introduzido, inicialmente, medir o comprimento entre a boca e o ponto de bifurcação brônquica por meio de um rato prática de um tamanho semelhante em avanço (figura 1). O comprimento depende em grande parte do tamanho do animal. Inserção do cateter deve parar acima do ponto de bifurcação (cerca de 1,5 cm para o rato com ~ 25 g de peso corporal). Isso garante que o material entubado vai para todos os lobos. Pelo menos 50 práticas mice pode ser necessária para uma pessoa que executa a intubação para tornar proficientes na técnica (avançado significa que a taxa de sucesso de intubação é mais do que 95%).
- Uma vez que o cateter é inserido, remover rapidamente a guia de luz de fibra óptica a partir do cateter para permitir que o animal a respirar normalmente. Quando o sistema de iluminação de intubação não é usado, inserir directamente um cateter, conforme descrito.
- Adicionar uma solução contendo materiais de interesse para um cateter. Certifique-se de que a solução é sugado para dentro do pulmão imediatamente após a adição. Cinquenta microlitros para ~ 25 g de peso corporal do rato é usado rotineiramente.
3. Recuperação de Animais
- Assim que a solução é sugado para dentro do pulmão, derrubar o mouse do estande, e colocá-lo de volta para a gaiola de origem.
- Observe o rato até que ele começa a se mover.
- Uma vez confirmado que o rato está em boas condições, volte a gaiola para um rack.
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Representative Results
Inicialmente, a solução verde-tingido foi usado para entubar camundongos para a prática. O pulmão foi ressecado imediatamente após a intubação para examinar o modo como a cor uniformemente distribuído no pulmão (Figura 2). Esta técnica foi aplicada ao estudo de fibrose pulmonar induzida por bleomicina utilizando ratinhos C57BL / 6. Quando os ratos foram entubados intratraquealmente com 1,2 U / kg de bleomicina ou solução salina como controlo e necropsiados três semanas mais tarde, os ratos desenvolveram fibrose induzida por bleomicina em todo seus pulmões, suportado por histologia e o aumento do teor de hidroxiprolina (Figura 3). A área danificada foi avaliada utilizando objetiva de 20X criou imagens de pulmão e um de 121 pontos de grade estrutura. O número de interseções (pontos) que caem sobre as áreas fibrosas foram contados e expressos em percentagem do total (121) pontos. A percentagem das áreas danificadas, assim contadas foi proporcional à quantidade de bleomicina administrada (Figura 4).
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Figura 1. Ilustração do rato traquéia. Os bares e setas vermelhas indicam a extensão em que a medição deve ser feita antes da intubação usando um mouse prática. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 2. Aparecimento de pulmão direito, após ter sido entubado com corante verde. Se a cor do corante pode ser visto na maior parte das regiões do pulmão, entubação é considerado bem sucedido.ad/50601/50601fig2highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. Imagens representativas dos pulmões fibrose induzidas por intubação intratraqueal de bleomicina. C57BL / 6 foram entubados com 1.2U/kg de bleomicina (B, D) ou salina como controle (A, C) e seus pulmões foram examinados histologicamente no dia 21 de administração pós-bleomicina. Ampliação: A, B: 40X: C, D: 100X. (E) Hidroxiprolina conteúdo por pulmão medido no dia 21 para controle e bleomicina tratado pulmões. N = 6, ***:. P <0.001 Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 4. Relação entre a dose bleomicina e área danificada do pulmão. O aumento da dose de bleomicina (0,5, 1 e 2 U / kg) proporcionalmente aumentou a porcentagem de áreas danificadas. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
Intubação orotraqueal aqui descrito é um método não invasivo simples, mas excelente para entregar uniformemente materiais de interesse para rato pulmão. Este método permite o estudo do efeito e / ou a função do material administrado na fisiologia e / ou patologia do pulmão. Os materiais administrados podem ser moléculas endógenas, tais como as citoquinas, ou de materiais exógenos, tais como produtos químicos e / ou drogas, xenobióticos cancerígenos, poluentes, alérgenos, ou vírus que resultam em várias doenças pulmonares que podem representar um modelo para o estudo de várias doenças humanas 6-10. Esta técnica também pode ser usada em conjunto com o adenovírus recombinante ou lentivírus para introduzir a sobre-expressão ou supressão de genes de interesse em células epiteliais das vias respiratórias para estudar o papel destes genes na homeostase, fisiologia, patologia e / ou a carcinogénese do pulmão. A ruptura de um gene pode ser conseguida por expressam transitoriamente a recombinase Cre em células epiteliais para interromper um gene de floxed emteresse nas células epiteliais 11.
Um cateter pode facilmente ser erroneamente inserido no esôfago, que se justapõe à traquéia. No método descrito aqui, o sistema de iluminação intubação fornece orientação para a posição correta em que o cateter deve ser inserido 5. O sistema é composto de uma fibra de fibra óptica que está estavelmente ligado a uma fonte de luz, e um sistema de lentes ópticas em miniatura, especialmente concebido que permite que a luz para focar sobre a fibra de fibra óptica. A extremidade de distribuição da fibra óptica encaixa nos cateteres intravenosos descartáveis que são utilizados como tubos de intratraqueais. Este sistema oferece uma iluminação direta da orofaringe, permitindo melhor visualização da laringe durante a intubação. Uma vez que se torna eficiente para a realização desta técnica que utiliza o sistema de iluminação, a utilização do sistema não é mais necessário. O processo pode ser realizada de forma eficiente, com apenas um cateter, e todo o pROCEDIMENTO requer apenas alguns minutos. O mesmo método pode ser usado para os ratos com um sistema de iluminação de maior tamanho, ou cateter.
Três pontos são críticos para distribuir uniformemente o material de todo o pulmão. Em primeiro lugar, sempre medir o comprimento entre a boca eo ponto de bifurcação brônquica antes da intubação, a fim de ter uma idéia de quão profundo o cateter deve ser inserido usando um mouse prática (Figura 1). Uma vez que esta depende em grande parte do tamanho do animal, o mesmo comprimento da inserção pode ser utilizado, uma vez que é determinada para os ratinhos de um determinado tamanho. Em segundo lugar, certifique-se de que a solução adicionado ao tubo de intubação é sugado logo após a sua adição. Se o tubo de intubação se erradamente inserido no esófago, a solução não vai ser sugada imediatamente e, assim, permanecer dentro do tubo. Se isso acontecer, repita todo o processo de intubação. Este processo assegura a confirmação de que a solução está na traqueia, mas não naesôfago. O operador pode tentar 3x no máximo para repetir o procedimento de intubação todo se a solução não é sugado para dentro do pulmão. No entanto, se isso acontece com frequência, recomenda-se a voltar para a prática de adquirir taxa de sucesso mais elevada. Por último, os ratos devem estar inconsciente durante a intubação, o que garante que o mouse não expectorar o que estava entubado. Neste sentido, não é recomendado o uso de isoflurano com um cone do nariz, o que também pode interferir fisicamente com intubação.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Programa do Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer Research intramuros.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KetaVed | Vedco | Ketamine | |
| AnaSed Injection 20 mg | LLOYD | Xylazine | |
| BioLite Stand | Braintree Scientific | RIS100 | For mice |
| BioLite Intubation Illumination System | Braintree Scientific | BIO MI-KIT | For mice |
| 22 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2225CA | For mice below 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
| 20 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2025CA | For mice over 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
References
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