Nethindeløsning Model i Gnavere ved subretinal Injektion af Natriumhyaluronats

Summary

Oprettelse eksperimentelle retinaløsninger med en reproducerbar og vedvarende højde løsrivelse og uden subretinal blødning, er vigtig for at studere patofysiologien af ​​fotoreceptor celletab i retinal sygdom og vurdere de mulige terapeutiske indgreb. Her rapporterer vi en sådan fremgangsmåde i detaljer.

Abstract

Subretinal injektion af natriumhyaluronat er en almindeligt accepteret metode til at inducere nethindeløsning (RD). Højden og varigheden af ​​RD eller forekomsten af ​​subretinal blødning, kan dog påvirke fotoreceptorer celledød i fritliggende nethinden. Derfor er det fordelagtigt at skabe reproducerbare RD'er uden subretinal blødning til evaluering fotoreceptor celledød. Vi ændrede en tidligere rapporteret metode til at skabe bulløse og vedvarende RD'er i en reproducerbar placering med sjældne forekomst af subretinal blødning. Det kritiske trin i denne ændrede metode er oprettelsen af ​​en selvlukkende skleral snit, som kan forhindre udsivning af natriumhyaluronat efter injektion i subretinarummet. For at gøre selvlukkende scleral indsnit, en sclera tunnel er oprettet, efterfulgt af sclera indtrængning i årehinden med en 30 G nål. Selv koroidal blødning kan forekomme under dette trin, astriction med en kirurgisk spyd reducerer antallet af koroidal hemorrhage. Denne metode giver en mere reproducerbar og pålidelig model af fotoreceptorer død i sygdomme, som medfører RD såsom rhegmatogen RD, præmatur retinopati, diabetisk retinopati, central serøs chorioretinopati, og aldersrelateret makuladegeneration (AMD).

Introduction

Fotoreceptor celledød og efterfølgende visuel fald opstår, når fotoreceptorerne er adskilt fra den underliggende retinale pigment epitel. Fysisk adskillelse af fotoreceptorer ses i forskellige retinale lidelser, herunder aldersbetinget makulær degeneration (AMD), central serøs chorioretinopati, diabetisk retinopati og præmatur retinopati, samt rhegmatogen (dvs. som følge af et brud på nethinden), nethindeløsning ( RD). Subretinal injektion af natriumhyaluronat er en bredt accepteret model til at skabe en RD, der fører til fotoreceptor celledød, som giver indsigt i patofysiologien af fotoreceptordegenerering ^1-15.

Fotoreceptordegenerering induceret af subretinal natriumhyaluronats injektion, først indført i 2001 ^7, har den fordel, at en rimelig tid kursus (dage til uger). Det kan imidlertid have en betydelig variation i fotoreceptor celletab fra dyr til animal skyldes to vigtige faktorer, der påvirker fotoreceptor celledød efter RD: 1) højde og varighed af RD, og ​​2) forekomsten af ​​subretinal blødning. Der er en stejl teknisk indlæringskurve til den metode, der bidrager til begge faktorer. Fotoreceptor celle degeneration stiger med højden af RD, som er afstanden mellem det retinale pigment epitel (RPE) lag og fotoreceptorer øger ^16-17. I overensstemmelse med disse rapporter, vores tidligere forsøg viste mere fotoreceptorer død i bulløse RD'er end lavvandede RDS. Det er også blevet rapporteret, at subretinal blødning er giftige for fotoreceptorceller og påvirker fotoreceptor celledød ^18-21. Ligeledes har vi observeret flere fotoreceptorer død RDS med subretinal blødning end RD'er uden subretinal blødning. Derfor, teknikker til at minimere variabilitet nødt til at fokusere på at opnå ensartede højder af RD samtidig undgå subretinal blødning.

