Summary
العصب نموذج عانى من قطع عظام الساق هو جيد التحمل، التحقق من صحة، وقابلة للتكرار نموذج من ضمور العضلات والهيكل العظمي. يوصف بروتوكول الجراحية نموذج وتظاهر في C57Black6 الفئران.
Abstract
العصب نموذج عانى من قطع عظام الساق هو جيد التحمل، التحقق من صحة، وقابلة للتكرار نموذج من إزالة التعصيب الناجم عن ضمور العضلات والهيكل العظمي في القوارض. على الرغم من أن وضعت أصلا وتستخدم على نطاق واسع في الفئران ويرجع ذلك إلى حجم أكبر لها، العصب قصبي في الفئران كبيرة بما يكفي أنه يمكن التلاعب بها بسهولة مع أي سحق أو عانى من قطع، وترك فروع العصب الشظوي والربلي من العصب الوركي سليمة وبالتالي الحفاظ على العضلات المستهدفة. وهكذا، وهذا النموذج يوفر مزايا إحداث أقل معدلات المراضة وعائقا من التمشي من العصب الوركي نموذج عانى من قطع وأيضا يسمح للمحققين لدراسة الآليات البيولوجية الفسيولوجية الخلوية والجزيئية التي تنظم عملية ضمور العضلات في الفئران المعدلة وراثيا. العصب قصبي تمد الساق، النعلية والعضلات الأخمصية، لذلك عانى من قطع في تصاريح دراسة العضلات والهيكل العظمي يتألف من مزالة العصب سريع نشل ألياف نوع الثاني و / أو بطيئة نشل نوع Iالألياف. هنا علينا أن نظهر العصب نموذج عانى من قطع عظام الساق في الماوس C57Black6. نحن تقييم ضمور في عضلة الساق، كما في عضلة ممثل، في 1 و 2 و 4 أسابيع بعد إزالة التعصيب عن طريق قياس أوزان العضلات ونوع الألياف محددة منطقة مستعرضة على البارافين جزءا لا يتجزأ من أقسام نسيجية immunostained للميوسين السريع نشل.
Introduction
الهيكل العظمي إزالة التعصيب العضلات، ويرجع ذلك إلى إصابات الأعصاب الطرفية أو المرض أو التدخل الدوائي، والنتائج في خسارة فورية من العضلات وظيفة مقلص الطوعية. العضلات يبدأ بصورة متزامنة إلى ضمور وهذا هو عكسها إذا ضمور في الوقت المناسب، عودة التعصيب ذات النوعية الجيدة يحدث 1،2. في غياب عودة التعصيب، ليف عضلي ضمور تقدم، والتغيرات البيولوجية لا رجعة فيه في العضلات يحدث مع تليف العضلات وفاة ليف عضلي. نحن هنا لشرح نموذج الظنبوب العصب عانى من قطع، وهذا نموذج من إزالة التعصيب التي يسببها الهيكل العظمي ضمور العضلات والتليف، في الفئران. هذا النموذج تمكن العلماء من دراسة الآليات البيولوجية الفسيولوجية الخلوية والجزيئية التي تكمن وراء ضمور العضلات في الجسم الحي في عضلات الساق والنعلية. بينما تاريخيا تستخدم في الغالب في الفئران، وتطبيق أحدث من هذا النموذج لخروج المغلوب وخطوط الماوس المعدلة وراثيا على وجه التحديد، يسمح المحققون إلى تقييم دور بهمبروتين معين (ق) من الفائدة في الاستقراء وتطوير وصيانة، أو بدلا من حل، وضمور العضلات والتليف في الجسم الحي.
