ヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注入によるげっ歯類における網膜剥離モデル

Summary

剥離の再現性があり、持続的な高さが実験的網膜剥離を作成し、網膜下出血せずに、網膜疾患における光受容体細胞損失の病態生理を研究し、潜在的な治療的介入を評価するために重要である。ここでは詳細にこのような方法を報告している。

Abstract

ヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注入は網膜剥離（RD）の誘導に広く受け入れられている方法である。ただし、RDまたは網膜下出血の発生の高さと持続時間は、網膜剥離に光受容体細胞死に影響を与えることができる。したがって、光受容体細胞死を評価するために、網膜下出血することなく、再現のRDを作成することが有利である。私たちは、網膜下出血のまれな出来事で再現性のある場所に水疱性と永続はRDSを作成するために、以前に報告された方法を変更しました。この修​​正された方法の重要なステップは、網膜下腔に注射した後、ヒアルロン酸ナトリウムの漏洩を防止することができますセルフシール強膜切開の作成です。セルフシール強膜切開を行うために、強膜トンネルは30 G針で脈絡膜強膜に浸透した後、作成されます。脈絡膜出血がこの工程の間に発生する可能性がありますが、外科槍で圧迫止血は脈絡膜裾の速度を低下させるorrhage。この方法は、裂孔原性RD、未熟児、糖尿病性網膜症、中心性漿液性脈絡網膜症、加齢性黄斑変性症（AMD）の網膜症などのRDを伴う疾患における光受容体の死のより再現性や信頼性モデルを可能にする。

Introduction

光受容体は、基礎となる網膜色素上皮から分離されたとき光受容体細胞死とその後の視覚的な減少が起こる。 （ すなわち、網膜の中断によって引き起こされる）、加齢性黄斑変性症（AMD）を含む様々な網膜疾患に見られる光受容体の物理的分離、中心性漿液性脈絡網膜症、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症、ならびに裂孔原性網膜剥離（ RD）。ヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注射は光受容体変性^1-15の病態生理への洞察を提供し、光受容体細胞死に至るRDを作成するための広く受け入れられているモデルである。

、2001年⁷で導入ヒアルロン酸ナトリウム網膜下注射により誘導される光受容体の変性は、（数日から数週間）合理的な時間経過の利点を有する。しかし、アニマに動物からの光受容体細胞損失の大幅な変動性を持つことができます1）高さと、RDの期間、網膜下出血の2）の発生：原因RD後の光受容体細胞死に影響を与える二つの大きな要因にL。両方の要因に貢献する方法に急な技術的な学習曲線があります。 RDの高さが光受容体細胞の変性が増加し、網膜色素上皮との間の距離（RPE）層及び光受容体が^16-17を増加させるように。これらの報告と一致して、我々の以前の実験は浅いのRDよりも水疱、RDSの詳細光受容体の死を示した。また、網膜下出血、感光体細胞に対して毒性であり、光受容体細胞死^18-21に影響^を与えることが報告されている。同様に、私たちは、網膜下出血のないのRDよりも網膜下出血、RDS内より光受容体の死を観察した。したがって、変動性を最小限にする技術が網膜下出血を回避しながら、RDの一貫した高さを達成することに焦点を当てる必要があります。

中の我々の変法ducing RDは網膜下出血のまれな出来事で、目の同じ位置に再現性の水疱性と永続RDを行うことができます。我々は、それが他のサイトに比べて、広い術野を達成することが容易であるため、時間的なアプローチを用いて手術を行った。結膜切開の後、自己シール強膜切開は30 G針を用いて行われる。強膜トンネルは、脈絡膜に強膜の浸透が続き、作成されます。脈絡膜出血が、この工程で発生した場合、出血は強膜創を通して眼を終了し、出血は、手術槍で圧迫止血することにより停止することができます。前房の穿刺は、次いで眼内圧を減少させるために角膜から行われる。一人で網膜下注入が生じた網膜動脈閉塞と内側の網膜の虚血で、眼圧の上昇につながるため、これは重要なステップです。ハミルトン10μLシリンジに接続されている33gの針は、その後、網膜下腔に挿入し、3.5μされる;リットルのヒアルロン酸ナトリウムを穏やかに基礎となるRPEからの神経感覚網膜を分離するために注入される。眼底観察下で実行されるRDを誘導する他の方法とは対照的に、この技術は直接観察下で行われる。強膜傷が自己シールなので、ヒアルロン酸ナトリウムは、注入後に漏れ出すことはありません。最後に、接着剤は、創傷強膜上に配置され、結膜は元の位置に再接続される。これらの手順はまた、ヒアルロン酸ナトリウム漏洩のリスクを低減続く。 3.5μlのヒアルロン酸ナトリウムの注入は、8週齢のマウスの目には再現性のRDS（網膜の50％）を作成します。それはこのように、再現性水疱性と永続RDSをも可能にする、目から漏れるの注入されたヒアルロン酸ナトリウムを防ぐため、自己密封傷口を作成すると、私たちの修正された手順の中で最も重要なステップです。

