Summary
מודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי הוא מודל נסבל היטב, אימות, ושחזור של ניוון שרירים שלד. הפרוטוקול כירורגית המודל מתואר והפגין בC57Black6 עכברים.
Abstract
מודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי הוא מודל נסבל היטב, אימות, ושחזור של ניוון שרירים שלד מושרה denervation במכרסמים. למרות שפותח במקור ושימוש נרחב בעכברים בגלל הגודל שלה, העצב הטיביאלי בעכברים הוא גדול מספיק שניתן לטפל בו בקלות עם או למעוך או חיתוך רוחב, והשאיר את ענפי עצב peroneal וsural של העצב השת ללא פגע וכך לשמר שרירי היעד שלהם. לכן, מודל זה מציע את היתרונות של גרימת פחות תחלואה ומניעה של ambulation מאשר דגם חיתוך רוחב העצב השת וגם מאפשר לחוקרים ללמוד את המנגנונים פיסיולוגיים הביולוגיים, תאיים ומולקולריים המסדירים את התהליך של ניוון שרירים בעכברים מהונדסים גנטי. העצב הטיביאלי מספק את הגסטרוקנמיוס, soleus והשרירים plantaris, כך חיתוך רוחב שלה מאפשר הלימוד של שריר שלד denervated המורכב של סיבים מהירים עווית סוג II ו / או סוג עווית איטי אניסיבים. כאן אנו מדגימים את מודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי בעכבר C57Black6. אנו מעריכים את הניוון של שריר הגסטרוקנמיוס, כמו שריר מייצג, בבית 1, 2, ו 4 שבועות לאחר denervation על ידי מדידת משקולות שרירים ושטח חתך מסוים סיבי סוג ב-פרפין מוטבע סעיפים היסטולוגית immunostained לשרירן עווית מהיר.
Introduction
denervation שלד שריר, עקב פציעה טראומטית עצבים היקפיים, מחלה או התערבות פרמקולוגית, תוצאות באובדן המיידי של פונקצית התכווצות שרירים מרצון. שריר במקביל מתחיל להתנוון וניוון זה הוא הפיך אם עצבוב בזמן, באיכות טובה מתרחש 1,2. בהיעדר העצבוב, ניוון myofiber מתקדם, ושינויים ביולוגיים בלתי הפיכים בשריר להתרחש עם סיסטיק שריר ומות myofiber. כאן אנו מדגימים את מודל השוקה עצב חיתוך רוחב, דגם של denervation-Induced ניוון שרירים השלד וסיסטיק, בעכברים. מודל זה מאפשר למדענים לחקור את המנגנונים הביולוגיים פיסיולוגיים, תאיים ומולקולריים העומדים בבסיס ניוון שרירים in vivo בשרירי הגסטרוקנמיוס וSoleus. תוך שימוש היסטורי בעיקר בחולדות, יישום חדש יותר של הדגם הזה לקווי עכבר מהונדסים במיוחד נוקאאוט ו, מאפשר לחוקרים להעריך את התפקיד שלהםחלבון מסוים (ים) של עניין באינדוקציה, פיתוח ותחזוקה, או לחלופין רזולוציה של, ניוון שרירים וסיסטיק in vivo.
העצב הטיביאלי הוא עצב מוטורי היקפי חושי מעורב בhindlimb המכרסם, והוא אחד משלושת הענפים הטרמינל של העצב השת. חיתוך רוחב של העצב הטיביאלי denervates את הגסטרוקנמיוס, soleus והשרירים plantaris (והשלושה השרירים המכופפים העמוקים הקטנים של כף הרגל, כולל tibialis האחורי, longus מכופף digitorum longus hallicus ומכופף), וגם הוא מודל סטנדרטי תוקף בחולדות 3,4 . יכולים להיות גזורים שרירי הגסטרוקנמיוס וSoleus בקלות בנקודות זמן סדרתיים לפרסם חיתוך רוחב עצב הטיביאלי, קבוע ומעובד להערכת היסטולוגיה השריר ושריר הסיבים morphometrics, או הבזק הוקפא למיצוי של RNA וחלבונים שריר לצורך הלימודים, למשל, הרשתות הסלולריות האיתות מסדירות ניוון שרירים. Gaשריר strocnemius הוא שריר סוג סיבים מעורב (סוג I וסוג II, למרות שהסוג השני בעיקר) ושריר Soleus מורכב מחלק גדול של סיבים מסוג I, ובכך לספק גם עווית שריר מהיר ואיטי להערכה 5,6. מודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי מתאים ללימוד התהליך של denervation-Induced ניוון שרירים הן בטווח ארוך לטווח הקצר (ימים) ו7 (שבועות עד חודשים) 4,8.
