ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Opprette eksperimentelle retinal avdelinger med en reproduserbar og vedvarende høyde på løsrivelse, og uten subretinal blødning, er viktig for å studere patofysiologien av fotoreseptoren celle tap i netthinnesykdommer og evaluere potensielle terapeutiske intervensjoner. Her rapporterer vi en slik metode i detalj.
Abstract
Subretinal injeksjon av natriumhyaluronat er en bredt akseptert metode for å indusere netthinneavløsning (RD). Imidlertid kan høyden og varigheten av RD eller forekomst av subretinal hemorrhage påvirke fotoreseptoren celledød i den frittliggende netthinnen. Derfor er det fordelaktig å lage reproduserbare RDS uten subretinal blødning for evaluering av fotoreseptoren celledød. Vi endret en tidligere rapportert metode for å skape bulløs og vedvarende RDS i en reproduserbar beliggenhet med sjelden forekomst av subretinal blødning. Det kritiske trinnet i denne modifiserte fremgangsmåte er å skape en selvlukkende skleral innsnitt, noe som kan hindre lekkasje av natriumhyaluronat etter injeksjon inn i subretinal plass. For å gjøre det selvtettende scleral innsnitt, en scleral tunnel er opprettet, fulgt av scleral inntrengning i årehinnen med en 30 G nål. Selv choroidal blødning kan oppstå i løpet av dette trinnet, astriction med en kirurgisk spyd reduserer frekvensen av koroidal hemorrhage. Denne metoden gir en mer reproduserbar og pålitelig modell av fotoreseptoren død i sykdommer som involverer RD som rhegmatogen RD, prematuritetsretinopati, diabetisk retinopati, sentral serøs chorioretinopati, og aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD).
Introduction
Fotoreseptoren celledød og påfølgende visuell nedgang oppstår når fotoreseptorene er atskilt fra den underliggende retinal pigment epitel. Fysisk atskillelse av fotoreseptorene er sett i ulike retinal lidelser, inkludert aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), sentral serøs chorioretinopati, diabetisk retinopati, og retinopati hos premature, samt rhegmatogen (dvs. forårsaket av et brudd i netthinnen) netthinneavløsning ( RD). Subretinal injeksjon av natriumhyaluronat er en allment akseptert modell for å skape en RD som fører til fotoreseptoren celledød, og gir innsikt i patofysiologien av fotoreseptoren degenerasjon 1-15.
Fotoreseptor degenerasjon indusert av subretinal natriumhyaluronat injeksjon, først introdusert i 2001 7, har fordelen av en rimelig tid kurs (dager til uker). Men det kan ha betydelig variasjon av fotoreseptoren celle tap fra dyr til animal på grunn av to viktige faktorer som påvirker fotoreseptoren celledød etter RD: 1) høyde og varighet av RD, og 2) forekomsten av subretinal blødning. Det er en bratt teknisk lærekurve til den metode som bidrar til begge faktorer. Fotoreseptoren celle degenerasjon øker med høyden på RD, som avstanden mellom retinal pigment epitel (RPE) lag og fotoreseptorer øker 16-17. I samsvar med disse rapportene, våre tidligere eksperimenter viste mer fotoreseptor død i bulløse RDS enn grunne RDS. Det har også blitt rapportert at subretinal blødning er giftig for fotoreseptoren celler og påvirker fotoreseptoren celledød 18-21. Likeledes har vi observert flere fotoreseptoren død RDS med subretinal blødning enn RDS uten subretinal blødning. Derfor, teknikker for å minimere variabilitet må fokusere på å oppnå konsistente høyder av RD samtidig unngå subretinal blødning.