العصب قصبي هو الأعصاب الطرفية الحركية الحسية مختلطة في hindlimb القوارض، وهي واحدة من فروع محطة الثلاثة للعصب الوركي. عانى من قطع في العصب قصبي denervates في الساق، النعلية والعضلات الأخمصية (وثلاثة صغيرة عضلات المثنية العميقة من القدم بما في ذلك الظنبوبي الخلفي، المثنية الطويلة للأصابع وإبهام اليد المثنية hallicus)، وهو نموذج موحد بشكل جيد والتحقق من صحتها في الفئران 3،4 . عضلات الساق والنعلية يمكن تشريح بسهولة في نقاط زمنية المسلسل إضافة عانى من قطع العصب قصبي، الثابتة وتجهيزها لتقييم الأنسجة في العضلات والألياف العضلية morphometrics، أو فلاش تجميد لاستخراج الحمض النووي الريبي العضلات والبروتين لغرض الدراسة، على سبيل المثال، الشبكات الخلوية مما يشير ضمور العضلات تنظيم. اللوحة الرئيسية GAالعضلات strocnemius هو نوع الألياف المختلطة العضلات (النوع الأول والنوع الثاني، على الرغم من أن معظمها من النوع الثاني)، وتتكون العضلة النعلية من نسبة كبيرة من الألياف أنا نوع، وبالتالي توفير حد سواء بسرعة وبطيئة نشل العضلات لتقييم 5،6. العصب نموذج عانى من قطع عظام الساق هو مناسبة لدراسة عملية إزالة التعصيب الناجم عن ضمور العضلات في كل من المدى القصير (أيام) (7) والمدى الطويل (أسابيع إلى أشهر) 4،8.
وعلى النقيض من نموذج عانى من قطع العصب الوركي (نموذج الثاني من إزالة التعصيب الناجم عن ضمور العضلات التي تستخدم عادة في القوارض)، عانى من قطع العصب قصبي يدفع أقل الاعتلال في الحيوان، مما يجعلها نموذجا أكثر جاذبية. عانى من قطع في العصب الوركي denervates جميع عضلات الساق (تحت الركبة) والقدم، وإضعاف قدرة الحيوان للتجول 2، في حين عانى من قطع في العصب قصبي يترك فروع العصب الشظوي والربلي من العصب الوركي سليمة، وبالتالي الحفاظالعضلات المستهدفة والمناطق الحسية. الماوس غير قادر على العطف الأخمصي أو عكس القدم، ولكن قادرة على التجول بسهولة والوزن يتحمل بالتساوي على كل من أطرافه الخلفية، مما يقلل بشكل كبير من معدلات المراضة للنموذج. وقد أجريت دراسات تحليل مشية تقييم أنماط المشي في الفئران بعد اصابات العصب الوركي والظنبوب وإثبات أن البصمة وتحمل الوزن هو الحفاظ بشكل أفضل مع إصابة الظنبوب 9،10. وبالإضافة إلى ذلك، في العصب نموذج عانى من قطع عظام الساق، يمكن تعبئتها العصب الشظوي في نقطة وقت لاحق ونقل كمصدر للتأخر عودة التعصيب، إذا كان تصميم الدراسة يتطلب 3. في المقابل، تأخر عودة التعصيب في العصب الوركي نموذج عانى من قطع يتطلب استخدام الكسب غير المشروع العصبية إلى العجز العصب الوركي، جدا زيادة كبيرة في صعوبة فنية من طراز والحد من استخدامه إلى الجراحين المهرة.
في حين أن العصب قصبي نموذج عانى من قطع Requires إلمام المشغل مع تقنية المنطوق العقيمة في جراحة الحيوان، على حد سواء العصب قصبي وعضلات الساق فإنه يعصب يمكن الوصول إليها بسهولة ومحددة للتلاعب، بحيث الأفراد الذين ليسوا الجراحين، أو من ذوي الخبرة العالية مع جراحة الحيوان، ويمكن السيطرة بسهولة هذا النموذج .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
قبل استخدام هذا النموذج، يجب أن المحققين قد حصل على موافقة لبروتوكول الجراحية من استخدام الحيوانات مؤسستهم التي تحكم الجسم. تمت الموافقة على نموذج من الأخلاق مجلس البحوث، ومؤسسة علوم الصحة هاملتون، جامعة ماكماستر (سياسة الاستخدام المقبول # 10-04-24) ويتم تنفيذها وفقا صارمة مع توصيات المجلس الكندي للرعاية الحيوان.
