Summary
噬菌体展示是一种强大的技术，以捕获与感兴趣的固定化分子相互作用的蛋白质或蛋白质的部分。一旦噬菌体cDNA文库的类型来创建和屏幕的决定已经作出，这里所描述的协议允许高效亲和选择，导致识别干扰作用的。
Abstract
利用重组噬菌体作为支架提出了定向克隆cDNA文库中编码为固定诱饵分子的各种蛋白部分是一种有效的手段来发现相互作用。该技术已经在很大程度上被用于发现蛋白质 - 蛋白质相互作用，但诱饵分子受到挑战不必限于蛋白质。这里提出的协议进行了优化，允许重复进行筛选的诱饵数量适中，最大限度地独立克隆呈现相同的蛋白质的鉴定。这允许更大的信心，确定相互作用的蛋白质都是诱饵分子的合法干扰作用。监测噬菌体效价每亲和选择后轮提供了有关如何在亲和选择进展以及对阴性对照组的疗效信息。滴定噬菌体，以及如何的一种手段，什么要提前准备，使这一进程取得进展的效率，因为可能的话，呈现。检索以下的独立噬斑分离扩增子的属性被特别指出，可以用于确定如何很好的亲和选择进展。故障排除技术，以减少误报或绕过持续恢复的噬菌体进行了解释。减少病毒污染动火的方式进行了讨论。
Introduction
为什么使用，而不是用于发现和研究蛋白质相互作用与其他分子的无数其他技术噬菌体展示和亲和选择？噬菌体展示可以声称对检测蛋白质-配体相互作用1-3包括下列其他方法的一些独特的优势：
诱饵分子非常广泛的曲目
最重要的原因是能够充当诱饵的亲和选择4分子的多样性。噬菌体展示是一种非常强大的分离蛋白片段与其它蛋白，核苷酸，碳水化合物， 等等。5交互本质上说，如果聚合物/分子可以连接到一个可恢复的支持，它可以进行筛选，与噬菌体展示的蛋白质的亲和手段。此外，诱饵分子可被访问以确定它是否保留生物活性时固定6，如果使用对r的条件唤起/消除其活性是有效的6或，引入之前亲和选择的翻译后修饰的诱饵。
外在因素噬菌体抗性
第二个原因为使用噬菌体展示的是，它可能是一些诱饵可能需要环境应力（热，高浓度渗压剂，具体的辅因子， 等等 ）来捕捉其相互作用的蛋白质，或在噬菌体展示的蛋白质，可能需要以某种方式改变之前，亲和选择。正在研究中的主要因素是饲料和蛋白质，而不是允许的相互作用发生，或者如果它是致死的试验有机体的条件之间的相互作用。在T7噬菌体是特别适合这种研究，因为它可以承受恶劣的实验条件下既完整且可行的（ 例如已公布的最高温度为T7生存能力〜60℃7）。为改变噬菌体的例子显示亲teins，研究拟南芥种子蛋白质组的修复酶的蛋白质底物时，蛋白质异门冬氨酰甲基Transferease（PIMT），在这些研究中所使用的病毒已经“老化”一个星期之前，每个亲和选择轮，鼓励引进isoaspartate的（isoAsp）残基的蛋白质易感6，这是不可能的生物，可以识别并修复/这种代谢异常。
代谢惰性
此外，噬菌体通常是抗代谢毒物和干扰的小分子，将，至少，导致在代谢活性试验有机体多效性效应。继严格清洗，毒药被大量细菌被引入感染，因此毒稀释到一系列无害的细菌或噬菌体随后复制之前删除。在调查的PIMT修复蛋白靶酶，S-腺苷甲硫氨酸（转移酶的）被用来激活微滴定板孔的固定化酶以允许靶蛋白捕获同时依靠S-腺苷高半胱氨酸（AdoHcy）使酶失活，并提供了有用的阴性对照固定在该病毒不会受到任何一方转移酶的或AdoHcy 6影响的知识。此外，某些胚胎发育晚期丰富（LEA）的蛋白家族，研究了该实验室的成员，被称为改变其形状的添加剂如蔗糖8，可以在该点达到浓度高达200毫米的大豆种子的存在生理成熟9。该病毒是没有预料到可通过加入200mM的蔗糖在每个亲和选择圆形，可能需要一定的LEA-客户蛋白相互作用，这不是可行的自主测试生物体10的情况下的影响。