בניגוד למודל חיתוך רוחב העצב השת (מודל שני של denervation-Induced ניוון שרירים נפוצים במכרסמים), חיתוך רוחב עצב הטיביאלי גורם פחות תחלואה בבעלי החיים, מה שהופך אותה למודל אטרקטיבי יותר. חיתוך רוחב של העצב השת denervates כל שרירי הרגל (מתחת לברך) והרגל, פוגע ביכולתו של בעל החיים לambulate 2, ואילו חיתוך רוחב של העצב הטיביאלי משאיר את ענפי עצב peroneal וsural של העצב השת ללא פגע, ובכך לשמר אתשרירי היעד שלהם וטריטוריות סנסוריים. העכבר אינו יכול להגמיש plantar או להפוך את הרגל, אבל הוא מסוגל ambulate בקלות ובמשקל נושא במידה שווה על שני הגפיים אחוריות, ובכך מצמצם את התחלואה של המודל באופן משמעותי. מחקרי ניתוח הליכה הערכת דפוסי הליכה בוצעו בחולדות בעקבות פציעות עצב הטיביאלי והשיתו ולהוכיח כי נושאת טביעת רגל ומשקל נשמרה טוב יותר עם פציעת השוקה 9,10. בנוסף, במודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי, ניתן לגייס את עצב peroneal בשלב מאוחר יותר והועבר כמקור עצבוב מתעכב, אם תכנון המחקר דורש 3. לעומת זאת, עצבוב מתעכב במודל חיתוך רוחב העצב השת מחייב שימוש בשתל עצב לגירעון העצב השת, מאוד להגדיל באופן משמעותי את הקושי הטכני של הדגם ולהגביל את השימוש בו למנתחים מיומנים.
בעוד מודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי Requires היכרות של המפעיל עם טכניקה ניתוחית סטרילי בניתוח בעלי חיים, גם העצב הטיביאלי ושרירי השוקיים זה innervates הנגיש בקלות והניתנת לזיהוי למניפולציה, כך שאנשים שאינם מנתחים, או בעל ניסיון רב בניתוח בעלי חיים, בקלות יכולים לשלוט מודל זה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
לפני השימוש במודל זה, חוקרים כנראה קיבל אישור לפרוטוקול כירורגית מהשימוש בבעלי החיים של המוסד שלהם גוף מנהל. המודל אושר על ידי מועצת המנהלים מחקר האתיקה, המילטון בריאות חברה למדעים, אוניברסיטת מקמאסטר (AUP # 10-04-24) ומבוצע בהתאם קפדן עם ההמלצות של המועצה הקנדית בטיפול בבעלי חיים.
1. הכנת עכבר
- לשקול את העכבר. לגרום הרדמה עם 5% או 2% isoflurane halothane. המעגל משמש צריך להבטיח הדחה מספקת של חומר ההרדמה כדי להגן על המנתח. לאחר 2-3 דקות הנשימה של בעל החיים תהיה איטית. להבטיח את רפלקס המצמוץ חסר ולצבוט את חללי interdigital בכפה כדי לאשר הרדמה כירורגית (כלומר, אין תגובה על ידי העכבר). החל סיכה עיניים לעין, כדי למנוע התייבשות של הקרנית במהלך ניתוח.