Protocol

動物実験はすべてビジョンの研究のための協会に従って実行し、眼科と視覚研究における動物の使用に関する眼科声明、およびマサチューセッツの目と耳診療所の動物管理委員会が定めた指針や規制された。

1。前処理

1. 60 mg / kgのケタミンおよび6 mg / kgのキシラジンの混合物の腹腔内注射で8週齢のマウスを麻酔。
2. ウィスカーをカットします。彼らは視覚化および機器の配置と干渉しないために行います。
3. 5％フェニレフリンと0.5％トロピカミドで瞳孔を拡張する。
4. 繊毛をカットします。彼らは視覚化および機器の配置に干渉しているためこれも行われます。
5. 局所麻酔（0.5％プロパラカイン塩酸塩点眼液）を適用します。

2。顕微鏡下手術

1. 横POSでマウスを設定する外科医に向かって鼻でition。つま先のピンチは、外科麻酔を確認するために行われ、滅菌手袋は、手術前の出発に着用されている。
2. 後部角膜輪部に一時的な結膜を切開し、強膜から結膜を分離する。強膜を貫通しないようにします。このステップの後、目を制御するために、ピンセットで角膜輪部で結膜を把握する。
3. ベベルアップ指摘して30gの針の先端を使ってセルフシール強膜切開する。強膜を通して強膜トンネルを作り、脈絡膜（ 図1）に、強膜に浸透。網膜を貫通しないようにします。脈絡膜出血が発生し、強膜創を通して出てきた場合は、出血が停止するまで、外科槍で圧迫止血を行う。この強膜傷が自己密封し、眼圧となります。
4. 眼内圧を減少させるために30 G針で角膜を穿刺する。 E中に虹彩とレンズが負傷を避けるために、アイリスに針を平行に使用前房内ntry。眼圧は、セルフシールに傷の原因となります。
5. ベベルと網膜下腔にハミルトン10μLシリンジに接続されている33gの針を挿入します（内側の目に向かって）下に向け、基礎となるRPEから神経感覚網膜を分離するためにゆっくりと3.5μlのヒアルロン酸ナトリウムを注入する。網膜が貫通されている場合、ヒアルロン酸ナトリウムは、ガラス質の空間ではなく、網膜下腔に入りますので、33gの針で網膜を貫通しないようにします。また、それは口頭涙が作成されますので、迅速な注入を回避し、ヒアルロン酸ナトリウムは、前房内にリークします。
6. 房水は眼圧を調整する鉗子で角膜穿刺を中心に角膜を押すことで、角膜穿刺から流出してみましょう。
7. 外科槍を使用して強膜創からの漏れがないことを確認してください。
8. ヒアルロン酸ナトリウム漏洩のリスクを低減するために、シアノアクリレート手術用接着剤上に配置強膜創。
9. シアノアクリレート外科接着剤を使用して元の位置に結膜を再接続します。これはさらに、ヒアルロン酸ナトリウム漏洩のリスクを低減する。
10. カバーガラスを使用して眼底をチェックして、網膜下出血なしに水疱性のRDの作成を確認。

3。後の処理

1. 感染のリスクを低減するために眼にバシトラシンの抗生物質軟膏を適用する。
2. 低血圧後の低体温を引き起こす麻酔（ケタミンおよびキシラジンの混合物）を防止するために加温パッド上にマウスを保つ。
3. 彼らは麻酔から目覚めた後に戻って動物用ケージにマウスを置きます。合併症のために毎日マウスを監視します。合併症が発生した場合、後述するように、マウスを安楽死させる。

4。犠牲

1. 100 mg / kgのペントバルビタールナトリウム、およびenucleaの腹腔内注射後に頸椎脱臼によりマウスを安楽死させる各実験のための適切な時点で目をTE（図示せず）。ヒアルロン酸ナトリウムが漏れ可能性があるため、摘出時に目の上に圧力をかけることは避けてください。水疱RDSは、少なくとも14日間、永続的である必要があります。

Representative Results

このプロトコルによって行われたRDの持続性を評価するために、凍結切片を、3日目、7、及びRDの誘導後14日に行った。六つ目の各時点のために使用した。ヘマトキシリン​​およびエオシン（HE）染色切片を視覚化するために使用した。すべてのセクションでは、レンズに近づく水疱RD（ 図2）を示した。一つ目は、7日目に網膜下出血を示した。まだ目が感染またはレンズ損傷の兆候を示さなかった。

図1。セルフシール強膜切開を作成する。この図は、通常のマウスの眼の断面画像を示す。赤い線は、自己シール強膜切開を示している。 30 G針で脈絡膜強膜に浸透続く強膜トンネルは、セルフシール強膜切開が作成されます。この強膜創自己密封された網膜下腔に注射した後、ヒアルロン酸ナトリウムの漏洩を防止し、持続性の水疱性網膜剥離を達成することができます眼圧、とされます。

図2。網膜剥離の時間経過。この眼底写真は手術直後網膜下出血のない水疱性網膜剥離を示しています。少なくとも14日目を通して網膜下出血のないヘマトキシリン​​·エオジン（HE）染色を示し、永続水疱性網膜剥離と凍結切片。