Vår modifisert metode for inducing RD kan gjøre reproduserbar bulløs og vedvarende RD på samme posisjon i øyet med sjelden forekomst av subretinal blødning. Vi utførte operasjon ved hjelp av en tidsmessig metode fordi det er lettere å oppnå et bredere operative feltet i forhold til andre områder. Etter konjunktivalsekken innsnitt, er en selvtettende skleral innsnitt gjort ved hjelp av en 30 G nål. En skleral tunnel er opprettet, etterfulgt av skleral inntrengning i choroid. Hvis choroidal blødning oppstår i dette trinnet, vil blødningen avslutte øyet gjennom scleralområdet såret, og blødningen kan stoppes ved astriction med en kirurgisk spyd. En fremre kammer punktering utføres deretter fra hornhinnen til å redusere intraokulært trykk. Dette er et viktig skritt fordi subretinal injeksjon alene vil føre til økt intraokulært trykk med resulterende retinal arterie okklusjon og iskemi i indre netthinnen. A 33 G nål koblet til en Hamilton 10 mL sprøyte og deretter settes inn i subretinal plass, og 3,5 μ; L natriumhyaluronat forsiktig injisert for å løsne den nevronetthinnen fra den underliggende RPE. I motsetning til andre metoder for å fremkalle RD som er utført i henhold til fundus observasjon, er denne teknikken utføres under direkte observasjon. Siden skleralt såret er selvtettende, vil natriumhyaluronat ikke lekke ut etter injeksjon. Til slutt, er limet satt på scleralområdet såret, og conjunctiva monteres igjen til sin opprinnelige posisjon. Disse varer måten også redusere risikoen for natriumhyaluronat lekkasje. Injeksjon av 3,5 mL natriumhyaluronat skaper reproduserbare RDS (50% av netthinnen) i øynene til åtte uker gamle mus. Opprette det selvtettende sår er det viktigste steget i vår endret prosedyren fordi det hindrer den injiserte natriumhyaluronat lekker ut av øyet, og dermed gir reproduserbar bulløs og vedvarende RDS.
Protocol
Alle eksperimenter på dyr ble utført i henhold til Association for Research in Visjon og Ophthalmology Erklæring for bruk av dyr i Ophthalmic and Vision Research, og de retningslinjer og bestemmelser fastsatt av Massachusetts Eye and Ear Infirmary Animal Care Committee.
En. Forbehandling
- Anesthetize en 8 uker gamle mus med en intraperitoneal injeksjon av en blanding av 60 mg / kg ketamin og 6 mg / kg xylazin.
- Skjær værhår. Dette er gjort fordi de forstyrrer visualisering og instrument plassering.
- Strekke eleven med 5% fenylefrin og 0,5% Tropikamid.
- Kutt flimmerhårene. Dette er også gjort fordi de forstyrrer visualisering og instrument plassering.
- Påfør aktuell anestesi (0,5% proparacaine hydroklorid øyedråper).
2. Kirurgi under mikroskopet
- Sett musen i en lateral position med nesen mot kirurgen. En tå klype er utført for å bekrefte kirurgisk anestesi, og sterile hansker er tatt på før du starter operasjonen.
- Incise tinning konjunktiva på bakre limbus og skille konjunktiva fra sclera. Unngå å trenge inn i sclera. Etter dette trinnet, ta tak i conjunctiva ved limbus med tang for å kontrollere øyet.
- Lag en selvtett scleral snitt med tuppen av en 30 G nål med skråkant pekte opp. Gjør en skleral tunnel gjennom sklera og trenge gjennom sklera i choroid (figur 1). Unngå å trenge inn i netthinnen. Hvis choroidal blødning oppstår og kommer ut gjennom scleralområdet såret, utføre en astriction med et kirurgisk spyd før blødningen stopper. Denne skleral såret vil være selv-forseglet med intraokulært trykk.
- Punkter hornhinnen med en 30 G nål for å redusere intraokulært trykk. Bruk nålen parallelt med iris for å unngå å skade iris og linsen under enForsřk inn i fremre kammer. Det intraokulære trykk vil føre til at såret for å selv-tetning.