- שבי ירך לרוחב וישבן מהשתלחרוץ עד הברך ולחטא עם proviodine. גילוח ישמור את האתר של השיער ללא חתך על מנת להבטיח להדמיה נאותה של שדה הניתוח, וכדי למזער את ההפרעה לנתיחת עצב וחיתוך רוחב. חריץ sciatic, שהוא מעולה ואחורי לעצם הירך, ניתן לזהות על ידי מישוש.
2. הליך אופרטיבי
- להפחית isoflurane איפה ל2% (halothane 1%) והנח את העכבר על הצד שלו (בצד המיועד לניתוח פונה כלפי מעלה), תחת מיקרוסקופ הפעלה או לנתח. לחלופין ניתוח יכול להתבצע עם loupes כירורגיות מאז הגדלה 3.5x היא משביעת רצון לעכבר בוגר (20-25 גרם).
- לעטות כפפות סטריליות. זהה את שריר הירך על ידי מישוש. באמצעות אזמל, לחתוך את העור של הירך לרוחב מאת שריר הירך עד הברך (כ 1 ס"מ).
- להפיץ את העור בעדינות. זהה את השרירים femoris שרירי, שהוא השריר השטחי השטוח לרוחב של הירךמייד מתחת לעור. בעזרת מספריים בסדר, לפצל את השרירים femoris שרירי לאורך סיבי השריר ולהחזיק פתוח עם מפשק אביב כדי לחשוף את העצב השת וענפיו.
- לזהות את העצב השת עמוק באופן מיידי לשרירי femoris שרירי. ניתן לזהות אותו לפי הצבע הלבן הבוהק האופייני שלה והיא כ 0.8 מ"מ קוטר. היא פועלת מאת שריר הירך עד הברך, הסתעפות לתוך עצבי השוקה, peroneal וsural ברמה של פוסה popliteal.
- בעדינות להפריד את השוקה מענפי עצב peroneal וsural עם מלקחיים ומספריים ultrafine microdissecting אביב. העצב הטיביאלי הוא הענף הגדול ביותר והוא בדרך כלל מרכזי. זה חשוב לא לרסק את העצב תוך הפרדה בין הענפים. מחזיק את העצב רק על השכבה החיצונית adventicial עם המלקחיים ultrafine, ושמירה על מרווח העצב (לא לימד), יימנע למחוץ עצב ופציעת מתיחה.
- לשלם ומתמשך denervatiב, לחתוך עצב הטיביאלי עם microdissecting מספריים כdistally ככל האפשר, תוך הימנעות בזהירות את כלי popliteal. לחלופין, לdenervation הזמני עם עצבוב מלא צפוי ב2-4 שבועות, יכול להיות פשוט מחץ את העצב הטיביאלי עם מלקחיים ultrafine במשך 15 שניות במקום transected. (עצבים היקפיים לגדל מחדש פציעה הבאה ויהיה ReInnervate שריר היעד.)
- אם נדרש denervation מלא, תפרת את הסוף של העצב הטיביאלי transected אל פני השטח הקדמי של שריר femoris שרירי עם 10-0 ניילון ומחדש משוער הרירים femoris עם 5-0 Vicryl למנוע מחדש עצבוב חריג של הגסטרוקנמיוס ו שרירי soleus.
- סגור את העור עם תפר Vicryl ריצת 5-0.
3. הודעה טיפול אופרטיבי
- כבה את חומר ההרדמה שהאיפה אך לשמור על הזרימה של חמצן. לנהל buprinorphine (או תחליף) כאבים מתחת לעור.
- העבר את העכבר לכלוב נקי ללאמצעים בזמן מתעורר מהרדמה. שמור על שמיכת התחממות בתוך הכלוב ותחת השגחה ישירה עד ambulating.
- העברה ובית בכלוב תחתון רך (לא חוט) עם מצעים רכים בשפע.