1. إعداد الماوس
- وزن الماوس. لحث التخدير مع 5٪ isoflurane وأو 2٪ هالوثان. يجب على الدوائر الكهربية المستعملة ضمان نظافتها كافية من مخدر لحماية الجراح. بعد 2-3 دقائق تنفس الحيوان سيتباطأ. ضمان منعكس طرفة غائب وقرصة المسافات بين الأصابع في مخلب لتأكيد التخدير الجراحي (أي لم يكن هناك استجابة من الفأر). تطبيق مواد التشحيم العيون للعين، لمنع جفاف القرنية أثناء الجراحة.
- حلق الفخذ الجانبية والارداف من الوركيالى الشق الركبة وتطهير مع proviodine. سوف الحلاقة حفاظ على موقع من الشعر شق مجانية لضمان التصور الكافي للالجراحي الميداني وتقليل التدخل في تشريح الأعصاب وعانى من قطع. الشق الوركي، الذي هو أعلى والخلفي لعظم الفخذ، يمكن تحديدها عن طريق الجس.
2. إجراء المنطوق
- تقليل isoflurane والاستنشاق إلى 2٪ (هالوثان 1٪) ثم ضع الماوس على جانبها (الجانب المعدة للجراحة التي تواجه متابعة)، تحت مجهر التشغيل أو تشريح. وبدلا من ذلك يمكن إجراء الجراحة مع Loupes لالجراحية منذ التكبير 3.5X مرضية لشخص بالغ (20-25 ز) الماوس.
- ارتداء قفازات معقمة. تحديد الشق الوركي من قبل الجس. باستخدام مشرط، شق الجلد من الفخذ الجانبي من الشق الوركي إلى الركبة (حوالي 1 سم).
- تنتشر بلطف على الجلد. التعرف على العضلة ذات الرأسين الفخذية، والذي هو عضلة مسطحة سطحية من الفخذ الجانبيةفورا تحت الجلد. باستخدام مقص غرامة، وتقسيم العضلة ذات الرأسين الفخذية على طول الألياف العضلية وعقد مفتوح مع ضام الربيع لفضح العصب الوركي وفروعه.
- التعرف على العصب الوركي العميق على الفور إلى الفخذية ذات الرأسين. ويمكن التعرف عليه من قبل مميزة لونه أبيض لامع، وحوالي 0.8 ملم في القطر. يتم تشغيله من الشق الوركي إلى الركبة، المتفرعة في الأعصاب الظنبوب، الشظوي والربلي على مستوى المبأبضية.
- فصل بلطف الظنبوب من فروع العصب الشظوي والربلي مع ملقط متناهية الصغر والربيع مقص microdissecting. العصب الظنبوب هو أكبر فرع وعادة ما تكون مركزية. فمن المهم عدم سحق العصب بينما تفصل بين الفروع. عقد العصب فقط على طبقة adventicial الخارجي مع ملقط متناهية الصغر، والحفاظ على الركود العصب (لا يدرس)، وسوف تجنب سحق العصبية وإصابة الجر.
- لكاملة ودائمة denervatiعلى، قطع العصب قصبي مع microdissecting مقص وبشكل أقصى قدر ممكن، وتجنب بعناية السفن المأبضية. بدلا من ذلك، لإزالة التعصيب مؤقتة مع عودة التعصيب كاملة المتوقعة في 2-4 أسابيع، يمكن ببساطة أن سحق العصب قصبي مع ملقط متناهية الصغر لمدة 15 ثانية بدلا من مقطوع. (الأعصاب الطرفية تنمو بعد الاصابة وسوف reinnervate العضلات المستهدفة.)
- إذا كان المطلوب إزالة التعصيب كاملة، خياطة نهاية العصب قصبي مقطوع إلى السطح الأمامي للعضلة ذات الرأسين الفخذية مع 10-0 نايلون وإعادة الاقتراب من الفخذية ذات الرأسين مع 5-0 VICRYL لمنع الشاذة إعادة تعصيب من الساق و عضلات النعلية.
- إغلاق الجلد مع تشغيل 5-0 خياطة VICRYL.
3. أضف الرعاية الجراحية
- إيقاف مخدر الاستنشاق ولكن الحفاظ على تدفق الأكسجين. إدارة buprinorphine (أو بديل) مسكن تحت الجلد.
- نقل الماوس إلى قفص نظيفة مع عدم وجودالفراش في حين الاستيقاظ من التخدير. الحفاظ على بطانية الاحترار داخل القفص وتحت الملاحظة المباشرة حتى التجول.