Vores modificeret metode iducere RD kan gøre reproducerbar bulløse og vedvarende RD på den samme position i øjet med sjældne forekomst af subretinal blødning. Vi udførte operation ved hjælp af en tidsmæssig fremgangsmåde, fordi det er lettere at opnå en bredere operative område sammenlignet med andre steder. Efter konjunktival indsnit, er en selvlukkende sclerale snit lavet ved hjælp af en 30 G nål. En sclerale tunnel er oprettet, efterfulgt af sclerale indtrængen i årehinden. Hvis der opstår koroidal blødning i dette trin, vil blødning forlade øjet gennem sclerale sår, og blødningen kan standses ved astriction med en kirurgisk spyd. En forreste kammer punktering udføres derefter fra hornhinden for at reducere det intraokulære tryk. Dette er et vigtigt skridt, fordi subretinal injektion alene vil føre til øget intraokulært tryk med deraf retinal arterie okklusion og iskæmi af den indre nethinde. A 33 G kanyle forbundet til en Hamilton 10 pi sprøjten indsættes derefter i subretinarummet, og 3,5 μ, L natriumhyaluronatet forsigtigt injiceres at frigøre neurosensoriske nethinden fra den underliggende RPE. I modsætning til andre metoder til fremkaldelse af RD, der udføres under fundus observation, er denne teknik udføres under direkte observation. Da den sclerale sår er selvbærende, vil natriumhyaluronat ikke sive ud efter injektion. Endelig er lim sat på sclerale sår, og bindehinde er reattached til sin oprindelige position. Disse varer trin reducerer også risikoen for natriumhyaluronat lækage. Injektion af 3,5 pi natriumhyaluronat skaber reproducerbare RDS (50% af nethinden) i øjnene på 8 uger gamle mus. Oprettelse af selvlukkende sår er det vigtigste skridt i vores ændrede procedure, fordi det forhindrer den injicerede natriumhyaluronat fra utætte ud af øjet, således at reproducerbar bulløse og vedvarende RDS.

Protocol

Alle eksperimenter på dyr blev udført i overensstemmelse med Foreningen for Forskning i Vision og Oftalmologi Erklæring til brug af dyr i Ophthalmic og Vision Research, og de retningslinjer og regler angivet af Massachusetts øjet og øret Ambulatorium Animal Care udvalget.

1.. Forbehandling

1. Bedøver en 8 uger gamle mus med en intraperitoneal injektion af en blanding af 60 mg / kg ketamin og 6 mg / kg xylazin.
2. Skær knurhår. Dette sker, fordi de griber ind i visualisering og instrument placering.
3. Spile eleven med 5% phenylephrin og 0,5% tropicamid.
4. Skær cilia. Dette er også gjort, fordi de griber ind i visualisering og instrument placering.
5. Anvend topisk anæstesi (0,5% proparacain hydrochlorid oftalmisk opløsning).

2. Kirurgi under lup

1. Sæt musen i en lateral position med næsen mod kirurgen. En tå knivspids er udført for at bekræfte kirurgisk anæstesi, og sterile handsker er iførte før start kirurgi.
2. Incise den tidsmæssige bindehinde ved den bageste limbus og adskille bindehinde fra sclera. Undgå at trænge senehinden. Efter dette trin fat bindehinde ved limbus med en pincet til at styre øjet.
3. Lav en selvlukkende sclerale snit med spidsen af ​​en 30 G kanyle med facet pegede op. Foretag en scleral tunnel gennem sclera og trænge sclera i årehinden (figur 1). Undgå at trænge ind på nethinden. Hvis koroidal blødning og kommer ud gennem sclerale sår, udføre en astriction med en kirurgisk spyd indtil blødningen stopper. Denne sclera sår vil være selv-forseglet med det intraokulære tryk.
4. Punktere hornhinden med en 30 G nål til at reducere det intraokulære tryk. Brug nålen parallelt med iris for at undgå, iris og linse i løbet af enForsøg i forkammeret. Det intraokulære tryk vil forårsage, at såret selvtætnende.
5. Sæt en 33 G kanyle forbundet til en Hamilton 10 gl sprøjten i subretinarummet med facet pegede ned (mod det indre øje), og tilføre 3,5 pi natriumhyaluronats forsigtigt for at løsne den neurosensoriske nethinde fra den underliggende RPE. Undgå gennemtrængende nethinden med 33 G kanyle fordi natriumhyaluronat vil gå ind i den glasagtige plads, men ikke subretinarummet hvis nethinden gennemtrænges. Undgå også hurtig injektion, fordi det vil skabe en mundtlig ælde, og natriumhyaluronat vil sive ind i forkammeret.
6. Lad kammervand strømmer ud fra hornhindens punktering ved at skubbe hornhinden omkring hornhinden punktering med en pincet til at justere det intraokulære tryk.
7. Bekræft fravær af lækage fra sclerale såret med en kirurgisk spyd.
8. For at reducere risikoen natriumhyaluronat lækage, placere cyanoacrylat kirurgisk lim påden sclerale såret.
9. Sæt bindehinde til dets oprindelige position ved hjælp af cyanoacrylat kirurgisk lim. Dette vil yderligere reducere risikoen for natriumhyaluronat lækage.
10. Kontroller fundus ved hjælp af et dækglas og bekræfte oprettelsen af ​​en bulløse RD uden subretinal blødning.

