Summary
Vi beskriver här en plattform som tillåter comet assay detektion av DNA-skador med oöverträffad genomströmning. Enheten mönster däggdjursceller i en microarray och möjliggör parallell bearbetning av 96 prover. Ansatsen underlättar analysen av basnivån DNA skada, exponering-inducerad DNA-skador och DNA-reparation kinetik.
Introduction
Den enda cell gelelektrofores (SCGE) analys (aka comet assay) är en allmänt använd teknik för kvantifiering av ett brett spektrum av DNA-skador, bland annat bas lesioner, abasiska ställen, enkla strängbrott, dubbelsträngsbrott, tvärbindningar och alkali känsliga webbplatser. Den underliggande principen för analysen är att skadat DNA migrerar lättare än oskadad DNA på grund av fragmentering och förlust av superhelixstruktur. Graden av migration är proportionell mot mängden av DNA-skada, och kan visualiseras med användning av fluorescensmikroskopi. Bild-capture och intensitet profilanalys av individuella kometformade DNA levererar sedan parametermätningar såsom svanslängd, svansen ögonblick och% DNA i svansen för att avslöja graden av DNA-skador i en cell 1-4.
För närvarande finns det två vanliga versioner av comet assay: a) alkaliskt komet analys och b) neutral comet assay. Den alkaliska comet assay är den mestbegagnad version, som använder ett högt pH-buffert för att varva ner DNA före elektrofores och därmed upptäcker alla typer av strängbrott och alkali-känsliga platser. Den neutrala kometanalysen, å andra sidan, är mindre praktiseras eftersom den använder en neutral buffert för att upprätthålla de dubbla spiralerna och detektera endast dubbla strängbrott 2,5. För kemiska och fysiska faktorer som inducerar DSBs är SSBS skapas i samförstånd, och bildas på mycket högre nivåer (t.ex. γIR-inducerade SSBS är en storleksordning vanligare än DSB). För de flesta DNA-skadande exponeringar DSBs är mycket mindre frekvent än andra klasser av DNA-skador, och är därmed svårare att upptäcka. Vi har visat i tidigare publikationer fönstret i båda versionerna upptäckt. 6,7
Även kometen analys har rutinmässigt används för grundforskning om DNA-skador och reparation och genotoxicitetstester 1,2,8-15 har analysen rapporterats ha dålig reproducerbarhet på grund av prov-till-prov, person-till-person och lab-till-lab variabilitet. Dessutom är analysen låg genomströmning, delvis eftersom bildinhämtning och dataanalys är mödosam. Tillsammans utgör dessa begränsningar bidrar till dess relativt låga acceptans i storskaliga studier. Genom integrering av ingenjörsteknik och principer, ger CometChip en lösning på problemen med genomströmning och inkonsekvenser som är förknippade med den traditionella comet assay 6,7. Kortfattat, för att skapa chip, är en form mikrofabricerad använder fotolitografi för att skapa microposts med diametrar så små som den för en enda cell. Formen används sedan för att stämpla på smält agaros, vilket resulterar i en matris av mikrobrunnar efter gelén stelnar. Chips tas fram för att ge forskare med varierande storlek brunnar kompatibel med olika celltyper. För att ladda chipet är celler i media sedimentera i brunnarna genom tyngdkraften; överskott cellerna tvättas bort. Fångad celler inkapslas sedan ossing av ett tunt skikt av lågsmältande agaros och ett botten 96 brunnars platta därefter klämmas mot gelytan att skapa 96 macrowells, vardera med hundratals mikrobrunnar på dess bottenyta.
Detta protokoll beskriver de allmänna förfarandena för experiment med detta chip, bland annat förberedelse gel, cell lastning, dosering och reparation, cellys, elektrofores, och fluorescerande avbildning. Vi visar två exempel på dos-responsexperiment med lymfoblastceller exponerade kända DNA-skadande medel, med hjälp av alkaliska och neutrala versioner av analysen respektive. Två reparationsförsök visas också att beskriva hur reparations respons efter exponering kan utvärderas med hjälp av systemet.