- Sett en 33 G nål koblet til en Hamilton 10 mL sprøyte inn i subretinal plass med skråkant pekte nedover (mot indre øye), og injisere 3,5 mL natriumhyaluronat forsiktig for å løsne den nevronetthinnen fra den underliggende RPE. Unngå å trenge inn i netthinnen med 33 G nål fordi natriumhyaluronat vil gå inn i glasslegemet plass, men ikke den subretinal plass hvis netthinnen blir penetrert. Også unngå rask injeksjon fordi det vil skape en muntlig tåre, og natriumhyaluronat vil lekke inn i fremre kammer.
- La den vandige humor strømme ut fra det corneale punktering ved å skyve hornhinnen rundt hornhinnen punktering med pinsett for å justere det intraokulære trykk.
- Bekreft fravær av lekkasje fra scleralområdet såret ved et kirurgisk spyd.
- For å redusere risikoen for natriumhyaluronat lekkasje, plasserer cyanoakrylat kirurgisk lim påden skleral såret.
- Sett på conjunctiva til sin opprinnelige posisjon ved hjelp cyanoacrylate kirurgisk lim. Dette vil ytterligere redusere risikoen for natriumhyaluronat lekkasje.
- Sjekk fundus ved hjelp av en cover glass og bekrefte opprettelsen av en bulløs RD uten subretinal blødning.
Tre. Etter behandling
- Påfør bacitracin antibiotisk salve for øyet å redusere risikoen for infeksjon.
- Hold musene på en varmepute for å hindre at anestesi (blanding av ketamin og xylazin) fra forårsaker lav kroppstemperatur etter at lavt blodtrykk.
- Sett musene tilbake til dyr bur etter at de våkne fra anestesi. Overvåke mus daglig for komplikasjoner. Hvis noen komplikasjoner oppstår, avlive mus som beskrevet nedenfor.
4. Sacrifice
- Avlive musene ved cervical dislokasjon etter intraperitoneal injeksjon av 100 mg / kg natrium-pentobarbital, og enucleate øynene på passende tidspunkter for hvert forsøk (ikke vist). Unngå trykk på øyet under enucleation fordi natriumhyaluronat kan lekke ut. Bulløse RDS bør være vedvarende i minst 14 dager.
Representative Results
For å vurdere persistens av RD gjort av denne protokollen, ble cryosections gjort på dag 3, 7 og 14 etter induksjon av RD. Seks øyne ble brukt for hvert tidspunkt. Hematoxylin og eosin (HE) farging ble brukt for å visualisere de seksjoner. Alle seksjonene viste en bulløs RD nærmer linsen (figur 2). Det ene øyet viste subretinal blødning på dag 7. Ingen øyne viste noen tegn på infeksjon eller linseskader.
Figur 1. Oppretting av en selvtettende skleral innsnitt. Denne skjematisk viser et tverrsnitt-bilde av en normal mus øyet. Rød linje viser den selvtett scleral snitt. En skleral tunnel fulgt av skleral inntrengning i choroid med en 30 G nål skaper en selvtettende skleral innsnitt. Dette scleral såretvil være selvtettende med det intraokulære trykk, noe som kan hindre lekkasje av natriumhyaluronat etter injeksjon i subretinal plass og oppnå vedvarende bulløse retinal avdelinger.
Figur 2. Tidsforløpet for netthinneavløsning. Denne fundus bilde viser en bulløs netthinneavløsning uten subretinal blødning umiddelbart etter operasjonen. Cryosections med hematoxylin og eosin (HE) flekker viser vedvarende bulløse netthinneavløsning uten subretinal blødning gjennom minst dag 14.
Discussion
Flere fremgangsmåter for å etablere en modell RD i gnagere øyne er rapportert 3-15, 22.. De fleste av dem utnytte subretinal injeksjon av natrium-hyaluronat, fordi det er et viskøst materiale som vanligvis anvendes i løpet av intraokulær kirurgi hos mennesker, og det er ikke forbundet med noen kjent okulær toksisitet 1-15. Natriumhyaluronat, snarere enn normalt saltvann eller fosfat-bufret saltvann (PBS), øker varigheten av RD.
