Summary
El uso de un modelo que imita el estado de las enfermedades pulmonares en los seres humanos es crítico para el estudio de la fisiopatología y / o la etiología de una enfermedad en particular y para el desarrollo de la intervención terapéutica. Aquí un método intubación endotraqueal no invasivo que puede entregar directamente materiales exógenos a los pulmones del ratón se presenta.
Abstract
El uso de un modelo que imita el estado de las enfermedades pulmonares en los seres humanos es crítico para el estudio de la fisiopatología y / o la etiología de una enfermedad en particular y para el desarrollo de la intervención terapéutica. Con la creciente disponibilidad de knockout y transgénicos derivados, junto con una gran cantidad de información genética, los ratones proporcionan una de las mejores modelos para estudiar los mecanismos moleculares que subyacen a la patología y la fisiología de las enfermedades pulmonares. Inhalación, instilación intranasal, la instilación intratraqueal, y la intubación endotraqueal son las técnicas más utilizadas por varios investigadores para administrar los materiales de interés para los pulmones del ratón. Hay pros y los contras de cada técnica en función de los objetivos de un estudio. Aquí un método intubación endotraqueal no invasivo que puede entregar directamente materiales exógenos a los pulmones del ratón se presenta. Esta técnica se aplica para administrar bleomicina a los pulmones del ratón como un modelo para estudiar la fibrosis pulmonar. </ P>
Introduction
Pulmón es un órgano donde muchas enfermedades devastadoras son comúnmente diagnosticados. Entre ellos, el cáncer de pulmón es el segundo cáncer más diagnosticado en hombres y mujeres, y la causa más común de muerte por cáncer. Enfermedad pulmonar obstructiva crónica, también conocida como el enfisema y la bronquitis crónica, es una enfermedad muy grave y la tercera causa principal de muerte en los Estados Unidos. En 2011, se estimó que 25,9 millones de estadounidenses tenían asma, incluyendo 7,1 millones de niños menores de 18 años. El asma es la tercera causa de hospitalización entre los niños menores de 15 años (American Lung Association, http://www.lung.org ). Con el fin de estudiar la fisiopatología y / o la etiología de estas enfermedades devastadoras y sus mecanismos subyacentes, el uso de modelos precisos es crítica en relación con la administración conveniente y no invasiva de varios materiales de interés para pulmón. Los ratones proporcionan una de las mejores modelos deestudiar los mecanismos moleculares que subyacen a la patología y fisiología de enfermedades pulmonares a causa de la creciente disponibilidad de knockout y los ratones transgénicos y una gran cantidad de información genética disponible.
Varios métodos han sido utilizados por un número de investigadores en diferentes contextos para entregar materiales de interés para los pulmones del ratón, incluyendo inhalación, instilación intranasal, la instilación intratraqueal, y la intubación endotraqueal 1-4. Este último procedimiento no ha sido utilizado de forma rutinaria, ya que se considera más bien difícil de realizar. Intubación intratraqueal se describe en el presente documento es un método no invasivo, simple y rápida para entregar materiales de interés para los pulmones del ratón con el fin de estudiar el efecto de los materiales entregados en los patrones de expresión de genes, la patología y / o la fisiología del pulmón 5. Esta técnica asegura la entrega de materiales exógenos a todo un pulmón y no implica cualquier tipo de cirugía la supervivencia y por lo tanto se likely ser aprobado por los comités de cuidado y uso de animales institucionales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El siguiente protocolo describe un método no invasivo, simple y rápida para entregar materiales de interés para los pulmones del ratón. Este procedimiento fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo del Instituto Nacional del Cáncer.
1. Anestesia
- En primer lugar, anestesiar el ratón utilizando una mezcla de ketamina y xilazina (100 mg / kg de peso corporal y 10 mg / kg de peso corporal, respectivamente). Este es el ACUC recomienda la anestesia y la dosis. Con esta cantidad, los ratones son inconscientes por lo menos durante ~ 20 min.
- Aplique un ungüento veterinario para los ojos del ratón con el fin de prevenir la sequedad en los ojos durante la anestesia.
- Después de varios minutos, pellizque un pie del ratón para comprobar si hay conciencia. Una vez confirmado inconsciente, coloque el ratón en un soporte intubación un ángulo de ~ 60 ° y mantenerlo en su lugar mediante la conexión de sus incisivos superiores sobre una banda pequeña de goma situado en la parte superior del soporte.