- בדוק את האיבר האופרטיבי יומי למצבו של פצע הניתוח והרגל להתפתחות כיבים בעקב משכוב או ראיות של לעיסה. ניתן לנהל בעיות קטנות עם אנטיביוטיקה או חיטוי כגון proviodine אקטואליים. אינדיקטורים נקודות קצה הדורשות הרדמת בעל חיים הם ירידה במשקל, עדות לטיפול עצמי ירוד (פרווה פרועה), ויציבה כפופה. בנוסף, בעלי חיים עם הפרעה פצע גדולה או כיבים שאינם נרפא ב1-2 שבועות עם אנטיביוטיקה מקומית או מופיעים יש כאב יש להקריב.
4. הגסטרוקנמיוס Denervated וקציר שריר Soleus
- בנקודת הזמן שלאחר הניתוח הרצויה, לשקול את העכבר והקרבה עם מנת יתר של CO 2.
- לגלח את ההיבט המדיאלי של שניהםניתוח ובקרת רגליים נגדיות ונקי עם אלכוהול. מניחים את העכבר תחת מיקרוסקופ הפעלה או לנתח, או לחלופין להשתמש loupes צפייה כירורגיות להגדלה.
- על האיבר האופרטיבי, לחתוך את עור העגל המדיאלי עם אזמל מהקרסול עד הברך וcircumferentially סביב הקרסול. משוך בעדינות את העור עם מלקחיים מעל השריר וproximally לכיוון הירך. זה חושף את כל שרירי הרגל. זהה את שריר הגסטרוקנמיוס, שהוא שריר השוק שיוצא מהברך לקרסול בחלק האחורי של הרגל ונמצא מייד מתחת לפני העור. זהה את הכניסה הדיסטלי של השרירים femoris שרירי, הפרוקסימלי לשריר הגסטרוקנמיוס על ההיבט המדיאלי של הברך. בכניסת דיסטלי femoris שרירי מופיע דק ושקוף וoverlies החלק הפרוקסימלי ביותר של הגסטרוקנמיוס. בעזרת מספריים ונתיחת קצה קהה, בעדינות להפריד את הכניסה הדיסטלי של שריר הזרוע femoris מהגזשריר trocnemius.
- בכניסתו לדיסטלי calcaneous, שריר הגסטרוקנמיוס נרות לגיד אכילס. זהה את גיד אכילס, המופיע לבן ושרירי. החזק את גיד אכילס עם מלקחיים, נזהר שלא להחזיק או למחוץ את שריר הגסטרוקנמיוס, ולחלק את גיד אכילס מהחדרת calcaneus באמצעות מספריים.
- עדיין מחזיק את הגיד, בעדינות להרים את שריר הגסטרוקנמיוס (אדום חיוור) את Soleus העמוק (אדום עמוק), מההחדרה הדיסטלי לכיוון מקורו בברך (ניתן לקצור את Soleus בנפרד).
- לנתח את הגסטרוקנמיוס את הרגל על ידי חלוקת מקורם של הגסטרוקנמיוס מchondyles הירך המדיאלי ו לרוחב באמצעות מספריים. מתיחה מאוד עדינה על השריר מאפשרת את התהליך הזה. היזהר שלא למחוץ את השריר.
- את Soleus עכשיו יהיה ברור לעין, באופן מיידי באתר של הגסטרוקנמיוס. הרם את Soleus מהכנסתו על גיד אכילס לה אוigin על העגל האחורי. אם Soleus עולה בטעות עם הגסטרוקנמיוס, בעדינות להפריד אותו מהדגימה שנקטפו. הגסטרוקנמיוס (אור האדום) וSoleus (אדום כהה) יישארו לזיהוי בקלות בדגימה שנקטפו בשל הבדלי הצבע שלהם.
- לשקול את השרירים בנפרד בקנה מידת דיוק.
- לפצל את השרירים בצורה אנכית, חצי הצמד להקפאה בחנקן נוזלי (לחלבון ו / או מיצוי RNA שלאחר מכן), וחצי ליסטולוגיה (הערכת morphometric כלומר, immunohistology) או בתיקון 10% פורמלין, או קיבעון קפוא בisopentane מקורר עם חנקן נוזלי , המועדפים.