Metodene for subretinal injeksjon av natriumhyaluronat bruke en av to tilnærminger: en transvitreal tilnærming 3-6 eller en transscleral tilnærming 7-15. Begge metodene er utført med observasjon av fundus. I transvitreal tilnærmingen blir en subretinal injektor føres inn i glasslegemet, en retinotomy er opprettet i den perifere retina, og natriumhyaluronat er injisert inn i subretinal plass. I denne metoden, er to retinal tårer gjort, noe som øker risikoen for retinal blødning som kan gå inn i subretinal plass. I tillegg er det en risiko for skade linsen når retinotomy opprettes. Det er flere modifiserte fremgangsmåter for transscleral tilnærming. I de fleste av disse metodene 7-12, etter å ha redusert intraokulært trykk med en fremre kammer punktering, en 30 G nål koblet til en sprøyte fylt med natriumhyaluronat er direkte inn i subretinal plass gjennom konjunktiva, sclera, årehinnen, og RPE. Den natriumhyaluronat blir deretter injisert i subretinal plass. Risikoen for retinal tåre-og linseskade ved hjelp av denne transscleral metoden er mindre enn den ved hjelp av transvitreal tilnærming. Imidlertid er det hull laget i sclera ved en 30 G nål stor, spesielt for mus øyne, og natriumhyaluronat injiseres i subretinal plass lett lekker ut av øyet gjennom skleral såret. Dette fører til en lavere, mindre vedvarende RD, og mer variable fotoreseptor celledød. Videre, hvis koroidal blødningen forekommer iden skleral perforering trinnet, vil den spre seg blødning inn i den subretinal plass fordi det intraokulære trykket er redusert før subretinal hyaluronat injeksjon.
Flere faktorer kan påvirke effekten av RD på frittliggende netthinnen, inkludert både subretinal blødning og høyde og utholdenhet av RD 16-21. Fotoreseptoren celledød øker med økende høyde av RD 16, 17, og fotoreseptoren celleskade kan være større på grunn av redusert diffusjon av oksygen og essensielle næringsstoffer fra choriocapillaris med høyere RD forhold til grunne RD. Subretinal blødning er også toksiske for fotoreseptorcellene 18-21; mulige mekanismer av denne toksisitet i det frittliggende netthinnen omfatter hypoksi og metabolske forstyrrelser ved subretinal blødning som en diffusjonsbarriere, og direkte neurotoksisitet fremkalt av blodkomponenter (for eksempel jern). Linse skader, som har blitt rapportert å ha en beskyttende effekt på retinale ganglieceller 23, kan også påvirke fotoreseptoren celledød etter induksjon av RD. I tillegg, hvis oppføringen sårstedet ikke er forseglet, kan natriumhyaluronat lekke ut med øye manipulasjon under enucleation. Dette kan føre til feilklassifisering av en RD så grunt, noe som igjen kan påvirke tolkningen av resultatene.
Vi modifisert transscleral fremgangsmåte for subretinal injeksjon av natrium-hyaluronat for å øke reproduserbarheten av RDS og redusere frekvensen av subretinal blødning. Det kritiske trinnet i denne protokollen er å skape en selvlukkende skleral innsnitt ved hjelp av en 30 G nål, som hindrer lekkasje av natriumhyaluronat etter injeksjon. I motsetning til tidligere metoder, er denne protokollen utføres uten observasjon av fundus så større oppmerksomhet rettes mot scleralområdet såret. Påføring av lim hindrer også natriumhyaluronat fra å lekke ut av øyet. I vår erfaring, frekvensen av subretinal blødning med denne protokollen wså betydelig mindre enn den til andre protokoller. Hvis koroidal blødning oppstår under skleral innsnitt trinnet, vil den gå ut av øyet gjennom skleral såret på grunn av dette trinnet utføres før reduksjon av intraokulært trykk. Hvis koroidal blødning forekommer etter reduksjon av det intraokulære trykk og løsgjøring av nevrohinnen, vil blod dissekere inn i subretinal plass. Vi fant at dette skal skje i ca 5% av tilfellene i motsetning til ca 10-20% med andre teknikker. Disse dyrene bør utelukkes fra analysen.