3. Efter behandling

1. Anvend bacitracin antibiotisk salve til øjet for at reducere risikoen for infektion.
2. Hold mus på en varmepude til at forhindre anæstesi (blanding af ketamin og xylazin) forårsage lav kropstemperatur efter lavt blodtryk.
3. Sæt musene tilbage til dyret bur, når de vågne fra bedøvelsen. Overvåg musene dagligt for komplikationer. Hvis der opstår komplikationer, aflive mus som beskrevet nedenfor.

4.. Sacrifice

1. Aflive musene ved cervikal dislokation efter intraperitoneal injektion af 100 mg / kg natriumpentobarbital, og enucleate øjnene på passende tidspunkter for hvert forsøg (ikke vist). Undgå at anvende pres på øjet under enucleation fordi natriumhyaluronat kan lække ud. Bulløse RD'er skal være vedholdende i mindst 14 dage.

Representative Results

For at vurdere persistens RD foretaget af denne protokol blev kryosnit foretaget på dag 3, 7, og 14 efter induktion af RD. Seks øjne blev anvendt til hvert tidspunkt. Hematoxylin og eosin (HE)-farvning blev anvendt til at visualisere sektionerne. Alle sektioner viste en bulløs RD nærmer sig linsen (figur 2). Det ene øje viste subretinal blødning på dag 7. Ingen øjne viste tegn på infektion eller objektiv skade.

Figur 1. Oprettelse af et selvforseglende sclera incision. Denne skematiske viser et tværsnit billede af en normal mus øje. Rød linje angiver selvlukkende skleral snit. En sclera tunnel efterfulgt af sclera indtrængning i årehinden med en 30 G nål skaber en selvforseglende scleral incision. Denne skleral sårvil være selv-forseglet med intraokulært tryk, som kan forhindre lækage af natriumhyaluronat efter injektion i subretinarummet og opnå vedvarende bulløse retinaløsninger.

Figur 2. Tidsforløb af nethindeløsning. Dette fundus foto viser en bulløse nethindeløsning uden subretinal blødning umiddelbart efter operationen. Kryosektioner med hematoxylin og eosin (HE)-farvning viser vedvarende bulløs nethindeløsning uden subretinal blødning gennem mindst dag 14.

Discussion

Er blevet rapporteret adskillige metoder til oprettelse af en RD-model i gnaver øjne ^{3-15 22.} De fleste af dem udnytte subretinal injektion af natriumhyaluronat, da det er en tyktflydende materiale, der ofte anvendes under intraokulær kirurgi i mennesker, og det er ikke forbundet med nogen kendt okulær toksicitet ^1-15. Natriumhyaluronat, snarere end normalt saltvand eller phosphatbufret saltvand (PBS), øger varigheden af ​​RD.

Metoderne til subretinal injektion af natriumhyaluronat bruge en af to måder: a transvitreal tilgang ^3-6 eller en transscleral tilgang ^7-15. Begge metoder udføres med observation af fundus. I transvitreal tilgang, er en subretinal injektor indført i corpus vitreum-hulen, en retinotomy er skabt i den perifere retina, og natriumhyaluronatet sprøjtes ind i subretinarummet. I denne metode, er to retinal tårer gjort, hvilket øger risikoen for retinal blødning, der kan gå ind i subretinarummet. Desuden er der risiko linse skade når retinotomy oprettes. Der er adskillige modificerede metoder til transscleral tilgang. I de fleste af disse metoder ^7-12, efter at reducere det intraokulære tryk med et forreste kammer punktering, en 30 G nål forbundet til en sprøjte fyldt med natriumhyaluronat indsættes direkte i subretinarummet gennem conjunctiva, sclera, choroidea og RPE. Den natriumhyaluronat derefter sprøjtet ind i subretinarummet. Risikoen for retinarift og linsen skade ved hjælp af denne transscleral metode er mindre end den, der ved hjælp af transvitreal tilgang. Men hul i sclera med en 30 G nål er stort, især for mus øjne og natriumhyaluronat injiceres i subretinarummet let lækker ud af øjet gennem sclera såret. Dette fører til en lavere, mindre persistente RD og mere variabel fotoreceptor celledød. Desuden, hvis choroidal blødning forekommer iden sclerale perforering skridt vil blødning spredes i subretinarummet fordi det intraokulære tryk er blevet reduceret før subretinal hyaluronat injektion.