- نقل ومنزل في قفص أسفل لينة (لا أسلاك) مع الفراش لينة وافرة.
- تفقد أطرافهم المنطوق اليومي لحالة من الجروح والقدم لتطوير القرحة كعب استلقاء أو أدلة على مضغ. يمكن أن تدار مشاكل بسيطة مع المضادات الحيوية الموضعية أو المطهرات مثل proviodine. مؤشرات نقطة النهاية التي تتطلب القتل الرحيم الحيوانية هي فقدان الوزن، ودليل على سوء الرعاية الذاتية (الفراء تكدرت)، والتقوس في الجلوس. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي التضحية الحيوانات مع انفتاح الجرح أو القرح الرئيسية التي لا تلتئم في 1-2 أسابيع مع المضادات الحيوية الموضعية أو تظهر لديهم الألم.
4. الساق مزالة العصب والعضلات النعلية الحصاد
- في نقطة زمنية ما بعد الجراحة المطلوب، تزن الماوس والتضحية مع CO 2 جرعة زائدة.
- يحلق الجانب الإنسي من كل منالمنطوق والساقين التحكم المقابل ونظيفة مع الكحول. ضع الماوس تحت مجهر التشغيل أو تشريح، أو استخدم بدلا من Loupes لعرض الجراحية لالتكبير.
- على الطرف المنطوق، شق الجلد العجل وسطي مع مشرط من الكاحل إلى الركبة ومحيطي حول الكاحل. سحب بلطف الجلد مع ملقط قبالة العضلات وقريب نحو الفخذ. هذا يفضح كل عضلات الساق. تحديد عضلة الساق، والذي هو عضلة الساق الذي يمتد من الركبة إلى الكاحل على الجانب الخلفي من الساق وتقع مباشرة تحت الجلد. تحديد الإدراج البعيدة للعضلة ذات الرأسين الفخذية، الأقرب إلى عضلة الساق على الجانب الإنسي من الركبة. في الإدراج لها القاصي يظهر الفخذية ذات الرأسين رقيقة وغشائي ويعتلي الجزء الأكثر القريبة من الساق. باستخدام مقص حادة وتشريح نهاية، فصل بلطف الإدراج القاصي من الفخذية ذات الرأسين من الغازالعضلات trocnemius.
- في الإدراج لها القاصي في العقبي، وعضلة الساق التناقص التدريجي في وتر أخيل. التعرف على وتر أخيل، والتي تظهر أبيض وتري. عقد في وتر أخيل مع ملقط، مع الحرص على عدم عقد أو سحق عضلة الساق، وتقسيم وتر أخيل من الإدراج عقبي باستخدام مقص.
- ما زالت تحتجز في وتر، ورفع بلطف عضلة الساق (أحمر باهت) قبالة النعلية عميق (أعمق الحمراء)، من الإدراج القاصي نحو أصله عند الركبة (والنعلية يمكن أن تحصد بشكل منفصل).
- تشريح الساق قبالة المحطة بقسمة أصل الساق من chondyles عظم الفخذ الإنسي والجانبية باستخدام مقص. الجر لطيف جدا على العضلات يسهل هذه العملية. يجب الحرص على عدم سحق العضلات.
- سوف النعلية يكون الآن مرئية بوضوح، على الفور تحت موقع من الساق. رفع النعلية من الإدراج على وتر أخيل ل، أوigin على العجل الخلفي. إذا تم رفع النعلية عن غير قصد مع الساق، فصل برفق من العينة المقطوع. على الساق (الضوء الأحمر) والنعلية (الأحمر الداكن) يظل يسهل التعرف عليها في العينة التي تحصد بسبب وجود خلافات ونها.
- وزن العضلات بشكل منفصل على نطاق والدقة.
- تقسيم عضلات عموديا، ونصف لتجميد المفاجئة في النيتروجين السائل (لبروتين اللاحقة و / أو استخراج الحمض النووي الريبي)، والنصف الآخر للعلم الأنسجة (أي تقييم المظهرية، immunohistology) تحديد إما في 10٪ من الفورمالين، أو تثبيت المجمدة في نظير البنتان تبرد مع النيتروجين السائل ، كما تريد.