- חזור על צעד מ4.3 לעיל בשלט, המופעל באמצעות האו"ם, בצד למסוק הגסטרוקנמיוס בקרה ושרירים soleus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חיתוך רוחב עצב הטיביאלי denervates את הגסטרוקנמיוס, soleus והשרירים plantaris של העגל. כאן אנו בוחנים את ההתפתחות של ניוון בשריר הגסטרוקנמיוס, כנציג שריר. שריר הגסטרוקנמיוס היה שנקטפו מן 2-3 חודשים 6 עכברים ישנים C57Black (ג'קסון מעבדות) denervated עבור 1, 2 או 4 שבועות. משקולות שרירים בהדרגה להקטין (איור 1), כפי שעושה חתך באזור של סיבים מסוג II מהירים עווית שריר (איור 2), לאורך זמן. הגסטרוקנמיוס הוא שריר סוג סיבים מעורב (הסוג I והסוג II), אבל denervation גורם מתג סוג סיבים מסוג I להקליד סיבי II 11, וכתוצאה ממספר מספיק של סיבי סוג I עשויים שלא להיות זמין למדידה ו ניתוח סטטיסטי חזק.
50657fig1.jpg "/>
איור 1. שריר הגסטרוקנמיוס Denervated מדגים ניוון מתקדם. 6 עכברי C57Black עברו חיתוך רוחב של עצב השוקה הימני. שריר הגסטרוקנמיוס היה שנקטפו משליטת denervated (מימין) ונגדית (משמאל) בhindlimbs 1, 2, או 4 שבועות לאחר חיתוך רוחב עצב. שרירי הגסטרוקנמיוס נשקלו, והמשקל של שריר denervated מבוטא כיחס של שריר מעוצבבים שליטה הנגדי. Denervation גורם אובדן הדרגתי של מסת שריר.
איור 2. שריר הגסטרוקנמיוס Denervated מדגים ירידה הדרגתית באזור חתך myofiber שרירי הגסטרוקנמיוס () Denervated ושליטה היו קבועים פורמלין, לגזור על החתך בmusclדואר אמצע הקטע וimmunostained לשרירן שריר אנטי שלד, מהיר עווית איזופורם (My-32, Sigma, 1:500 דילול) ואחריו נוגדנים משני biotinylated וstreptavidin-HRP/DAB כמתואר 7. Hematoxylin שימש כcounterstain. סיבים מסוג II עווית מהירים כתם חום וסוג עווית איטי סיבי I כתם סגולים בהירה. שטח החתך (CSA) של הסיבים נמדד באמצעות תוכנת ImageJ (Bethesda, NIH) כמתואר 7,12. את הסיבים מסוג II המהירים עווית להפגין ניוון מתקדם. כמה גם אני סוג סיבים נמצאים בהגסטרוקנמיוס denervated כדי לאפשר הערכה תקפה סטטיסטי של גודל סיבים. (N = 6 עד 9 עכברים / קבוצה מינימאלית של 200 myofibers נמדדו לשריר על ידי סוקר העיוור לפנוטיפ האופרטיבי הנתונים מוצגים כממוצע + / -... בר SD קנה מידה שווה 100 מיקרומטר). לחץ כאן לצפייה גדולה יותר להבין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי של ניוון שרירים שלד מושרה denervation הוא מודל מועסק בדרך כלל ותוקף גם בחולדות. יש לנו להתאים את המודל הזה לשימוש בעכברים, המאפשר לחוקר לנצל את קיומם של עכברים מהונדסים גנטי וללמוד את התהליך של ניוון השרירים in vivo בהיעדר חלבונים חיוניים לרגולציה של מסת שריר 7,8. את שרירי הגסטרוקנמיוס וSoleus, שני denervated במודל זה, יכול להיות בקלות ובמהירות גזור עם טיפול מינימאלי, ובכך לספק mRNA איכות מעולה וחלבון לניתוחים מולקולריים שלאחר מכן. כמו כן, בגלל הגודל של השרירים, הם יכולים להיות מפוצלים, מספקים רקמה מאותה החיה עבור ניתוחים היסטולוגית וmorphometric נלווים. אם יש צורך בהערכה התפקודית hindlimb, הליכה מסלול ניתוח יכולה להתבצע באופן טורי. כפות הרגליים הן טבולות בדיו והעכבר הלך במתחם עם נייר עלתחתון. מאפיינים של ההדפסים ניתן למדוד באופן מהימן וכבש כדי לציין את מידת נכות התוקפת והפשרה הילוך, שכן מאפייני טביעת רגל משקפים את קבוצות השרירים הפונקציונליות 13,14. בעוד שפותח במקור ותוקף בעכברוש 13, הליכה מסלול ניתוח יכול להתבצע גם בעכברים 15.
