Näthinneavlossning modell i gnagare genom subretinal Injektion av natriumhyaluronat

Summary

Att skapa experimentella retinal detachement med en reproducerbar och ihållande höjd av avskildhet och utan subretinal blödning, är viktig för att studera patofysiologin vid fotoreceptorcellförlust i näthinnesjukdom och utvärdera potentiella terapeutiska ingrepp. Här rapporterar vi en sådan metod i detalj.

Abstract

Subretinal injektion av natriumhyaluronat är en allmänt accepterad metod för att inducera näthinneavlossning (RD). Däremot kan höjden och längden på RD eller förekomsten av subretinal blödning påverkar fotoreceptor celldöd i näthinneavlossning. Därför är det fördelaktigt att skapa reproducerbara RDar utan subretinal blödning för bedömning av fotoreceptor celldöd. Vi ändrade en tidigare rapporterad metod för att skapa bullös och ihållande RDar på ett reproducerbart läge med sällsynta förekomsten av subretinal blödning. Det kritiska steget i denna modifierade metoden är att skapa en självtätande scleral snitt, vilket kan förhindra läckage av natriumhyaluronat efter injektion i subretinal rymden. För att göra det självtätande sklerala snittet, en skleral tunnel skapas, följt av skleral inträngning i åderhinnan med en 30 G nål. Även om koroidala blödning kan inträffa under detta steg, astriction med ett kirurgiskt spjut minskar graden av koroidal fållorrhage. Denna metod tillåter en mer reproducerbar och tillförlitlig modell för fotoreceptor död i sjukdomar som involverar RD såsom regmatogen RD, prematur retinopati, diabetisk retinopati, central serös chorioretinopathy, och åldersrelaterad makuladegeneration (AMD).

Introduction

Fotoreceptor celldöd och efterföljande visuell minskning inträffar när fotoreceptorerna är separerade från det underliggande pigmentepitelet. Fysisk separation av fotoreceptorer ses i olika näthinnesjukdom, inklusive åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), central serös chorioretinopathy, diabetesretinopati, och retinopati hos prematura, liksom regmatogen (dvs. som orsakas av ett avbrott i näthinnan) näthinneavlossning ( RD). Subretinal injicering av natriumhyaluronat är en allmänt accepterad modell för att skapa en RD som leder till ljusmätare celldöd, som ger insikt i patofysiologin av ljusmätare degeneration ^1-15.

Ljusmätare degeneration inducerad av subretinal natriumhyaluronat injektion, först introducerades 2001 ^7, har den fördelen att en rimlig tid kurs (dagar till veckor). Den kan emellertid ha betydande variabilitet fotoreceptorcellförlust från djur till animal på grund av två viktiga faktorer som påverkar ljusmätare celldöd efter RD: 1) höjd och varaktighet RD, och 2) Förekomsten av subretinal blödning. Det finns en brant inlärningskurva för den metod som bidrar till att båda faktorerna teknisk. Fotoreceptor cell degeneration ökar med höjden på RD, som avståndet mellan näthinnans pigmentepitel (RPE)-skiktet och fotoreceptorer ökar ^{från 16 till 17.} I överensstämmelse med dessa rapporter, våra tidigare experiment visade mer ljusmätare död i bullösa RDar än grunda RD. Det har också rapporterats att subretinal blödning är giftigt för fotoreceptorceller och påverkar ljusmätare celldöd ^18-21. Likaså har vi observerat mer ljusmätare död i RDar med subretinal blödning än RDar utan subretinal blödning. Därför tekniker för att minimera variabiliteten måste fokusera på att uppnå konsekventa höjder RD samtidigt undvika subretinal blödning.