Denne teknikken kan også brukes til subretinal injeksjon av vektor-mediert genoverføring for å målrette fotoreseptoren eller RPE celler 24, 25. Fordi det typiske kjøretøy (PBS, saltløsning) for disse injeksjonene er vesentlig mindre viskøs enn natriumhyaluronat, er standard teknikker plaget av flere lekkasjer. Den teknikk som her er beskrevet, ved å redusere denne risikoen, som gjør vektoren overføringseksperimenter mer reproduserbar ogpålitelig.
Disclosures
The Massachusetts Eye and Ear Infirmary har en eierandel i tre amerikanske patenter rettet mot bruk av verteporfins. I tillegg har Massachusetts Eye and Ear Infirmary eierandel i visse patentsøknader rettet til selektiv ødeleggelse av subretinal koroidal neovaskulatur for behandling av makuladegenerasjon og andre lidelser. The Massachusetts Eye and Ear Infirmary mottar royalties som et resultat av disse patenter og patentsøknader og Dr. Miller får en andel av det samme i samsvar med Massachusetts Eye and Ear Infirmary institusjonelle Patent retningslinjer og prosedyrer, som inkluderer royalty-deling bestemmelser. Forfatteren, Dr. Joan W. Miller, er en tidligere styremedlem og tidligere aksjonær i Alcon, Inc., og for tiden fungerer som en konsulent for Alcon; Imagen Biotech, Inc., ISIS Pharmaceuticals, Kalvista Pharmaceuticals, Regeneron Pharmaceuticals, Inc og onl Therapeutics, LLC. Dr. Demetrios G. Vavvas serverersom konsulent for Roche, Genentech, Kala Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Vi takker Wendy Chao for hennes støtte i kritisk gjennomgang. Dette arbeidet ble støttet av Bausch & Lomb vitreoretinal Fellowship (HM), National Eye Institute stipend EY014104 (JWM), Forskning for å hindre blindhet Foundation (DGV), Lions Eye Research Fund (DGV), og en sjenerøs donasjon av Yeatts familien (JWM og DGV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaject | Phoenix | 2010025 | |
| AnaSed | LLOYD | 4004821 | |
| 5% Phenylephrine / 0.5% Tropicamide | Massachusetts Eye and Ear Pharmacy | ||
| 0.5% Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution | AKORN | 17478-263-12 | |
| Provics | Alcon | 8065183085 | |
| Webglue | Patterson Veterinary | 07-8566128 | |
| Microscope | Leica | MG90 | |
| 30G1/2 PrecisionGlide Needle | BD | 305106 | |
| Weck-Cel Eye Spears | Beaver-Visitec | 0008685 | |
| 10 Microliter Syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 33 gauge, 0.5 inch needle | Hamilton | 7803-05 | |
| 18x18mm Cover Glass | Fisher Scientific | 18-548A |
References
- Anderson, D. H., Guerin, C. J., Erickson, P. A., Stern, W. H., Fisher, S. K.
- Cook, B., Lewis, G. P., Fisher, S. K., Adler, R. Apoptotic photoreceptor degeneration in experimental retinal detachment. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36, 990-996 (1995).
- Zacks, D. N., et al. Caspase Activation in an Experimental Model of Retinal Detachment. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 1262-1267 (2003).
- Zacks, D. N., Han, Y., Zeng, Y., Swaroop, A. Activation of Signaling Pathways and Stress-Response Genes in an Experimental Model of Retinal Detachment. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 1691-1695 (2006).
- Nakazawa, T., et al. Characterization of cytokine responses to retinal detachment in rats. Mol. Vis. 12, 867-878 (2006).
- Nakazawa, T., et al. Tumor Necrosis Factor-Mediates Photoreceptor Death in a Rodent Model of Retinal Detachment. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1384-1391 (2011).
- Hisatomi, T., et al. Relocalization of apoptosis-inducing factor in photoreceptor apoptosis induced by retinal detachment in vivo. Am. J. Pathol. 158, 1271-1278 (2001).