Protocol
1 Beredning av Chip
- Ta bort spån gel från förpackningen och plats i en en-väl rektangulär platta, gel filmsidan nedåt.
- Tvätta gelén i 25 ml 1 x PBS under 15 min, upprepa två gånger.
- Ställ gel på glasplatta och etikettorientering gel därefter.
- Tryck försiktigt en inverterad bottenlös 96-brunnar på gelén; se till att alla brunnar i den bottenhålsplatta ligger inom det område av gelén.
- Använd 1.5 '' bindemedel klipp på vardera sidan av plattan för att säkra fastspänning med glaset.
- Sug bort överskott PBS-buffert i varje brunn.
2. Lastceller
- Förbered cellsuspensioner:
- För upphängnings cellinjer, utspädd cellsuspension i media för att få en slutkoncentration av 10 5 -10 6 celler / ml.
- För vidhäftande cellinjer, följ normala loss / trypsinization protokoll och dilute lösgjorda celler i medium till en slutlig koncentration av 10 5 -10 6 celler / ml. Om celler aggregerar, passera cellsuspensionen i ett cellfilter för att erhålla en enkelcellsuspension.
- Lägg 100 | il cellsuspension till varje brunn i 96-brunnars platta.
- Täckplatta med gelfilmen att förhindra avdunstning av media.
- Låt cellerna att ladda i minst 30 min i 37 ° C inkubator.
- Ta chip från inkubator och aspirera media från varje brunn.
- Ta bindemedel klipp och bottenlös 96-brunnar; håll chip med glasplattan i en vinkel och försiktigt skölja med 1 x PBS för att avlägsna överskott av celler på agaros.
- Kontrollera cell lastning med ett ljust fält mikroskop med en 4X objektiv. Om otillräcklig belastning observeras, upprepa från steg 2.1.
- Placera lastad chip på en plan yta (lab bänk). Overlay chip med 1% låg smältpunkt (LMP) agaros som är förvärmda vid 37 ° C. Använd ungefär 2̵1, 3 ml LMP agaros behövs för varje chip.
- Låt över stelna först vid RT i 3 min och sedan flytta till 4 ° C kylskåp i 5 minuter för fullständig gelning.
3 Dosering och reparation
OBS: För att studera baslinjen DNA skadorna, gå direkt till steg 4.
- Försiktigt anpassa brunnarna i chipet (som skapats av tidigare fastspänning) med brunnarna i ett nytt bottenlöst 96-brunnar. Åter tryck den bottenlösa 96-brunnar på topp och säker fastspänning med bindemedel klipp.
- Lägg 100 pl av kemisk av önskade dosen till varje brunn i 96-brunnars platta; utför dosering / behandling på is eller i 4 ° C kylskåp för önskad tid.
- Efter dosering, aspirera kemikalier från varje brunn och skölja bort kvarvarande kemikalier med hjälp 1x PBS. Om studeras direkt skada här, gå vidare till steg 4.
- För att studera reparations kinetik, låta cellerna i chippet för att reparera inmedier vid 37 ° C. Lyse (gå vidare till steg 4) vid specifika tidpunkter.
OBSERVERA: Reparation kan utföras on-chip med en bottenlös 96-brunnars platta fastsatt eller chipet kan skäras till separata bitar efter avlägsnande av den bottenlösa 96-brunnar.
4. Lysis
- För att utföra alkaliska comet assay:
- Gör arbetar alkalisk lysisbuffert genom tillsats 1% Triton X-100 till alkalisk lys-stamlösning (2,5 M NaCl, 100 mM Na-2-EDTA, 10 mM Tris, pH 10). Förbered ca 25 ml arbetslyseringsbuffert för varje chip.