2. La intubación intratraqueal
Nota: Con el fin de obtener la longitud adecuada de catéter para ser insertado, medir inicialmente la longitud entre la boca y el punto de bifurcación bronquial mediante el uso de un ratón de la práctica de un tamaño similar en avance (Figura 1). La longitud depende en gran medida del tamaño del ratón. La inserción del catéter debe detener por encima del punto de bifurcación (~ 1,5 cm para ratón con ~ 25 g de peso corporal). Esto asegura que el material intubado irá a todos los lóbulos. Al menos 50 prácticas micE puede ser requerido para una persona que realiza la intubación para alcanzar la competencia en la técnica (Competente significa que la tasa de éxito de la intubación es más del 95%).
- Una vez que se inserta el catéter, retire rápidamente la guía de luz de fibra óptica de la sonda para que el animal pueda respirar normalmente. Cuando no se utiliza el sistema de intubación Iluminación, insertar directamente un catéter según lo descrito.
- Añadir una solución que contiene materiales de interés a un catéter. Asegúrese de que la solución se aspira en los pulmones inmediatamente después de la adición. Cincuenta microlitros de ~ se utiliza de forma rutinaria 25 g de peso corporal del ratón.
3. Recuperación de Animales
- Tan pronto como la solución se aspira en los pulmones, acabar con el ratón desde la base, y vuelva a colocarlo en la caja originales.
- Observe el ratón hasta que empiece a moverse.
- Una vez confirmado que el ratón está en buenas condiciones, volver a la jaula para un rack.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inicialmente, la solución de color verde teñido se utiliza para intubar ratones durante la práctica. El pulmón fue resecado inmediatamente después de la intubación para examinar cómo de manera uniforme el color se distribuye en el pulmón (Figura 2). Esta técnica se ha aplicado para estudiar la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina utilizando ratones C57BL / 6. Cuando los ratones fueron intubados por vía intratraqueal con 1,2 U / kg de bleomicina o solución salina como control y la necropsia 3 semanas más tarde, los ratones desarrollaron la fibrosis inducida por bleomicina lo largo de sus pulmones, apoyado por la histología y el aumento del contenido de hidroxiprolina (Figura 3). El área dañada se evaluó usando 20X objetivo creado imágenes pulmonares y 121 puntos de la rejilla de celosía. Se contó el número de intersecciones (puntos) que caen sobre las áreas fibrosas y se expresa como el porcentaje de (121) puntos totales. El porcentaje de las áreas dañadas de este modo contadas era proporcional a la cantidad de bleomicina administrada (Figura 4).
"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> 
Figura 1. Ilustración de la tráquea de ratón. Las barras de color rojo y las flechas indican la longitud en que la medida se debe tomar antes de la intubación usando un ratón práctica. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Aspecto del pulmón derecho después de ser intubado con el tinte verde. Si el color del tinte se puede ver en la mayoría de las partes del pulmón, la intubación se considera exitoso.ad/50601/50601fig2highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. Imágenes representativas de los pulmones fibróticos inducidos por la intubación intratraqueal de bleomicina. C57BL / 6 ratones fueron intubados con 1.2U/kg de bleomicina (B, D) o solución salina como control (A, C) y sus pulmones se examinaron histológicamente en el día 21 después de la administración-bleomicina. Ampliación: A, B: 40X; C, D: 100X. (E) Hidroxiprolina contenido por pulmón medido en el día 21 para el control y los pulmones tratados con bleomicina. N = 6, ***:. P <0,001 clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 4. Relación entre la dosis de bleomicina y el área dañada del pulmón. El aumento de la dosis de bleomicina (0,5, 1 y 2 U / kg) aumentó proporcionalmente el porcentaje de áreas dañadas. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intubación intratraqueal aquí descrito es un método no invasivo simple, pero excelente para entregar de manera uniforme los materiales de interés para los pulmones del ratón. Este método permite el estudio del efecto y / o función del material administrado en la fisiología y / o patología de pulmón. Los materiales administrados pueden ser moléculas endógenas, tales como citocinas, o materiales exógenos tales como productos químicos xenobióticos / fármacos, carcinógenos, contaminantes, alérgenos, o virus que resultan en diversas enfermedades pulmonares que pueden representar un modelo para el estudio de varias enfermedades humanas 6-10. Esta técnica también se puede utilizar en conjunción con adenovirus recombinante o lentivirus para introducir la sobreexpresión o deleción de los genes de interés en las células epiteliales de las vías respiratorias para estudiar el papel de estos genes en la homeostasis, la fisiología, la patología, y / o la carcinogénesis de pulmón. La interrupción de un gen se puede lograr que expresan transitoriamente la recombinasa Cre en las células epiteliales para interrumpir un gen de floxed eninterés por las células epiteliales 11.