- كرر من الخطوة 4.3 أعلاه على السيطرة، التي تديرها الأمم المتحدة، جنبا إلى حصاد الساق وعضلات التحكم النعلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عانى من قطع العصب قصبي denervates في الساق، النعلية والعضلات الأخمصية من العجل. نحن هنا تقييم تطور ضمور في عضلة الساق، كما في عضلة ممثل. وكان حصاد عضلة الساق 2-3 أشهر من العمر C57Black 6 الفئران (جاكسون المختبرات) مزالة العصب لمدة 1 أو 2 أو 4 أسابيع. الأوزان العضلات تقلل تدريجيا (الشكل 1)، وكذلك منطقة مستعرضة من نوع II بسرعة نشل ألياف العضلات (الشكل 2)، مع مرور الوقت. على الساق هو نوع الألياف المختلطة العضلات (النوع الأول والنوع الثاني)، ولكن إزالة التعصيب يؤدي الى تبديل نوع الألياف من النوع الأول لكتابة ألياف الثاني 11، ونتيجة لذلك عدد كاف من نوع قد لا يكون الأول من الألياف المتوفرة لقياس و التحليل الإحصائي قوية.
50657fig1.jpg "/>
الشكل 1. يوضح عضلة الساق مزالة العصب ضمور تدريجي. خضع C57Black 6 الفئران عانى من قطع في العصب قصبي الحق. وكان حصاد عضلة الساق من سيطرة مزالة العصب (يمين) والمقابل (يسار) hindlimbs في 1 أو 2 أو 4 أسابيع بعد عانى من قطع العصب. وتم وزن عضلات الساق، ويتم التعبير عن وزن العضلات مزالة العصب كنسبة من السيطرة على العضلات معصب المقابل. إزالة التعصيب يؤدي الى الفقدان التدريجي لكتلة العضلات.
الشكل 2. يوضح عضلة الساق مزالة العصب الانخفاض التدريجي في ليف عضلي منطقة المقطع العرضي هي: (أ) مزالة العصب والعضلات مراقبة الساق الثابتة الفورمالين، وقطع على المقطع العرضي في musclالمقطع منتصف الإلكترونية وimmunostained لمكافحة الهيكل العظمي الميوسين العضلات وسريعة نشل الإسوي (بلادي-32، سيغما، 1:500 تمييع) تليها الضد الثانوية البيروكسيديز وstreptavidin-HRP/DAB كما هو موضح 7. تم استخدام الهيماتوكسيلين باعتبارها مباين. سريع نشل ألياف نوع II وصمة عار البني وبطيئة نشل نوع الأول من الألياف وصمة عار الأرجواني ضوء. تم قياس مساحة المقطع العرضي (CSA) من الألياف باستخدام برنامج ImageJ (بيثيسدا، NIH) كما هو موضح 7،12. نوع نشل الألياف السريعة II تظهر ضمور تدريجي. عدد قليل جدا من نوع الأول من الألياف موجودة في الساق مزالة العصب للسماح بتقييم صحيحة إحصائيا من حجم الألياف. (ن = 6-9 الفئران / المجموعة تم قياس ما لا يقل عن 200 myofibers في العضلات من قبل المعلقين أعمى إلى النمط الظاهري المنطوق البيانات يتم عرض كما يعني + / -. يساوي شريط SD مقياس 100 ميكرون). انقر هنا لعرض أكبر الرقم .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
العصب قصبي نموذج عانى من قطع من إزالة التعصيب التي يسببها الهيكل العظمي ضمور العضلات هو نموذج استخداما والتحقق من صحتها جيدا في الفئران. تكيفنا هذا النموذج للاستخدام في الفئران، والذي يسمح للمحقق للاستفادة من وجود الفئران المعدلة وراثيا ودراسة عملية ضمور العضلات في الجسم الحي في غياب البروتينات حاسما في تنظيم كتلة العضلات 7،8. يمكن للعضلات الساق والنعلية، سواء مزالة العصب في هذا النموذج، يكون بسهولة وبسرعة مع الحد الأدنى من التعامل مع تشريح، وبالتالي توفير ممتازة جودة مرنا والبروتين للالتحليلات الجزيئية لاحقة. وبالمثل، وذلك بسبب حجم العضلات، ويمكن تقسيم، وتوفير أنسجة من نفس الحيوان لإجراء تحاليل نسيجية والمظهرية المصاحبة. إذا كان مطلوبا hindlimb التقييم الوظيفي، والمشي تحليل المسار لا يمكن أن يؤديها متسلسل. وانخفض القدمين في الحبر ومشى الماوس من خلال الضميمة مع ورقة علىأسفل. خصائص مطبوعات يمكن قياسها بشكل موثوق وسجل هدفا لبيان مدى العجز العصبية والعضلية والتوافق مشية، منذ خصائص البصمة تعكس المجموعات العضلية وظيفية 13،14. في حين وضعت أصلا والتحقق من صحتها في الفئران 13، والمشي تحليل المسار ويمكن أيضا أن يؤديها في الفئران 15.