- Pre-chill arbetar alkalisk lys-buffert vid 4 ° C.
- Sänk chip svalt arbetar alkalisk lyseringsbuffert och låt lys att utföra O / N på 4 ° C kylskåp.
- För att utföra neutral comet assay:
- Gör arbetar neutral lysbuffert genom tillsats av 1% Triton X-100 och 10% DMSO till neutral lysestamlösning (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10mM Tris, 1% N -Lauroylsarcosine, pH 9,5). Förbered ca 25 ml arbetslyseringsbuffert för varje chip.
- Pre-warm arbetar neutral lyseringsbuffert vid 43 ° C.
- Sänk chip i varmt arbeta neutral lyseringsbuffert och låt lys att utföra O / N på 43 ° C inkubator.
5. Elektrofores
- För att utföra alkaliska comet assay:
- Ta lysbuffert och snabbt spola chip med 1x PBS.
- Säker chip i en elektroforeskammare med gel filmsidan nedåt med hjälp av dubbelhäftande tejp.
- Bring kammaren till ett 4 ° C kallt rum.
- Fyll kammaren med kallt alkaliskt elektroforesbuffert (0,3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA) till en nivå som precis täcker gelén.
- Låt för alkalisk palats i 40 minuter.
- Kör elektrofores vid 1 V / cm och 300 mA under 30 minuter i det kalla rummet. Justera volymen på elektroforesbuffert i chamber att uppnå önskad rinnande ström.
- För att utföra neutral comet assay:
- Avlägsna lysbuffert och skölj chip med neutral elektroforesbuffert (2 mM Na2EDTA, 90 mM Tris, 90 mM borsyra, pH 8,5) under 2 x 15 min vid 4 ° C.
- Säker chip i en elektroforeskammare med gel filmsidan nedåt med hjälp av dubbelhäftande tejp.
- Bring kammaren till ett 4 ° C kallt rum.
- Fyll kammaren med kall neutral elektroforesbuffert (2 mM Na2EDTA, 90 mM Tris, 90 mM borsyra, pH 8,5) till en nivå som precis täcker gelén.
- Låt gelen sitta i kylrum i 60 min.
- Kör elektrofores vid 0,6 V / cm och 6 mA i 60 minuter i det kalla rummet. Justera volymen på elektroforesbuffert i kammaren för att uppnå löpning önskad ström.
6. Fluorescent Imaging
- Ta chip från elektrofores kammaren från cold rum.
- Neutralisera gelerna i neutraliseringsbuffert (0,4 M Tris, pH 7,5) under 2 x 15 min i 4 ° C kylskåp.
- Färga chipet med fluorescerande DNA fläck val (dvs SYBR Gold, etidiumbromid) under fabriken rekommenderade procedurer. Bild med fluorescerande mikroskopi.
7. Data Analysis
Analysera komet bilder efter standard comet assay programvara såsom Komet 5.5.
Representative Results
I det här första exemplet beskriver vi den metod för kvantifiering initiala nivåer av DNA-skador i humana lymfoblastoidceller efter exponering för oxidativ skada med hjälp av H 2 O 2. För att bedöma H 2 O 2-inducerade bas lesioner och enstaka strängbrott, är alkaliska komet villkor som används. Efter laddning är komplett och celler har inkapslats med agarosöverskikt är en bottenlös 96-brunnsplatta pressas mot ytan för att skapa 96-fack på chipet. Var och en av de 96-brunnarna kan doseras med en annan typ eller koncentration av kemikalier. Här fyra olika doser av H 2 O 2 användes och 1x PBS användes som den negativa kontrollen. Representativa bilder av ordnade kometer visas i figur 1 A, där icke-behandlade (överst), 50 ^ M (mitten) och 100 ^ M (botten) H 2 O 2 -exposed prover visade olika nivåer av kometsvansar. Analys av komet bilder kan utför litenMed hjälp av kommersiellt tillgängliga program, som i allmänhet kvantifierar skadenivåer baserad på den totala fluorescensintensiteten och migration avståndet för varje kometsvans. Mätningar vanligen utförs på 50 till 100 kometer per tillstånd och medianvärdet (antingen% svans DNA eller svanslängd) beräknas. Figur 1B illustrerar den procentuella svansen DNA responskurva analyseras från TK6 lymfoblastoida kometer som utsätts för fyra olika koncentrationer av H 2 O 2. Konsistensen bland oberoende experiment visar effekten av denna metod för att bedöma DNA-skador svar från olika nivåer av kemiska behandlingar i celler.