חיתוך רוחב עצב הטיביאלי נסבל בדרך כלל טוב מאוד על ידי העכברים. רק מנה אחת של משכך כאבים היא הכרחית בתקופה שלאחר הניתוח המיידית. עם השימוש בטכניקה סטרילית נכונה, זיהום ברקמות רך הוא נדיר. אמנם חיתוך רוחב עצב הטיביאלי עושה לגרום paraesthesia החושי בהיבט הפלנטרי של כף הרגל, בC57black6 הניסיון ונוקאאוט או העכברים הטרנסגניים נגזרים על הקו הזה אינו נוטה אוטומטי מום. עם זאת, העכברים חייבים להיבדק מדי יום לסימנים אוטומטי הטלת המום, כיבי לחץ העקב, כמו גם נקודה של נקודות קצה לטיפול. אמנם יש לנו שנינות תמותה זניחהשעות מודל, אנו מוצאים כי כ 2-5% של עכברים חייבים להיות מורדמים עקב פציעה עצמית בתיווך ל, או כיבי לחץ פיתוח ב, איבר האחורי פעל. השימוש במצעים רכים שלאחר הניתוח הוא חיוני כדי להבטיח את הנוחות של בעל החיים ומסייע במניעת התפתחות כיבי לחץ בצד המנותח. קשירת עצב השת, כמו גם את מודל SNI של קשירה (שבו ענפי peroneal השוקה ומשותפים של הירך הם ligated, אבל sural נותר בשלמותה) ישמש כמודלים של כאב נוירופתי 16,17. לפיכך, אלודיניה וhyperalgesia תרמית יכולים להתרחש ברגל במודל שלנו, כמו גם, אבל אנחנו לא ראינו את התנהגות כאב גלויה בעכברים עם פעילות יומיומית רגילה במצעים רכים.
העצב הטיביאלי אחד בלבד hindlimb הוא transected ומאז משקל העכברים לשאת כמעט שווה בשווה בשני hindlimbs, שרירים מהאיבר המופעל באמצעות האו"ם הנגדי יכולים לשמש כבקרה פנימית בתוך כל חיה 7-10.זה לא בהכרח מקרה במודל חיתוך רוחב השת, שבו ליקויים יותר משמעותיים של הליכה יכולים לגרום לתגובת hypertrophic בשריר האיבר הנגדי. במודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי, אנו משתמשים בדרך כלל בשריר הגסטרוקנמיוס וSoleus מהאיבר המופעל באמצעות האו"ם כשריר שליטת 7,8 שלנו. אם החוקר בוחר להשתמש בבעלי חיים נפרדים ממנו למסוק שריר שליטה, אז יש לבצע ניתוח דמה. שאם הניתוח הייתי מורכב מהממשל של הרדמה, פיצול של העור כדי לחשוף את העצב הטיביאלי, אבל אין חיתוך רוחב. העור הייתי פשוט להיות סגור עצב החשיפה הבאה.
בחלק מדגמי חיתוך רוחב עצב היקפיים, עצבוב תועה מגדם הפרוקסימלי לשריר היעד מזהם denervation המתוכנן. במודל זה, הבטחת הקצה הפרוקסימלי של העצב הטיביאלי transected אל פני השטח השטחי של השרירים femoris שרירי, ובכך לסגור את ממשק השריר, המעצוריםTS העצבוב התועה. ככזה, הוא שלב קריטי ומהותי במודל. עצבוב תועה הוא נדיר במודל הזה.