عانى من قطع العصب قصبي التسامح هو عموما بشكل جيد للغاية من قبل الفئران. فقط جرعة واحدة من مسكن ضروري في فترة ما بعد الجراحة على الفور. مع استخدام تقنية معقمة المناسبة، وعدوى الأنسجة الرخوة أمر نادر الحدوث. في حين عانى من قطع العصب قصبي لا تحفز مذل الحسي على الجانب الأخمصي للقدم، في منطقتنا C57black6 الخبرة وخروج المغلوب الفئران المعدلة وراثيا أو مشتقة على هذا الخط لا تميل إلى تشوه السيارات. ومع ذلك، يجب أن يتم فحص الفئران يوميا بحثا عن علامات على صناعة السيارات في التشويه، وقرحة الضغط كعب، وكذلك نقطة النهاية الرعاية. بينما لدينا الطرافة وفيات ضئيلةح هذا النموذج، نجد أن حوالي 2-5٪ من الفئران يجب أن يتم التخلص بسبب الإصابة بوساطة النفس، أو قرحة الضغط النامية على، وأطرافه الخلفية تعمل. استخدام الفراش لينة بعد العملية الحاسمة لضمان راحة الحيوان ويساعد على منع تطور قرحة الضغط على الجانب تديرها. ربط العصب الوركي وكذلك نموذج SNI من ربط (حيث و تربط فروع الشظوي الظنبوبي والمشتركة للالوركي، ولكن يتم ترك الربلي سليمة) تكون بمثابة نماذج من آلام الأعصاب 16،17. وبالتالي، يمكن أن آلام جلدية وفرط التألم الحرارية تحدث في القدم في نموذجنا كذلك، ولكن لم نر السلوك الألم علني في الفئران مع النشاط اليومي العادي على فراش ناعم.
ومقطوع العصب قصبي من hindlimb واحد فقط ومنذ وزن الفئران تحمل بالتساوي تقريبا على كلا hindlimbs، الجهاز العضلي من طرف المقابل الأمم المتحدة التي تديرها يمكن استخدامها باعتبارها الرقابة الداخلية داخل كل حيوان 7-10.هذا ليس بالضرورة هو الحال في نموذج عانى من قطع الوركي، حيث شذوذ أكثر أهمية من المشي يمكن أن تحدث استجابة الضخامي في عضلة الطرف المقابل. في العصب نموذج عانى من قطع عظام الساق، ونحن عادة استخدام عضلة الساق والنعلية من الطرف الأمم المتحدة التي تديرها والعضلات سيطرتنا 7،8. إذا اختار المحقق لاستخدام الحيوانات منفصلة عن التي لحصاد عضلة التحكم، ثم جراحة الشام يجب أن يتم تنفيذ. سوف جراحة الشام تتكون من إدارة التخدير، وتقسيم من الجلد لفضح العصب قصبي، ولكن لا عانى من قطع. الجلد وببساطة مغلقة التعرض العصب التالية.
في بعض النماذج عانى من قطع الأعصاب الطرفية، عودة التعصيب المخطئين من الجذع الأقرب إلى العضلات المستهدفة يلوث إزالة التعصيب المخطط لها. في هذا النموذج، وتأمين نهاية القريبة من العصب قصبي مقطوع إلى السطح سطحي من العضلة ذات الرأسين الفخذية، وبالتالي إغلاق واجهة العضلات، ومثبطاتTS للعودة التعصيب المخطئين. على هذا النحو، بل هو خطوة حاسمة وأساسية في النموذج. عودة التعصيب المخطئين أمر نادر في هذا النموذج.