Om du vill veta om variation bland prover (t.ex. bland macrowells) och bland upprepningar av samma experiment, var mellan prov och inter experimentell variabilitet plottas i Figur 2A och 2B respektive. Inom varje experiment, varvid varje brunn i 96-well chip motsvarar en annan prov och därmed väl att bra variation avslöjar interprov variant av anordningen. Här var TK6 celler laddade i 12 brunnar i 96-håls chip behandlas med samma dos av H 2 O 2 och omedelbart lyserades efter behandling. Alla andra experimentella steg utfördes parallellt och medianerna minst 50 kometer från varje macrowell avsattes i figur 2A. Genomsnittet av median är 77.53% DNA i svansen, med standardavvikelsen är 3.99%. Från dessa data beräknar vi att variationskoefficienten bland prover är 5,2%, vilket är flera gånger lägre än den traditionella analysen, vilket visar förbättrad robusthet denna analys 6,16. Om du vill veta om reproducerbarhet av analysen, exponerade vi TK6-celler i ett chip med 75 ^ M H 2 O 2 och analysera den omedelbara nivån av DNA-skador. Detta experiment upprepades sex gånger och data av varje experiment plottades i FIGUR 2B. Under samma försöksbetingelser, fick vi resultaten som sträcker sig från 41.76% till 57.87%, visas som grå staplar i figuren. Medelvärdet av sex upprepningar är 49.57%, med standardfel medelvärdet på endast 2,04%. Den låga variationen bland upprepningar innebär att kometen analysen utförs på denna nya enhet är mycket reproducerbar.
För att utvärdera reparations kinetik, celler tillåts att reparera sitt DNA i färskt medium efter behandling. Lyserings macrowells vid olika tidpunkter visar förändringen i DNA-skada över tid. Ett exempel visas i Figur 3. I detta experiment var TK6 celler först inkapslas i chippet, behandlades med 50 | iM H 2 O 2, och tilläts att reparera upp till 60 min efter exponering. Celler lyserades vid 0, 20, 45 och 60 minuter respektive. Representativa komet bilder vid olika tidpunkter visas i figur 3A, och förändringen i DNA-skadenivåer över tiden plottas i Figur3B. Dessa data visade att nästan alla av skadan repareras inom 45 minuter efter H 2 O 2 behandling. Många variabler kan påverka graden av reparation, inklusive typ av cellinje och kemiskt medel som används. Därför forskare kan göra ändringar i protokollet (dvs förlänga reparationstiden) för att tillgodose ytterligare behov i sina undersökningar. Här ger vi ett annat exempel på reparations experiment med detta chip, varvid TK6 celler utmanas med ett annat genotoxiskt medel N-metyl N '-Nitro- N -Nitrosoguanidine (MNNG) är ett alkylerande medel känt för att framkalla bas lesioner inklusive 7-metylguanin och 3-metyladenin. Dessa skador är konverteras till abasiska ställen antingen genom spontan depurinering eller genom enzymatisk avlägsnande genom DNA glykosylaser. Den resulterande abasisk plats kan klyvas under alkaliska förhållanden och därmed upptäcks på chipet. Initial exponering orsakar en signifikant ökning i skada, uppenbart från den långasvansar, och med tiden dessa svansar minskar som cellerna åter intakt DNA under reparation. Även alkylering och oxidativ skada är båda i första hand repareras av basen excision reparationsvägen, den mängd skador som genereras och de proteiner som är involverade i reparations varierar. Dessa variationer kan leda till olika växelkurser för abasiska ställen, liksom olika skattesatser för reparation av de resulterande abasiska platserna. I fig 4, reparation kinetiken för TK6-celler exponerades för 0,1, 1, och 3 | ig / ml MNNG visas. I detta experiment utökade vi experimentet tid till 2 timmar efter exponering eftersom MNNG-inducerad skador tycks kvarstå längre och rensas i en långsammare takt jämfört med H 2 O 2-inducerad skador.