בדומה לכך, הטיפול זהיר של העצב במהלך הניתוח הוא חיוני. ענפי עצב Sural וperoneal חייבים להיות מופרדים בעדינות מהעצב הטיביאלי לפני חיתוך רוחב השוקה, ולא מרוסקים או נמתחו בתהליך. טיפול אגרסיבי מדי של העצבים האלה יתפשר תפקידם, באופן חלקי denervating שרירי hindlimb אחרים. במקרה זה ההליכה של בעל החיים תהיה מושפעת באופן דיפרנציאלי בהשוואה לאותם עכברים שעברו חיתוך רוחב עצב הטיביאלי בלעדי, וטעינת השריר משתנה עלולה לזהם את תוצאות הניסוי. בדומה לכך, יש לנקוט בזהירות בעת לנתח את שרירי denervated. שריר צריך להיות מטופלים על ידי הגיד, ולא הבין באופן ישיר, כדי למנוע דוחק חפץ שישפיע היסטולוגיה, ניתוחי morphometric סיבי שריר ואולי ביטוי גנים.
אנחנו לאypically להעסיק מודל זה בעכברים גרם 20-24 (2-3 חודשים של גיל), כבעל החיים בוגר ועצבי sciatic ושוקת שניהם בגודל המתאים להיות מטופל בקלות. הניתוח יכול להתבצע על בעלי חיים צעירים יותר, קטנים יותר, אם תרצה בכך, אבל הגורם המגביל כאן יהיה תעוזה של מנתח ההפעלה. זו עשויה להיות בעיה אם החוקר מעוניין ללמוד את תגובת תא הלווין בשריר denervated. פוטנציאל ההתחדשות של תאי הלווין פוחת במבוגר יותר, בהשוואה לצעירה יותר, בעלי חיים 18, ולכן בעלי חיים צעירים יותר עשויים להיות נדרשים בתכנון הניסוי, הצגת אתגר טכני למפעיל מנוסה פחות.
מודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי יכול להיות מותאם ממודל פשוט של ניוון שרירים נגרם denervation, לאחד מעצבוב שרירים המאוחר (> 4 שבועות), אם תרצה ואם מפעילי כירורגיות מנוסים זמינים 1,3. לאחר תקופה של denervation שצוינה על ידי investigator, ניתן reoperated העכבר ועצב peroneal התגייס ReInnervate שרירי denervated. הגדם הדיסטלי של העצב הטיביאלי transected מזוהה, גזוז ועצב peroneal מגויס בקצה הדיסטלי שלה וmicrosurgically תיקון לגדם העצב הטיביאלי. עצב peroneal יגדל בשיעור של כ 1 מ"מ / יום לגדם העצב הטיביאלי לReInnervate את שרירי הגסטרוקנמיוס וSoleus. מודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי מספק יתרון על פני מודל חיתוך רוחב העצב השת שבשתל עצב אין צורך בהליך העצבוב 2 בגלל הזמינות של עצב peroneal. עם זאת, יש לציין כי reanastomoses העצב דורש דיוק של מפעיל מיומן ומנוסה.
לסיכום, כאן אנחנו מדגימים את מודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי בעכברים, כמודל קל, חזק, תוקף גם לשחזור של ניוון שרירים שלד מושרה denervation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים מוכרזים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מCIHR Neuromuscular מחקר השותפות (תל"י - 90,959; לJAEB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Materials | |||
| 10-0 Nylon suture | Ethicon | 2850G | |
| 5-0 Vicryl suture | Ethicon | J553G | |
| Equipment | |||
| Spring microdissecting scissors | Fine Surgical Tools | 15021-15 | |
| Ultra fine forceps | Fine Surgical Tools | 11370-40 | |
| Non locking micro needle holder (driver) | Fine Surgical Tools | 12076-12 | |
| Spring retractor | Fine Surgical Tools | 17000-02 | |
References
- Fu, S. Y., Gordon, T. Contributing factors to poor functional recovery after delayed nerve repair: prolonged denervation. J. Neurosci. 15, 3886-3895 (1995).