- Hisatomi, T., et al. Critical role of photoreceptor apoptosis in functional damage after retinal detachment. Curr. Eye Res. 24, 161-172 (2002).
- Nakazawa, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. 104, 2425-2430 (2007).
- Trichonas, G., et al. Receptor interacting protein kinases mediate retinal detachment-induced photoreceptor necrosis and compensate for inhibition of apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 21695-21700 (2010).
- Roh, M. I., Murakami, Y., Thanos, A., Vavvas, D. G., Miller, J. W. Edaravone, an ROS Scavenger, Ameliorates Photoreceptor Cell Death after Experimental Retinal Detachment. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3825-3831 (2011).
- Mantopoulos, D., et al. Tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) protects photoreceptors from cell death after experimental retinal detachment. PLoS One. 6, e24245 (2011).
- Yang, L., Bula, D., Arroyo, J. G., Chen, D. F. Preventing retinal detachment-associated photoreceptor cell loss in Bax-deficient mice. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 648-654 (2004).
- Cebulla, C. M., Ruggeri, M., Murray, T. G., Feuer, W. J., Hernandez, E. Spectral domain optical coherence tomography in a murine retinal detachment model. Exp. Eye Res. 90, 521-527 (2010).
- Secondi, R., Kong, J., Blonska, A. M., Staurenghi, G., Sparrow, J. R. Fundus Autofluorescence Findings in a Mouse Model of Retinal Detachment. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 5190-5197 (2012).
- Machemer, R. Experimental retinal detachment in the owl monkey. IV. The reattached retina. Am. J. Ophthalmol. 66, 1075-1091 (1968).
- Ross, W., Lavina, A., Russell, M., Maberley, D. The correlation between height of macular detachment and visual outcome in macula-off retinal detachments of < or = 7 days' duration. Ophthalmology. 112, 1213-1217 (2005).
- Glatt, H., Machemer, R.
- Toth, C. A., Morse, L. S., Hjelmeland, L. M., Landers, M. B. 3rd Fibrin directs early retinal damage after experimental subretinal hemorrhage. Arch. Ophthalmol. 109, 723-729 (1991).
- Benner, J. D., Hay, A., Landers, M. B. 3rd, Hjelmeland, L. M., Morse, L. S. Fibrinolytic-assisted removal of experimental subretinal hemorrhage within 7 days reduces outer retinal degeneration. Ophthalmology. , 101-672 (1994).
- Bhisitkul, R. B., et al. Neuroprotective effect of intravitreal triamcinolone acetonide against photoreceptor apoptosis in a rabbit model of subretinal hemorrhage. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 4071-4077 (2008).
- Zeng, R., Zhang, Y., Shi, F., Kong, F. A Novel Experimental Mouse Model of Retinal Detachment: Complete Functional and Histologic Recovery of the Retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 1685-1695 (2012).
- Leon, S., Yin, Y., Nguyen, J., Irwin, N., Benowitz, L. I. Lens injury stimulates axon regeneration in the mature rat optic nerve. J. Neurosci. 20, 4615-4626 (2000).
- Murakami, Y., et al. Inhibition of choroidal neovascularization via brief subretinal exposure to a newly developed lentiviral vector pseudotyped with Sendai viral envelope proteins. Hum. Gene Ther. 21, 199-209 (2010).
- Kong, F., et al. Self-complementary AAV5 vector facilitates quicker transgene expression in photoreceptor and retinal pigment epithelial cells of normal mouse. Exp. Eye Res. 90, 546-554 (2010).
Tags
Medisin fotoreseptorcellene Rodentia retinal degenerasjon Netthinneavløsning dyremodeller Neuroscience oftalmologi retina mus fotoreseptor celledød retinopati aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD)Erratum
Formal Correction: Erratum: Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate
Posted by JoVE Editors on 01/30/2014.
Citeable Link.
A correction was made to Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate. The footnotes were removed from the abstract due to redundancy in the introduction.
Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD)1-15. However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina16-21.
to:
Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina.