Analys av DSBs använder neutrala förhållanden är mycket likt det protokoll för analys av enkelsträngade lesioner med hjälp av alkaliska förhållanden. För att visa initiala skadenivåer, var TK6 celler utsätts för variabla nivåer av gir, och de resulterande cellerna lyserades och utsattes för elektrofores vid ett neutralt pH-värde (Figur 5A). Det är anmärkningsvärt att morfologi komet svansar skiljer sig från de alkaliska analysbetingelser. För att uppnå observerbar fragmenterat DNA med användning av denna analys, är IR-dosen som användes signifikant högre (0-100 Gy) än den dos som krävs för att visa skador med användning av de alkaliska betingelser. Dessutom fann vi att svansen längden är den känsligaste parametern återspeglar omfattningen av DNA-skador vid användning av neutrala comet assay 7. Den analyserade dosresponskurvan illustreras i figur 5B. Reparation av DNA-dubbelsträngbrott i celler kan också bedömas, och har visats av Weingeist et. al. 7. Sammantaget ger den neutrala CometChip ett värdefullt verktyg för hög genomströmning analys av DNA-DSB.
1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. H2O 2 dos respons TK6 celler med användning av alkaliska comet assay. (A) klädd mikro kometer från obehandlade TK6 lymfoblaster (överst) och TK6 celler som utsätts för 50 pm (mitten) och 100 ^ M (botten) H 2 O 2 under 20 min vid 4 ° C. Skala bar är 100 pm. (B) H 2 O 2 dos respons TK6 celler som utsätts för olika grad av H 2 O 2. Varje datapunkt är medelvärdet av tre oberoende försök, där medianprocent svansen DNA av minst 50 enskilda kometer erhölls i varje experiment. Felstaplar representerar standardavvikelsen för medelvärdet från tre oberoende försök. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Inter-Prov och Inter-Experimental Variability. (A) Prov-till-Sample variation. TK6 humana lymfoblastceller laddades i 12 brunnar i 96-brunnars-chip. Varje brunn exponerades till 100 pl av 50 pM H 2 O 2 under 20 min vid 4 ° C. Cell var omedelbart lyserades och analyserades för% Svans-DNA. Data för varje brunn visas här. Varje ruta representerar medianen minst 50 individuella kometer från varje brunn. Medelvärdet av 12 brunnar är 77.53%, standardavvikelse är 3,99%, och variationskoefficienten beräknas bli 5,2%. (B) Experiment-till-Experiment variation. TK6 humana lymfoblastceller fylldes i 96-brunnars-chip, exponerades för 100 pl av 75 pM H 2 O 2 för 20 min vid 4 ° C. Cell var omedelbart lyserades och analyserades för% Svans-DNA.Samma experiment upprepades 6 gånger och data för varje upprepning visas som ett grått fält. Varje ruta representerar medianen% svansen DNA av minst 100 enskilda kometer från varje upprepning. Medelvärdet av 6 upprepningar är 49.57%, som visas som baksidan bar här. Standardavvikelsen för 6 upprepningar är 4,99%, och standardfelet för medelvärdet beräknas vara 2,04%, representerade som felet fältet i figuren.