Vårt modifierade metoden enligt iducera RD kan göra reproducerbar bullös och ihållande RD på samma position i ögat med sällsynta förekomsten av subretinal blödning. Vi utförde operationen med hjälp av en tidsmässig strategi eftersom det är lättare att uppnå en bredare operativa området jämfört med andra platser. Efter konjunktival snitt, är en självtätande skleral incision med användning av en 30 G nål. En skleral tunnel skapas, följt av skleral inträngning i åderhinnan. Om choroidal blödning uppstår i detta steg kommer blödning ur ögat genom skleral såret, och blödningen kan stoppas genom astriction med en kirurgisk spjut. En främre kammaren punktering utförs sedan från hornhinnan för att minska det intraokulära trycket. Detta är ett viktigt steg eftersom subretinal injektion enbart kommer att leda till ökat intraokulärt tryck med resulte retinal artär ocklusion och ischemi i det inre näthinnan. A 33 G nål förbunden med en il spruta Hamilton 10 förs sedan in i det subretinala utrymmet, och 3,5 μ, L natriumhyaluronat försiktigt injiceras för att lossa den neurosensoriska näthinnan från den underliggande RPE. I motsats till andra metoder för att inducera RD som utförs under fundus observation är denna teknik utföras under direkt observation. Sedan den sklerala sår är självtätande, kommer natriumhyaluronat inte att läcka ut efter injektion. Slutligen är lim pålagt den sklerala sår, och bindhinnan är anbringas på nytt till sin ursprungliga position. Dessa varar åtgärder minskar också risken för natriumhyaluronat läckage. Injektionen av 3,5 pl natriumhyaluronat skapar reproducerbara RDS (50% av näthinnan) i ögonen på 8 veckor gamla möss. Att skapa det självtätande sår är det viktigaste steget i vår modifierade förfarande eftersom det hindrar den injicerade natriumhyaluronat från att läcka ut ur ögat, vilket möjliggör reproducerbar bullös och ihållande RDS.

Protocol

Alla experiment på djur har utförts i enlighet med Föreningen för forskning i Vision och Ögon uttalande för användning av djur i ögon och Vision Research, samt de riktlinjer och regler som anges av Massachusetts öga och öra Infirmary Animal Care kommittén.

1. Förbehandling

1. Söva en 8 veckor gammal mus med en intraperitoneal injektion av en blandning av 60 mg / kg ketamin och 6 mg / kg xylazin.
2. Skär morrhåren. Detta görs för att de stör visualisering och instrumentplacering.
3. Vidga pupillen med 5% fenylefrin och 0,5% tropikamid.
4. Skär cilier. Detta görs också för att de stör visualisering och instrumentplacering.
5. Applicera topikal anestesi (0,5% proparakain hydroklorid ögondroppar).

2. Kirurgi under lupp

1. Ställ musen i en lateral posUtgåva med näsan mot kirurgen. En tå nypa utförs för att bekräfta kirurgisk anestesi, och sterila handskar västen före start operation.
2. Incise tidsbindhinna vid bakre limbus och separera hinnan från sklera. Undvik penetrerande sklera. Efter detta steg, ta tag i bindhinna vid limbus med pincett för att styra ögat.
3. Gör en självtätande skleralt snitt hjälp av spetsen på en 30 G nål med avfasningen riktad uppåt. Lägg till en skleral tunnel genom sklera och penetrera senhinnan i åderhinnan (fig 1). Undvik att tränga in i retina. Om koroidal blödning inträffar och kommer ut genom det sklerala sår, utföra en astriction med en kirurgisk spjut tills blödningen slutar. Denna skleral sår blir självtätande med intraokulära trycket.
4. Punktera hornhinnan med en 30 G nål för att minska ögontrycket. Använd nålen parallellt med iris för att undvika att skada iris och lins under enFörsök i den främre kammaren. Det intraokulära trycket kommer att orsaka att såret självtätning.
5. Sätt en 33 G nål ansluten till en pl spruta Hamilton 10 i subretinal rymden med avfasningen pekade nedåt (mot det inre ögat), och injicera 3,5 pl natriumhyaluronat försiktigt för att lossa den neurosensoriska näthinnan från den underliggande RPE. Undvik att tränga in i näthinnan med 33 G nål eftersom natriumhyaluronat kommer att gå in i glaskroppen utrymme men inte subretinalområdet om näthinnan penetreras. Också undvika snabb injektion, eftersom det kommer att skapa en oral tår, och natriumhyaluronat kommer att läcka in i den främre kammaren.
6. Låt kammarvattnet strömma ut från hornhinnans punktering genom tryckning av kornea runt hornhinnans punktering med pincett för att justera det intraokulära trycket.
7. Bekräfta frånvaro av läckage från skleral såret med hjälp av en kirurgisk spjut.
8. För att minska risken för natriumhyaluronat läckage, placera cyanoakrylat kirurgiskt lim påden sklerala sår.
9. Sätt tillbaka hinnan till sitt ursprungliga läge med hjälp av cyanoakrylat kirurgiskt lim. Detta kommer att ytterligare minska risken för natriumhyaluronat läckage.
10. Kontrollera fundus hjälp av ett täckglas och bekräfta skapandet av en bullös RD utan subretinal blödning.