وبالمثل، معالجة متأنية للعصب أثناء الجراحة أمر ضروري. يجب فصل فروع العصب الربلي والشظوي بلطف من العصب قصبي قبل عانى من قطع عظام الساق، وليس سحقت أو تمدد في هذه العملية. والمعاملة الخشنة من هذه الأعصاب تنازلات وظيفتها، denervating جزئيا الأخرى عضلات hindlimb. إذا حدث هذا سوف تتأثر مشية الحيوان بشكل مختلف مقارنة مع تلك الفئران التي تمر الوحيد عانى من قطع العصب قصبي، وجار العضلات متغير قد تلوث النتائج التجريبية. وبالمثل، يجب توخي الحذر عند تشريح عضلات مزالة العصب. وينبغي التعامل مع العضلات التي كتبها الوتر، وليس اغتنامها مباشرة لتجنب سحق قطعة أثرية من شأنها أن تؤثر على الأنسجة والألياف العضلية التحليلات المظهرية وربما التعبير الجيني.
تي نحنتوظيف ypically هذا النموذج في الفئران 20-24 غرام (2-3 أشهر من العمر)، كما أن الحيوان هو نضجا والأعصاب الوركي والظنبوب كلاهما من حجم كاف ليتم التعامل معها بسهولة. ويمكن إجراء الجراحة على الأصغر سنا، حيوانات أصغر حجما إذا رغبت، ولكن العامل المحدد هنا يكون من براعة الجراح التشغيل. قد تكون هذه مشكلة إذا كان مهتما المحقق في دراسة استجابة الخلية القمر الصناعي في العضلات مزالة العصب. يقلل من خلية المحتملة التجدد القمر الصناعي في السن، مقارنة مع الأصغر سنا، 18 الحيوانات، وبالتالي قد تكون هناك حاجة الحيوانات الأصغر سنا في التصميم التجريبي، وتقديم التحدي التقني لمشغل أقل خبرة.
يمكن تكييفها العصب نموذج عانى من قطع عظام الساق من مجرد نموذج من إزالة التعصيب الناجم عن ضمور العضلات، إلى واحد من عودة التعصيب العضلات المتأخرة (> 4 أسابيع)، إذا رغبت في ذلك، وإذا هم المشغلين ذوي الخبرة الجراحية متوفرة 1،3. بعد فترة من إزالة التعصيب المحدد من قبل الجردestigator، الماوس يمكن reoperated وحشد العصب الشظوي لreinnervate عضلات مزالة العصب. يتم التعرف على الجدعة البعيدة للعصب الظنبوب مقطوع، قلص وحشد العصب الشظوي في نهايته البعيدة وإصلاحه microsurgically إلى جدعة العصب قصبي. سوف العصب الشظوي تنمو بمعدل حوالي 1 ملم / يوم في جدعة العصب قصبي لعضلات الساق reinnervate والنعلية. العصب نموذج عانى من قطع عظام الساق يوفر ميزة على العصب الوركي نموذج عانى من قطع في ذلك الكسب غير المشروع العصب ليس من الضروري في الإجراء عودة التعصيب 2 بسبب توافر العصب الشظوي. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن reanastomoses العصب يتطلب الدقة من مشغل ذوي الخبرة والمهارة.
وباختصار، نحن هنا لشرح العصب نموذج عانى من قطع عظام الساق في الفئران، لتكون نموذجا سهلة وقوية والتحقق من صحتها بشكل جيد وقابلة للتكرار من إزالة التعصيب الناجم عن ضمور العضلات والهيكل العظمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من عصبي عضلي شراكة الأبحاث CIHR (JNM - 90959؛ إلى JAEB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Materials | |||
| 10-0 Nylon suture | Ethicon | 2850G | |
| 5-0 Vicryl suture | Ethicon | J553G | |
| Equipment | |||
| Spring microdissecting scissors | Fine Surgical Tools | 15021-15 | |
| Ultra fine forceps | Fine Surgical Tools | 11370-40 | |
| Non locking micro needle holder (driver) | Fine Surgical Tools | 12076-12 | |
| Spring retractor | Fine Surgical Tools | 17000-02 | |
References
- Fu, S. Y., Gordon, T. Contributing factors to poor functional recovery after delayed nerve repair: prolonged denervation. J. Neurosci. 15, 3886-3895 (1995).