Figur 3. Reparation av H 2 O 2-inducerad skada i TK6 lymfoblaster. (A) Schematisk bild av reparationsstudie med representativa kometer. TK6 celler behandlas med skadliga ämnen och får reparera i media vid 37 ° C före lys. (B) Reparation kinetiken för TK6-celler efter behandling med 50 uM H 2 O 2 för 20 min vid 4 & #176; C. Varje datapunkt är medelvärdet av tre oberoende försök, där medianprocent svansen DNA av minst 50 enskilda kometer erhölls i varje experiment. Felstaplar representerar standardavvikelsen för medelvärdet från upprepade experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Reparation av MNNG-inducerad skada i TK6 lymfoblaster. TK6 celler behandlas med 0,1, 1, och 3 pg / ml MNNG under 30 min vid 4 ° C och tilläts att reparera i media vid 37 ° C upp till 120 min efter exponering. Median procentuella svans DNA av minst 50 enskilda kometer erhölls för var och en av tre oberoende försök. Felstaplar representerar standardfeletav medelvärdet från tre oberoende experiment.
Figur 5. IR dosrespons av TK6 celler med användning av neutralt kometanalysen. (A) anordnade mikrobrunn kometer från obehandlade TK6 lymfoblaster (överst) och TK6-celler exponerade för 40 Gy (mitten) och 80 Gy (botten) gammastrålning. Skala bar är 100 pm. (B) IR dos respons TK6 celler som utsätts för olika grad av gammastrålning. Varje datapunkt representerar mediansvanslängden (im) på minst 300 kometer poolade från sex macrowells på chipet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Ubiquitous genotoxins i miljön och även inom mänskliga celler utövar oundvikliga stress och skador på cellens DNA. I själva verket har det uppskattats att det finns 1000-tal av DNA-lesioner är närvarande i humana celler vid steady state 18. Förstå skador mottaglighet och reparations kinetik hos människor som inte bara ger insikt till grundforskning, men också gynnar läkemedelsutveckling. Ironiskt nog, trots förmågan hos DNA-skada för att främja cancer, DNA-skadande medel som används vid mycket höga nivåer för att behandla cancer, vilket gör kunskap om DNA-skador och reparation relevant för personlig medicin. Den CometChip är ett nytt forsknings enhet som använder mikrofabrikationsmetoder för att revolutionera en lång funnits DNA-skador analys. Att bygga på samma principer för den traditionella comet assay, ger chipet betydligt högre kapacitet och bättre reproducerbarhet. Vi beskriver här metoder för att använda detta chip. För att tydliggöra dess användbarhet och robusthet, visar vi resultat tillbakam flera experiment där chipet har använts för att bedöma skador orsakade av flera olika DNA-skadande medel, och om det har använts för att utvärdera DNA-reparation. Tillsammans resultat som presenteras här ger användbar information för att använda chipet och visa sin breda tillämpbarhet på forskning om DNA-skador och reparation.
En av de viktigaste stegen i detta protokoll är att åstadkomma en effektiv cell belastning. Många cellinjer har testats på detta system, både fjädring och vidhäftande celler. Laddar effektivitet beror på många variabler, såsom celltyp, cellstorlek, lastning koncentration och tid. Suspension cellinjer såsom lymfoblastoidceller är lättast att arbeta med. Koncentrering av cellsuspensionen kan variera från 10 april-10 juni celler per 96-brunnars och lastning bordar vanligen i 15-30 min. Högre celltäthet underlättar lastning och förkortar den tid som krävs för celler att lösa in i mikrobrunnar.
