视网膜脱离模型鼠害由透明质酸钠的视网膜下注射

Summary

创建实验性视网膜脱离与剥离的可重复性和持续的高度，没有视网膜下出血，是研究感光细胞损失的视网膜疾病的病理生理和评估潜在的治疗干预措施非常重要。在这里，我们报告中详细这样的方法。

Abstract

视网膜下注射透明质酸钠是一种被广泛接受的诱导视网膜脱离（RD）的方法。然而，RD或视网膜下出血的发生的高度和持续时间可以影响在视网膜脱离感光细胞死亡。因此，有利的是，创建可再现的RD无视网膜下出血，用于评估光感受器细胞死亡。我们修改了以前报道的方法在可重现的位置与视网膜下出血很少发生大疱性创造和持续的RD。这种改性方法的关键步骤是建立一个自密封巩膜切口，注射后，可以防止透明质酸钠渗漏到视网膜下腔。使自密封巩膜切口，将创建一个巩膜隧道，随后巩膜渗透到带30号针头的脉络膜。虽然在这一步可能会出现脉络膜上腔出血，便秘有手术矛减少脉络膜下摆率orrhage。此方法允许感光死亡涉及RD如孔源性RD，早产，糖尿病视网膜病变，中心性浆液性脉络膜视网膜病变，与年龄相关的黄斑变性（AMD）的视网膜病变疾病的更可重复的，可靠的模型。

Introduction

当光感受器是从底层视网膜色素上皮分离感光细胞死亡和随后的视觉衰退发生。感光体的物理分离被认为是在各种视网膜疾病，包括年龄相关性黄斑变性（AMD），中心性浆液性脉络膜视网膜病变，糖尿病性视网膜病和早产儿视网膜病，以及孔源性（ 即所引起的视网膜休息）视网膜脱离（ RD）。视网膜下注射透明质酸钠是一种被广泛接受的模型来建立，导致光感受器细胞死亡，提供洞察光感受器变性^1-15的病理生理的路。

感光细胞损伤视网膜下注射透明质酸钠，先于2001年⁷引入，有一个合理的时间过程的优势（几天到几周）。但是，它可以具有从动物感光细胞的损失灵魂的显著变异升由于影响RD后的感光细胞死亡两个主要因素：1）高度和RD的持续时间，和视网膜下出血的2）的发生。有一个陡峭的技术学习曲线，有助于这两个因素的方法。感光细胞的变性的增加与RD的高度，如视网膜色素上皮之间的距离（RPE）层和光感受器增加^16-17。根据这些报告，我们以前的实验中表现出更多的光感受器的死亡大疱的RD比浅的RD。还已经报道，视网膜下出血为感光细胞毒性和影响感光细胞死亡^18-21。同样，我们观察到更多的光感受器死亡的RD与视网膜下出血的RD比无视网膜下出血。因此，技术，以减少可变性必须专注于实现的RD一致的高度，同时避免视网膜下出血。

我们修改后的方法ducing RD能在眼睛视网膜下出血很少发生的同一位置使重现性大疱性和持续性研发。我们使用的时间的方法，因为它更容易实现更宽的手术视野与其他位点相比，进行手术。后的结膜切口，自密封巩膜切口是用30号针头进行。巩膜隧道创建，其次是巩膜渗透到脉络膜。如果在此步骤中脉络膜出血，出血将退出眼穿过巩膜创口和出血可以通过便秘停止用外科矛。然后，从角膜进行前房穿刺降低眼压。这是一个重要的步骤，因为视网膜下注射单独将导致与所得视网膜动脉阻塞和视网膜内层缺血眼压增高。 A 33号针头连接到汉密尔顿10微升注射器，然后插入到视网膜下腔，和3.5μ，L透明质酸钠注射轻轻分离从底层的视网膜色素上皮视网膜神经上皮层。相反，且根据眼底观察进行诱导道的其他方法，在直接观察下进行该工艺。由于巩膜创口是自密封，透明质酸钠不会在注射后会泄漏出来。最后，胶被置于巩膜的伤口，和结膜被重新附到原来的位置。这些持续时间的步骤也降低透明质酸钠泄漏的风险。 3.5微升透明质酸钠注射液在8周龄的小鼠眼睛造成重现性的RDS（视网膜的50％）。在创建自密封的伤口是在我们的改性过程中最重要的步骤，因为它可以防止注入透明质酸钠泄漏出的眼睛，从而使可重复的大泡性和持久性的RD。