3. Efter behandling

1. Applicera bacitracin antibiotisk salva i ögat för att minska risken för infektion.
2. Håll mössen på en värmedyna för att förhindra anestesi (blandning av ketamin och xylazin) från att orsaka låg kroppstemperatur efter det att lågt blodtryck.
3. Sätt mössen tillbaka till djuret bur efter att de vaknar ur narkos. Övervaka mössen dagligen för komplikationer. Om några komplikationer uppstår, euthanize möss såsom beskrivs nedan.

4. Offer

1. Euthanize mössen genom cervikal dislokation efter intraperitoneal injektion av 100 mg / kg natriumpentobarbital och enucleate ögonen vid lämpliga tidpunkter för varje experiment (ej visat). Undvik att trycka på ögat under enucleation eftersom natriumhyaluronat kan läcka ut. Bullösa RDar bör vara ihållande under minst 14 dagar.

Representative Results

För att bedöma den ihållande RD gjorts av detta protokoll, har kryosnitt gjordes på dag 3, 7 och 14 efter induktion av RD. Sex ögon användes för varje tidpunkt. Hematoxylin och eosin (HE)-färgning användes för att visualisera sektionerna. Alla sektioner visade en bullös RD närmar linsen (Figur 2). Ett öga visade subretinal blödning på dag 7. Inga ögon visade några tecken på infektion eller linsskador.

Figur 1. Skapa en självtätande skleral snitt. Detta schema visar en tvärsnittsbild av en vanlig mus öga. Röd linje visar det självtätande skleralt snitt. En skleral tunnel följt av skleral inträngning i åderhinnan med en 30 G nål skapar en självtätande sklerala snittet. Denna sklerala sårkommer att vara självtätande med intraokulärt tryck, som kan förhindra läckage av natriumhyaluronat efter injektion i det subretinala utrymmet och uppnå ihållande bullösa retinala avdelningar.

Figur 2. Tidsförlopp för näthinneavlossning. Detta fundus foto visar en bullös näthinneavlossning utan subretinal blödning omedelbart efter operationen. Kryosnitt med hematoxylin och eosin (HE)-färgning visar ihållande bullös näthinneavlossning utan subretinal blödning genom åtminstone dag 14.

Discussion

Flera metoder för att fastställa en RD-modell i gnagare ögon har rapporterats ^{3-15, 22.} De flesta av dem använder subretinal injicering av natriumhyaluronat, eftersom det är en trögflytande material som vanligen används vid intraokulär kirurgi hos människor, och det är inte förknippat med någon känd okulär toxicitet ^1-15. Natriumhyaluronat, snarare än fysiologisk koksaltlösning eller fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS), ökar varaktigheten av RD.

Metoderna för subretinal injicering av natriumhyaluronat använda en av två metoder: en transvitreal metod ^3-6 eller en transscleral strategi ^7-15. Båda förfarandena utförs med observation av fundus. I transvitreal tillvägagångssätt används en subretinal injektom förs in i glaskroppsrummet en retinotomy skapas i den perifera näthinnan, och natriumhyaluronat injiceras i det subretinala utrymmet. I denna metod är två retinal tårar gjorts, vilket ökar risken för näthinnanl blödning som kan gå in i subretinal rymden. Dessutom finns det en risk för att linsskada när retinotomy skapas. Det finns flera modifierade metoder för transscleral tillvägagångssätt. I de flesta av dessa metoder ^7-12, efter att minska det intraokulära trycket med en främre kammare punktera en 30 G nål förbunden med en spruta fylld med natriumhyaluronat är direkt införd i det subretinala utrymmet genom bindhinnan, senhinnan, koroidea, och RPE. Den natriumhyaluronat sprutas sedan in i det subretinala utrymmet. Risken för näthinneruptur och linsskada använder denna transscleral metoden är mindre än det som använder den transvitreal tillvägagångssätt. Emellertid är det hål som gjorts i sklera genom en 30 G nål stor, särskilt för mus ögon och natriumhyaluronat injiceras i det subretinala utrymmet läcker lätt ut ur ögat genom den sklerala sår. Detta leder till en lägre, mindre ihållande RD och mer variabel död fotoreceptorcell. Dessutom, om choroidal blödning uppstår iden sklerala perforering steg kommer hemorragi spridas i subretinal utrymme eftersom det intraokulära trycket har reducerats före subretinal hyaluronat injektion.