Loading parametrar för vidhäftande celler kan skilja sig från suspensionsceller. Cellinjer såsom Chinese Hamster Ovarian (CHO)-celler, visade sig ha liknande laddningseffektivitet som suspensionsceller (efter trypsinisering) och således använder liknande belastningsförhållanden. Andra celltyper, såsom tumörceller som lätt bildar cellaggregat i suspension, kräva ytterligare hantering. Passerar cellsuspensioner genom en enda cell filter och lägga trypsin till suspensionen media kan undertrycka bildningen av cellkluster vid lastning. Slutligen, i termer av laddningstiden, den tid som krävs för att fånga adherenta cellinjer i mikrobrunnar kan variera från 20 min till 1 tim. Som ett resultat, är det rekommenderat att användare utföra pilotförsök för att bestämma optimala lastförhållanden innan du fortsätter till ytterligare undersökningar. Laddar effekt kan visualiseras i ett ljust fält mikroskop eller rättare avslöjas genom att färga de inkapslade cellerna med DAPI eller annan DNAfläckar före utvärdering under fluorescensmikroskop.
En stor fördel med denna metod och chip är mångsidighet. Först är forskarna inte begränsad till en viss arbetscellkoncentration eftersom överskott cellerna tvättas bort, och microarray säkerställer jämn komet densitet. För det andra kan mikrobrunnarna göras med varierande storlekar för att rymma celltyper av olika storlekar. Under omständigheter som flera celler fångas i en enda mikro, multicell kometer är självkalibrerad och avkastnings konsekventa resultat i förhållande till en enda cell kometer 6,7. En annan fördel med mönstring celler i en microarray är att alla kometer är då på samma fokuseringsplan med fasta positioner, minska buller på grund av ofokuserade kometer och underlätta automatiserad bildbehandling och analys. De signifikanta förbättringar av genomströmning och känslighet som tillhandahålls av CometChip möjliggöra tillämpning av analysen för storskaliga studier. Sammantaget chipet gersa värdefullt verktyg för DNA-skadebedömning för forskare, toxikologer, kliniker och epidemiologer.
Medan komet analys är känd för sin utmärkta känslighet vid detektion av ett brett spektrum av DNA-skador, denna analys lider också av låg specificitet. Med användning av detta protokoll förbättrar avsevärt reproducerbarheten och genomströmningen av analysen, men visar inte avancemang i specificitet. Ändå multiplexera analysen med andra metoder har rapporterats vara effektiv i att uppnå högre specificitet. Ett exempel är införandet av renade lesion specifika enzymer. Dessa enzymer kan konvertera annars odetekterbara bas lesioner i detekterbara strängbrott och abasiska ställen 1,19-21. En allmänt använd exempel är reparations endonukleas formamidopyrimidin-DNA glykosylas (FPG), vilket avslöjar oxidativ DNA-förändringar 19,22. Eftersom enzymdigereringssteget appliceras efter cellys kan systemet skall behandlas på samma sätt ensa traditionella agaros bild utan ändringar av protokollet. Trots att detaljerat protokoll inte beskrivs här, har detta synsätt anpassats av många traditionella komet analys användare i det förflutna och protokollen kan lätt hittas. I en tidigare publikation, använde vi denna metod för att identifiera fluorescerande ljus-inducerad skada 22.
Den stora fördelen med denna metod är genomströmningen det ger, som öppnar dörrar för studier som tidigare varit praktiskt taget omöjligt. Förmågan att bearbeta 96 prover på samma plattform minskar inte bara arbete och tid, men minskar också experimentella ljud och kraftigt förbättrar reproducerbarhet. Inter prov variationen är betydligt lägre än den traditionella slide-to-slide variation, vilket kan vara två gånger högre än variationen observerats med detta chip 6,7. Minskat buller leder också till förbättrad känslighet, vilket möjliggör detektion av mer subtila skillnader mellan proverna. Eftersom enheten använder en standard 96 brunnar, är den kompatibel med allmänt forskningsutrustning och HTS-teknik. Tänk dig en studie som kräver utvärdering av 100 prov, om man antar att en genomsnittlig forskare kan behandla ~ 30 objektglas under loppet av flera dagar. Med tanke på att varje prov behöver utföras i tre exemplar, skulle det ta ungefär en månad att slutföra en sådan undersökning, vilket också oundvikligen skulle lida av prov till prov variation. Däremot process 100 förhållanden, var och en i tre exemplar, med detta chip kräver bara några plattor och kan utföras på tre dagar. Denna större förbättring i genomströmning öppnar dörren till studier som tidigare ouppnåelig.