Protocol

在所有动物实验均按照研究协会在视觉与眼科声明在眼科和视觉研究中使用动物进行的，而准则和条例规定由马萨诸塞州眼耳医院动物保健委员会。

1。预处理

1. 麻醉8周龄小鼠腹腔注射60毫克的混合物/公斤氯胺酮和6毫克/公斤甲苯噻嗪。
2. 剪下胡须。这样做是因为他们具有可视化和器械放置造成干扰。
3. 瞳孔扩张，用5％去氧肾上腺素和0.5％托吡卡胺。
4. 切纤毛。这也是做是因为他们具有可视化和仪器放置干扰。
5. 应用局部麻醉（0.5％盐酸丙美卡因滴眼液）。

2。手术在显微镜下

1. 设置鼠标在横向POS银行足球比赛用鼻子向外科医生。脚趾捏进行确认手术麻醉，无菌手套前，手术开始穿上。
2. 切开颞结膜在后缘和从巩膜分离结膜。避免穿透巩膜。经过这一步，把握结膜角膜缘用钳子来控制眼球。
3. 使用30号针头的斜面的顶端自密封巩膜切口朝上。使巩膜隧道穿过巩膜和穿透巩膜进入脉络膜（ 图1）。避免穿透视网膜。如果发生脉络膜出血，并配备了经过巩膜伤口，执行便秘的外科长矛，直到出血停止。这巩膜伤口会自我封闭与眼压。
4. 穿破角膜与30号针头，以降低眼压。使用并行针虹膜避免Ë期间伤及虹膜和晶状体n请进入前房。眼内压会导致伤口自密封。
5. 插入33号针头连接到汉密尔顿10微升注射器进入视网膜下的空间与锥朝下（朝向内眼），并轻轻地注入3.5微升的透明质酸钠来从基础RPE脱离的感觉神经视网膜。避免穿透视网膜用33号针头，因为透明质酸钠将进入玻璃体空间，但不是视网膜下腔，如果视网膜被击穿。此外，避免快速注射，因为它会创建一个口头撕裂，和透明质酸钠会泄漏进入前房。
6. 让水状液从角膜穿刺流出通过按压角膜周围的角膜穿刺用钳子来调节眼压。
7. 采用外科矛确认从巩膜伤口没有泄漏。
8. 以降低透明质酸钠泄漏的危险，放置于氰基丙烯酸酯手术胶水巩膜伤口。
9. 重新将结膜使用氰基丙烯酸酯胶手术原来的位置。这将进一步降低透明质酸钠泄漏的风险。
10. 用玻璃盖检查眼底，并确认创建一个大疱性路无视网膜下出血。

3。治疗后

1. 适用杆菌肽抗生素软膏的眼睛，以减少感染的风险。
2. 继续加热垫的鼠标，以防止麻醉（氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物）造成低体温随后低血压。
3. 把老鼠回动物笼，他们从麻醉醒来后。监控每日的老鼠并发症。如果发生任何并发症出现，安乐死如下所述的小鼠。

4。牺牲

1. 腹腔注射100毫克后颈椎脱位安乐死小鼠/公斤戊巴比妥钠和enuclea忒眼睛在每个实验的适当的时间点（未示出）。避免眼球摘除期间应用对眼睛的压力，因为透明质酸钠可能会泄漏出来。大疱性类的RD应至少14天是持久的。

Representative Results

为了评估本协议作出的RD的持久性，冷冻切片上3天，7制成，和14诱导的RD后。六只眼睛被用于每个时间点。苏木精伊红（HE）染色用于可视化的部分。所有部分呈大疱性RD接近镜头（ 图2）。一只眼睛显示对7天的视网膜下出血。没有眼中流露出感染或晶状体损伤的迹象。

图1。创建一个自密封巩膜切口，这示意性示出了一个正常的小鼠眼睛的剖面图像。红线表示自密封巩膜切口。巩膜隧道后巩膜渗透到了30号针头脉络膜创建一个自封闭巩膜切口。这巩膜伤口将是自密封的眼内压，注射后，可以防止透明质酸钠泄漏进入视网膜下的空间，并实现持久大疱性视网膜脱离。

图2。视网膜脱离的时间过程。这照片眼底手术后立即显示无视网膜下出血的一个大泡性视网膜脱离。冰冻切片用苏木精和伊红（HE）染色显示持续性大疱性视网膜通过至少14天没有脱离视网膜下出血。