Discussion

げっ歯類の目には、RDモデルを確立するためのいくつかの方法が^{3月15日、22を}報告されている。それは一般的に、ヒトにおける眼内手術中に使用される粘性物質であり、それは、任意の公知の眼毒性^1-15に関連付けられていないため、それらのほとんどは、ヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注射を利用する。むしろ生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）よりもヒアルロン酸ナトリウムは、RDの持続時間を増加させる。

transvitrealアプローチ^3-6または経強膜アプローチ^7月15日 ：ヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注入のための方法には、2つのアプローチのいずれかを使用します。どちらの方法も、眼底の観察を用いて実施する。 transvitrealアプローチでは、網膜下注入器は、網膜切開が周辺網膜に作成され、硝子体腔に導入され、ヒアルロン酸ナトリウムは、網膜下腔に注入される。この方法では、2つの網膜裂傷、網膜の危険性を増大させる、製造される網膜下腔に入るかもしれませリットル出血。また、網膜切開が作成され、レンズ損傷の危険性がある。経強膜アプローチにはいくつか修正された方法があります。これらの方法^7-12のほとんどにおいては、前房の穿刺を有する眼内圧を減少させた後、ヒアルロン酸ナトリウムを充填したシリンジに接続された30 G針が直接結膜、強膜、脈絡膜およびRPEを介して網膜下腔に挿入される。ヒアルロン酸ナトリウムは、その後、網膜下腔に注入される。この経強膜法を用いて網膜裂傷、レンズ損傷の危険性がtransvitrealアプローチを用いるよりも小さい。しかしながら、30 G針によって強膜に形成された孔は、特にマウスの眼のために、大きく、網膜下腔に注入ヒアルロン酸ナトリウムを容易に強膜を介して眼の創傷漏出。これが低いほど、より少ない永続RDおよび複数の可変光受容体細胞死につながる。また、脈絡膜出血が発生した場合眼圧の前網膜下ヒアルロン酸注射に還元されているので、強膜穿孔工程は、出血は、網膜下の空間に広がる。

いくつかの因子が網膜下出血および高さとRD ^16-21の永続性の両方を含む、網膜剥離でRDの効果に影響を与えることができる。増加のRD ^16、17の高さ、視細胞障害を持つ光受容体細胞死が増加しているため、酸素と浅いRDに比べて高いRDと脈絡から必須栄養素の減少拡散のより広範な場合があります。網膜下出血も、視細胞^18〜21のために有毒である。網膜剥離は、この毒性の可能性のあるメカニズムは、低酸素症および網膜下出血による代謝混乱拡散障壁として、および（鉄など）の血液成分によって誘発される直接的な神経毒性が含まれています。をretiに対する保護効果を有することが報告されているレンズの損傷、内部神経節細胞^23は 、また、RDの誘導後に感光体細胞死に影響を及ぼし得る。入口創傷部位が密封されていない場合も、ヒアルロン酸ナトリウムは、除核の間に眼の操作に漏れることができる。これは、次に、結果の解釈に影響を与え得る、浅いRDの誤分類につながり得る。

我々のRDの再現性を高め、網膜下出血の速度を減少させるためにヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注射用経強方法を変更した。このプロトコルの重要なステップは、注射後ヒアルロン酸ナトリウムの漏れを防止する30 G針を使用して、自己シール強膜切開を作成している。大きな関心が強膜創傷に支払われるように、従来の方法とは異なり、このプロトコルは、眼底の観察なしに実行される。接着剤の適用はまた、眼から漏れるのヒアルロン酸ナトリウムを防止する。我々の経験では、このプロトコルワットで、網膜下出血の割合他のプロトコルと比べて有意に少ない。脈絡膜出血が強膜切開ステップ中に発生した場合は、このステップは、眼圧を低下させる前に行われるので、強膜創を通して眼が終了します。脈絡膜出血が眼圧および感覚神経網膜剥離の還元後に発生した場合、血液が網膜下腔に解剖します。これは他の技術と約10〜20％とは対照的に、症例の約5％で起こることがわかった。これらの動物は、分析から除外されるべきである。

この技術は、光受容体またはRPE細胞^24を標的とするベクター媒介遺伝子導入^、25の網膜下注射のために使用することができる。これらの注入のための典型的な媒体（PBS、生理食塩水）、ヒアルロン酸ナトリウムよりも大幅に低粘度であるため、標準的な技術は、より多くのリークに悩まされている。本明細書に記載の技術は、このリスクを低減することにより、ベクター導入実験は、より再現性のあることができる信頼できる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketaject	Phoenix	2010025
AnaSed	LLOYD	4004821
5% Phenylephrine / 0.5% Tropicamide	Massachusetts Eye and Ear Pharmacy
0.5% Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution	AKORN	17478-263-12
Provics	Alcon	8065183085
Webglue	Patterson Veterinary	07-8566128
Microscope	Leica	MG90
30G1/2 PrecisionGlide Needle	BD	305106
Weck-Cel Eye Spears	Beaver-Visitec	0008685
10 Microliter Syringe	Hamilton	7635-01
33 gauge, 0.5 inch needle	Hamilton	7803-05
18x18mm Cover Glass	Fisher Scientific	18-548A