Protokollet presenteras här beskriver både de grundläggande procedurer för att utföra standard comet assay och de modifierade steg som krävs för att använda CometChip plattformen. Med möjligheten att mäta både inneboende DNA skadenivåer och den efterföljande reparation svaret är analysen mycket relevant fören mängd olika biologiska och kliniska tillämpningar. Information om effekterna av specifika kemiska exponeringar på genomet underlättar förebyggande och behandling av sjukdomar. Dessutom finns det också betydande intresse i att bestämma variationer i DNA-skador känslighet och reparation kapacitet mellan individer 23,24. Denna teknik ger den genomströmning som erfordras för sådana storskaliga studier. Kunskap om interindividuella variationer är avgörande för att identifiera känsliga personer och för att utforma individualiserade behandlingar eller preventions strategier. Sammantaget den teknik som presenteras här ger en hög genomströmning, objektiv och kvantitativ DNA-skada analysplattform som har potential att bli en standardmetod inom snar framtid.
Acknowledgments
Detta arbete har i första hand stödja med 5-UO1-ES016045 med partiellt stöd från 1-R21-ES019498 och R44-ES021116. DMW stöddes av NIEHS Training Grant i Environmental Toxicology T32-ES007020. Utrustning lämnades av Centrum för Environmental Health Sciences P30-ES002109.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraPure LMP Agarose (low melting point) | Invitrogen | 16520 | Multiple suppliers |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco by life technologies | 14190 | Multiple suppliers |
| Crystalline NaCl | Macron Chemicals | 7581-06 | Multiple suppliers |
| Crystalline Na2EDTA | Macron Chemicals | 4931-04 | Multiple suppliers, Irritant |
| Crystalline Tris (base) | Sigma-Aldrich | T1503 | Multiple suppliers, Irritant |
| Crystalline Tris (acid) | J.T.Baker | 4106 | Multiple suppliers |
| Crystalline N-lauroylsarcosine | Sigma-Aldrich | L9150 | Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect |
| Crystalline NaOH | Macron Chemicals | 7708-06 | Multiple suppliers, Corrosive |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH3871 | Multiple suppliers, Corrosive |
| Crystalline boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard |
| CometChip | Trevigen | Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary | |
| 1-well dish | Thomas Scientific | 73521-420 | |
| Bottomless 96-well plate | VWR | 655000-06 | |
| 1.5' binder clips | Staples | Multiple suppliers | |
| Glass plate | Tag Hardware | Customized to size of 96-well plate | |
| Owl Horizontal Electrophoresis System | VWR | 27372-131 | Multiple suppliers |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | Multiple suppliers |
References
- Collins, A. R. The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).
- Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells. Nature. 1 (1), 23-29 (2006).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).
- Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).
- Weingeist, D. M., et al. Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors. Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection. Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).
- Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).
- Møller, P. Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 96, Suppl 1.. 1-42 (2005).
- Dusinska, M., Collins, A. R. The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions. Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).
- Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).
- McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer. Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -L. Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells. Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).
- Forchhammer, L., et al. Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG† inter-laboratory validation trial. Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).
- Olive, P. L., Wlodek, D., Banáth, J. P. DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis. Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).
- Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. High-performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA. Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).
- Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay). Current protocols in cell biology. , Suppl Chapter 6, Unit 6.11.. (2010).
- Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay. Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).
- Collins, A. R., Dusinská, M., Horská, A. Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay. Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).
- Ge, J., et al. Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).
- Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations. Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).
- Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population. Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).