Discussion

几种方法在啮齿动物的眼睛建立了RD模式已报告^3-15，22。其中大多数是利用视网膜下注射透明质酸钠，因为它是在人类中的眼内手术中常用的粘性材料，并且它不与任何已知的眼毒性^1-15相关联。透明质酸钠，而不是生理盐水或磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，增大了道的持续时间。

该方法为视网膜下注射透明质酸钠使用以下两种方法之一：transvitreal方法^3-6或巩膜途径^7-15。这两种方法都具有观察眼底的执行。在transvitreal方法中，视网膜下喷射器导入玻璃体腔，视网膜切开一个设置在周边视网膜创建的，而透明质酸钠注射到视网膜下腔。在该方法中，2视网膜裂孔制成，这增加了视网膜的风险升出血可能进入视网膜下腔。此外，还有透镜损伤的创建视网膜切开时的危险。有用于经巩膜方法几种改性的方法。在大多数这些方法^7-12，降低眼内压与前房穿刺，一个30号针头连接到填充有透明质酸钠的注射器直接通过结膜，巩膜，脉络膜，视网膜色素上皮和插入到视网膜下腔后。透明质酸钠，然后注入到视网膜下腔。使用这种方法经巩膜视网膜撕裂和透镜损伤的风险小于使用transvitreal方法。然而，通过一个30号针头制成在巩膜的孔大，尤其是对小鼠的眼睛，和透明质酸钠注射到视网膜下腔容易漏出的眼睛透过巩膜创口。这导致较低的，更少持久RD和多个可变光感受器细胞死亡。此外，如果脉络膜出血发生在巩膜穿孔工序中，出血会蔓延到视网膜下的空间，因为在眼内压力已降低视网膜下注射透明质酸之前。

几种因素可以影响RD的作用，对视网膜脱落，包括视网膜下出血，高度和RD ^16-21的持久性。与RD ^16，17的高度增加，并视细胞损伤光感受器细胞死亡的增加可能是更广泛的，因为氧气和从具有较高RD相比浅RD脉络膜必需的营养物质的还原扩散。视网膜下出血也是感光细胞毒性^18-21;这种毒性在视网膜脱离的可能机制包括缺氧和通过视网膜下出血代谢受阻的扩散阻挡层，并直接神经毒性诱导的血液成分（如铁）。透镜损伤，已报道对视网膜的保护作用NAL神经节细胞^23，也可能诱导RD后会影响感光细胞死亡。此外，如果该条目伤口部位不密封，透明质酸钠可以摘除术中泄漏出与眼睛操纵。这可能会导致RD浅的误分类，进而可能影响结果的解释。

我们修改了经巩膜方法为视网膜下注射透明质酸钠，以提高该RDS的再现性和减少视网膜下出血率。此协议的关键步骤是创建使用30号针头，防止透明质酸钠泄漏注射后自密封巩膜切口。不同于以往的方式，执行不带观察眼底的这个协议，所以更加重视对巩膜伤口。胶应用还可以防止透明质酸钠泄漏出的眼睛。根据我们的经验，视网膜下出血与此协议瓦特率如显著小于与其它协议。如果在巩膜切口步骤发生脉络膜出血，它将退出眼睛穿过巩膜伤口，因为这一步是降低眼内压之前执行。如果脉络膜出血降低眼压和视网膜神经上皮层脱离后确实发生，血液会剖析到视网膜下腔。我们发现这发生在约5％的情况下在相反的约10-20％的其他技术。这些动物应该被排除在分析之外。

这种技术也可以用于视网膜下注射载体介导的基因转移到靶照相感光体或RPE细胞^24,25。因为典型的载体（PBS，生理盐水），这些注射是显著比透明质酸钠粘度较低，标准技术由更多泄漏的困扰。本文中所描述的技术中，通过降低这种风险，使得载体转移实验更具有可重复性和可靠。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketaject	Phoenix	2010025
AnaSed	LLOYD	4004821
5% Phenylephrine / 0.5% Tropicamide	Massachusetts Eye and Ear Pharmacy
0.5% Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution	AKORN	17478-263-12
Provics	Alcon	8065183085
Webglue	Patterson Veterinary	07-8566128
Microscope	Leica	MG90
30G1/2 PrecisionGlide Needle	BD	305106
Weck-Cel Eye Spears	Beaver-Visitec	0008685
10 Microliter Syringe	Hamilton	7635-01
33 gauge, 0.5 inch needle	Hamilton	7803-05
18x18mm Cover Glass	Fisher Scientific	18-548A