- Kobayashi, J., Mackinnon, S. E., Watanabe, O., Ball, D. J., Gu, X. M., Hunter, D. A., Kuzon, W. M. The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model. Muscle Nerve. 20, 858-866 (1997).
- Bain, J. R., Veltri, K. L., Chamberlain, D., Fahnestock, M. Improved functional recovery of denervated skeletal muscle after temporary sensory nerve innervation. Neuroscience. , 103-503 (2001).
- Batt, J., Bain, J., Goncalves, J., Michalski, B., Plant, P., Fahnestock, M., Woodgett, J. Differential gene expression profiling of short and long term denervated muscle. FASEB J. 20, 115-117 (2006).
- Sher, J., Cardasis, C. Skeletal muscle fiber types in the adult mouse. Acta Neurol. Scand. 54, 45-56 (1976).
- Agbulut, O., Noirez, P., Beaumont, F., Butler-Browne, G. Myosin heavy chain isoforms in postnatal muscle development of mice. Biol. Cell. 95, 399-406 (2003).
- Nagpal, P., Plant, P. J., Correa, J., Bain, A., Takeda, M., Kawabe, H., Rotin, D., Bain, J. R., Batt, J. A. The ubiquitin ligase nedd4-1 participates in denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. PLoS ONE. 7, e46427 (2012).
- Plant, P. J., Bain, J. R., Correa, J. E., Woo, M., Batt, J. Absence of caspase-3 protects against denervation-induced skeletal muscle atrophy. J. Appl. Physiol. 107, 224-234 (2009).
- Varejao, A. S., Meek, M. F., Ferreira, A. J., Patricio, J. A., Cabrita, A. M. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration in the rat: walking track analysis. J. Neurosci. Methods. 108, 1-9 (2001).
- Willand, M. P., Holmes, M., Bain, J., Fahnestock, M., de Bruin, H. Electrical muscle stimulation after immediate nerve repair reduces muscle atrophy without affecting reinnervation. Muscle Nerve. 48, 219-225 (2013).
- Sterne, G. D., Coulton, G. R., Brown, R. A., Green, C. J., Terenghi, G. Neurotrophin-3-enhanced nerve regeneration selectively improves recovery of muscle fibers expressing myosin heavy chains 2b. J. Cell Biol. 139, 709-715 (1997).
- Plant, P. J., North, M. L., Ward, A., Ward, M., Khanna, N., Correa, J., Scott, J. A., Batt, J. Hypertrophic airway smooth muscle mass correlates with increased airway responsiveness in a murine model of asthma. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 46, 532-540 (2012).
- Bain, J. R., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Functional evaluation of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plast. Reconstr. Surg. 83, 129-138 (1989).
- Hare, G. M., Evans, P. J., Mackinnon, S. E., Best, T. J., Midha, R., Szalai, J. P., Hunter, D. A. Walking track analysis: utilization of individual footprint parameters. Ann. Plast. Surg. 30, 147-153 (1993).
- McLean, J., Batt, J., Doering, L. C., Rotin, D., Bain, J. R. Enhanced rate of nerve regeneration and directional errors after sciatic nerve injury in receptor protein tyrosine phosphatase sigma knock-out mice. J. Neurosci. 22, 5481-5491 (2002).
- Richner, M., Bjerrum, O. J., Nykjaer, A., Vaegter, C. B. The spared nerve injury (SNI) model of induced mechanical allodynia in mice. J. Vis. Exp. (54), e3092 (2011).
- Rogoz, K., Lagerstrom, M. C., Dufour, S., Kullander, K. VGLUT2-dependent glutamatergic transmission in primary afferents is required for intact nociception in both acute and persistent pain modalities. Pain. 153, 1525-1536 (2012).
- Thornell, L. E. Sarcopenic obesity: satellite cells in the aging muscle. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 14, 22-27 (2011).