- Kobayashi, J., Mackinnon, S. E., Watanabe, O., Ball, D. J., Gu, X. M., Hunter, D. A., Kuzon, W. M. The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model. Muscle Nerve. 20, 858-866 (1997).
- Bain, J. R., Veltri, K. L., Chamberlain, D., Fahnestock, M. Improved functional recovery of denervated skeletal muscle after temporary sensory nerve innervation. Neuroscience. , 103-503 (2001).
- Batt, J., Bain, J., Goncalves, J., Michalski, B., Plant, P., Fahnestock, M., Woodgett, J. Differential gene expression profiling of short and long term denervated muscle. FASEB J. 20, 115-117 (2006).
- Sher, J., Cardasis, C. Skeletal muscle fiber types in the adult mouse. Acta Neurol. Scand. 54, 45-56 (1976).
- Agbulut, O., Noirez, P., Beaumont, F., Butler-Browne, G. Myosin heavy chain isoforms in postnatal muscle development of mice. Biol. Cell. 95, 399-406 (2003).
- Nagpal, P., Plant, P. J., Correa, J., Bain, A., Takeda, M., Kawabe, H., Rotin, D., Bain, J. R., Batt, J. A. The ubiquitin ligase nedd4-1 participates in denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. PLoS ONE. 7, e46427 (2012).
- Plant, P. J., Bain, J. R., Correa, J. E., Woo, M., Batt, J. Absence of caspase-3 protects against denervation-induced skeletal muscle atrophy. J. Appl. Physiol. 107, 224-234 (2009).
- Varejao, A. S., Meek, M. F., Ferreira, A. J., Patricio, J. A., Cabrita, A. M. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration in the rat: walking track analysis. J. Neurosci. Methods. 108, 1-9 (2001).
- Willand, M. P., Holmes, M., Bain, J., Fahnestock, M., de Bruin, H. Electrical muscle stimulation after immediate nerve repair reduces muscle atrophy without affecting reinnervation. Muscle Nerve. 48, 219-225 (2013).
- Sterne, G. D., Coulton, G. R., Brown, R. A., Green, C. J., Terenghi, G. Neurotrophin-3-enhanced nerve regeneration selectively improves recovery of muscle fibers expressing myosin heavy chains 2b. J. Cell Biol. 139, 709-715 (1997).
- Plant, P. J., North, M. L., Ward, A., Ward, M., Khanna, N., Correa, J., Scott, J. A., Batt, J. Hypertrophic airway smooth muscle mass correlates with increased airway responsiveness in a murine model of asthma. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 46, 532-540 (2012).
- Bain, J. R., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Functional evaluation of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plast. Reconstr. Surg. 83, 129-138 (1989).
- Hare, G. M., Evans, P. J., Mackinnon, S. E., Best, T. J., Midha, R., Szalai, J. P., Hunter, D. A. Walking track analysis: utilization of individual footprint parameters. Ann. Plast. Surg. 30, 147-153 (1993).
- McLean, J., Batt, J., Doering, L. C., Rotin, D., Bain, J. R. Enhanced rate of nerve regeneration and directional errors after sciatic nerve injury in receptor protein tyrosine phosphatase sigma knock-out mice. J. Neurosci. 22, 5481-5491 (2002).
- Richner, M., Bjerrum, O. J., Nykjaer, A., Vaegter, C. B. The spared nerve injury (SNI) model of induced mechanical allodynia in mice. J. Vis. Exp. (54), e3092 (2011).
- Rogoz, K., Lagerstrom, M. C., Dufour, S., Kullander, K. VGLUT2-dependent glutamatergic transmission in primary afferents is required for intact nociception in both acute and persistent pain modalities. Pain. 153, 1525-1536 (2012).
- Thornell, L. E. Sarcopenic obesity: satellite cells in the aging muscle. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 14, 22-27 (2011).