Un catéter puede ser fácilmente insertado por error en el esófago, que se yuxtapone a la tráquea. En el método descrito aquí, el sistema de iluminación Intubación proporciona orientación para la posición correcta donde el catéter se debe insertar 5. El sistema consta de una fibra de fibra óptica que está conectada de manera estable a una fuente de luz, y un sistema de lente óptica en miniatura especialmente diseñado que permite que la luz se concentre sobre la fibra de fibra óptica. El extremo de entrega de la fibra de fibra-óptica encaja en los catéteres intravenosos desechables que se utilizan como tubos intratraqueal. Este sistema proporciona una iluminación directa de la orofaringe, lo que permite una clara visualización de la laringe durante la intubación. Una vez que uno se convierte competentes en la realización de esta técnica utilizando el sistema de iluminación, el uso del sistema ya no es necesario. El procedimiento se puede realizar de manera eficiente con sólo un catéter, y toda la procedimiento requiere sólo unos pocos minutos. El mismo método exacto se puede utilizar para las ratas con un sistema de iluminación de mayor tamaño, o catéter.
Tres puntos son críticos para distribuir de manera uniforme el material en todo el pulmón. En primer lugar, siempre hay que medir la distancia entre la boca y el punto de bifurcación bronquial antes de la intubación con el fin de tener una idea de qué tan profundo se debe insertar el catéter usando un ratón práctica (Figura 1). Dado que esto depende en gran medida del tamaño del ratón, la misma longitud de inserción se puede utilizar una vez que se determina para los ratones de un tamaño particular. En segundo lugar, asegúrese de que la solución al tubo de intubación se aspira después de su adición. Si el tubo de la intubación se inserta por error en el esófago, la solución no será succionado en inmediatamente y por lo tanto permanece en el tubo. Si esto ocurre, repita todo el proceso de intubación. Este proceso de confirmación asegura que la solución está en la tráquea, pero no en elesófago. El operador puede tratar 3x a la máxima para repetir todo el procedimiento de intubación si la solución no es aspirado en el pulmón. Sin embargo, si esto sucede con frecuencia, se recomienda volver a la práctica de adquirir mayor tasa de éxito. Por último, los ratones deben estar inconsciente durante la intubación, lo que asegura que el ratón no sería escupir lo que estaba intubado. En este sentido, no se recomienda el uso de isoflurano con un cono de la nariz, que también puede interferir físicamente con la intubación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional del Cáncer, el Centro para la Investigación del Cáncer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KetaVed | Vedco | Ketamine | |
| AnaSed Injection 20 mg | LLOYD | Xylazine | |
| BioLite Stand | Braintree Scientific | RIS100 | For mice |
| BioLite Intubation Illumination System | Braintree Scientific | BIO MI-KIT | For mice |
| 22 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2225CA | For mice below 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
| 20 G, 1 inch i.v. catheter | Terumo | SR-OX2025CA | For mice over 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used. |
References
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J. Vis. Exp. (73), e50318 (2013).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7, e31359 (2012).
- Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702 (2011).
- Riesenfeld, E. P., et al. Inhaled salmeterol and/or fluticasone alters structure/function in a murine model of allergic airways disease. Respir. Res. 11, 22 (2010).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).
- Bonniaud, P., et al. Progressive transforming growth factor beta1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor. Am. J. Res. Crit. Care Med. 171, 889-898 (2005).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur. J. Pharm. Biopharm. 61, 214-218 (2005).
- Haegens, A., et al. Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production. J. Immunol. 182, 7990-7996 (2009).
- Jackson, P., et al. Exposure of pregnant mice to carbon black by intratracheal instillation: toxicogenomic effects in dams and offspring. Mutat. Res. 745, 73-83 (2012).
- Bodewes, R., et al. Pathogenesis of Influenza A/H5N1 virus infection in ferrets differs between intranasal and intratracheal routes of inoculation. Am. J. Pathol. 179, 30-36 (2011).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473, 101-104 (2011).