Flera faktorer kan påverka effekten av RD på näthinneavlossning, både subretinal blödning och höjden och ihållande RD ^16-21. Fotoreceptorcelldöd ökar med ökande höjd av RD ^{16, 17} och fotoreceptorcellskada kan vara mer omfattande på grund av minskad diffusion av syre och näringsämnen från choriocapillaris med högre RD jämfört med grunt RD. Subretinal blödning är också giftigt för fotoreceptorceller ^18-21, möjliga mekanismer för denna toxicitet i näthinneavlossning inkluderar hypoxi och metabola störningar av subretinal blödning som en diffusionsbarriär, och direkt neurotoxicitet inducerad av blodkomponenter (t.ex. järn). Lins skada, som har rapporterats att ha en skyddande effekt på retinella ganglieceller ^23, kan också påverka fotoreceptorcelldöd efter induktion av RD. Dessutom, om posten sårområdet inte förslutits kan natriumhyaluronat läcka ut med ögon manipulation under enucleation. Detta kan leda till en felaktig klassificering av en RD så grunt, vilket i sin tur kan påverka tolkningen av resultaten.

Vi ändrade transscleral metod för subretinal injicering av natriumhyaluronat att öka reproducerbarheten av RDS och minska graden av subretinal blödning. Det kritiska steget i detta protokoll är att skapa en självtätande scleral snitt med hjälp av en 30 G nål, vilket förhindrar läckage av natriumhyaluronat efter injektion. Till skillnad från tidigare metoder, är detta protokoll utförs utan observation av fundus så större uppmärksamhet ägnas åt den skleralt såret. Applicering av lim förhindrar även natriumhyaluronat från att läcka ut ur ögat. I vår erfarenhet, graden av subretinal blödning med detta protokoll wsom signifikant mindre än den med andra protokoll. Om koroidal blödning inträffar under den sklerala snittet steg, kommer det att lämna ögat genom den sklerala sår eftersom detta steg utförs innan minska intraokulärt tryck. Om koroidal blödning uppstår efter sänkning av det intraokulära trycket och avlossning av neurosensoriska näthinnan, kommer blod dissekera i subretinal rymden. Vi fann att detta ska ske i cirka 5% av fallen i motsats till ca 10-20% med andra tekniker. Dessa djur bör undantas från analysen.

Denna teknik kan också användas för subretinal injektion av vektormedierad genöverföring till mål fotoreceptor-eller RPE-celler ^{24, 25.} Eftersom den typiska vehikel (PBS, saltlösning) för dessa injektioner är betydligt mindre viskös än natriumhyaluronat är standardtekniker som plågas av flera läckor. Den teknik som beskrivs häri, genom att minska denna risk, gör vektoröverföringsförsök mer reproducerbar ochtillförlitliga.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketaject	Phoenix	2010025
AnaSed	LLOYD	4004821
5% Phenylephrine / 0.5% Tropicamide	Massachusetts Eye and Ear Pharmacy
0.5% Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution	AKORN	17478-263-12
Provics	Alcon	8065183085
Webglue	Patterson Veterinary	07-8566128
Microscope	Leica	MG90
30G1/2 PrecisionGlide Needle	BD	305106
Weck-Cel Eye Spears	Beaver-Visitec	0008685
10 Microliter Syringe	Hamilton	7635-01
33 gauge, 0.5 inch needle	Hamilton	7803-05
18x18mm Cover Glass	Fisher Scientific	18-548A