Flere faktorer kan påvirke effekten af RD den fritliggende nethinden, herunder både subretinal blødning og højde og vedholdenhed RD ^16-21. Fotoreceptor celledød øges med stigende højde RD ^{16, 17} og fotoreceptor cellebeskadigelse kan være mere omfattende på grund af nedsat diffusion af oxygen og essentielle næringsstoffer fra choriocapillaris med højere RD forhold til lavvandede RD. Subretinal blødning er også giftige for fotoreceptorceller ^18-21; mulige mekanismer af denne toksicitet i fritliggende nethinden omfatter hypoxi og metabolisk forstyrrelse af subretinal blødning som en diffusionsbarriere og direkte neurotoksicitet fremkaldt af blodkomponenter (såsom jern). Lens skade, som er blevet rapporteret at have en beskyttende virkning på retinale ganglieceller ^23, kan også påvirke fotoreceptor celledød efter induktion af RD. Desuden, hvis posten såret ikke er forseglet, kan natriumhyaluronat sive ud med øjet manipulation under enucleation. Dette kan føre til fejlagtig klassificering af en RD som overfladisk, hvilket igen kan påvirke fortolkningen af ​​resultaterne.

Vi modificerede transscleral metode til subretinal injektion af natriumhyaluronat at øge reproducerbarheden af ​​RDS og reducere antallet af subretinal blødning. Det kritiske trin i denne protokol er at skabe en selvtætnende sclera snit under anvendelse af en 30 G nål, som forhindrer lækage af natriumhyaluronat efter injektion. I modsætning til tidligere metoder, er denne protokol udføres uden observation af fundus, så en større opmærksomhed på den sclerale såret. Anvendelse af lim også forhindrer natriumhyaluronat lække ud af øjet. Det er vores erfaring, satsen for subretinal blødning med denne protokol wsom betydeligt mindre end med andre protokoller. Hvis der opstår choroidal blødning under den sclerale indsnit trin, det vil forlade øjet gennem sclera såret, fordi dette trin udføres før reducere det intraokulære tryk. Hvis choroidal blødning forekommer efter reduktion af det intraokulære tryk og frigørelse af den neurosensoriske nethinde, vil blod dissekere i subretinarummet. Vi fandt dette at ske i omkring 5% af tilfældene i modsætning til omkring 10-20% med de andre teknikker. Disse dyr bør udelukkes fra analysen.

Denne teknik kan også anvendes til subretinal injektion af vektor-medieret genoverførsel til at målrette fotoreceptor eller RPE-celler ^{24, 25.} Fordi den typiske køretøj (PBS, saltvand) for disse injektioner er betydeligt mindre tyktflydende end natriumhyaluronat er standard teknikker plaget af flere lækager. Den beskrevne teknik, ved at reducere denne risiko, gør overføringsvektor eksperimenter mere reproducerbar ogpålidelige.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketaject	Phoenix	2010025
AnaSed	LLOYD	4004821
5% Phenylephrine / 0.5% Tropicamide	Massachusetts Eye and Ear Pharmacy
0.5% Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution	AKORN	17478-263-12
Provics	Alcon	8065183085
Webglue	Patterson Veterinary	07-8566128
Microscope	Leica	MG90
30G1/2 PrecisionGlide Needle	BD	305106
Weck-Cel Eye Spears	Beaver-Visitec	0008685
10 Microliter Syringe	Hamilton	7635-01
33 gauge, 0.5 inch needle	Hamilton	7803-05
18x18mm Cover Glass	Fisher Scientific	18-548A