该实验室一直专注于discoverin克蛋白质-蛋白质相互作用中所依据存储的蛋白质保护的脱水11或维修所存储的蛋白质易受isoAsp形成，一旦种子已吸胀6的部件的过程的机理成熟，脱水或发芽的种子。因此，需要作为诱饵中的活动状态的重组蛋白的生产和纯化，并确保它们保持这样，它们被固定化之前和之后，虽然常常难，是一个基础，以我们的工作。然而，由于各重组蛋白生产的情况是不同的，为生产重组蛋白的条件优化这里将不讨论。用户务必尝试尽可能以确定固定的蛋白质仍是功能性（ 例如 ，如果它是一种酶，尽在微孔板酶测定法）。这将提供一些信心，诱饵是生物活性，因此，任何发现的相互作用有些更可能有生物相关性。
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Protocol
下面（ 图1）中描述的方法的图形描述突出使用噬菌体展示文库的两个主要组成部分为亲和选择：A）一种噬菌体展示文库很可能与蛋白质的诱饵亲和力编码和，B）的纯化的重组诱饵蛋白质。生产诱饵（重组蛋白）已被广泛研究和文献概述了从大肠杆菌可溶性安全，积极重组蛋白的最佳实践12-13 大肠杆菌 ，真核酵母14，昆虫15-16，17-18植物或哺乳动物细胞19-20比比皆是。
在下面的协议，一个hexahistidyl标签的重组蛋白已被用作诱饵。这允许核查，该诱饵蛋白留在孔中后过夜孵育和洗涤步骤。
1。酶联免疫吸附在微孔板重组蛋白保留
- 马克微孔板与永久性墨水，并指定哪些井将含有蛋白质的浓度。在井的3次重复执行此。包括3个重复的阴性对照浓度系列（非hexahistidyl标记蛋白; BSA的效果很好，因为这背景检查）。
- 用水充分冲洗板和拍打板4层之间清洗纸巾倒挂去除水。
- 固定，前3口井，在100μl的Tris，pH值7.5，（或者选择的缓冲液）的重组蛋白（10微克/毫升）的浓度最高。添加到下一个三口井的重组蛋白为（1.0微克/毫升）， 等等 ，下降到1.0纳克/毫升。与BSA的浓度系列做同样的。
- 盖菜用保鲜膜并留下过夜，4°C。
- 第二天早上，通过打孩子板上4-5层纸巾倒挂除去蛋白质。
- 洗井5倍，每次200μL1X TBS，留下缓冲在孔中，每次约1分钟，并通过拍打板在每次洗涤后的纸巾上下颠倒除去缓冲液洗涤。
- 阻断ELISA板使用200微升5％（重量/体积）牛血清白蛋白或200微升5％的旋转振荡器（重量/体积）封闭剂在TBS中在室温下处理2小时（或在4℃下坐在静止过夜，如果方便），包上保鲜膜。
- 通过打孩子平板上的纸巾倒挂去除多余的封闭液。每次洗4×1分钟，用200μl1X TBS的，由拍打板倒置除去洗涤溶液。
- 稀戊HIS第一抗体1/2，000在封闭缓冲液中，并提供100μl的各孔中。孵育1-2小时，在室温下用板固定。
- 通过打孩子平板上的纸巾倒挂取出一抗。每次用200微升1X TBST洗4倍1分钟。通过打孩子板倒置删除每次洗。
- 稀释的第二抗体（山羊抗小鼠碱性磷酸酶结合物），在封闭缓冲液中孵育100微升每孔1小时在室温下用板固定。
- 通过打孩子平板上的纸巾倒挂取出第二抗体。每次用200微升1X TBST洗4倍1分钟。通过打孩子板倒置删除每次洗。
- 把200μl的对硝基苯磷酸盐（pNPP的）底物溶液，在各孔中。基材是固体在-20℃，以便使等分试样，并检索必要的检测出来的冷冻的等分试样所需数量远远超过了时间，因此它完全是由这个阶段解冻。
- 在30分钟时停止通过加入50μl的3M NaOH中的每个孔中的反应。
- 读取405nm处的吸光度立即在ELISA平板阅读器。
注意：如果感兴趣的重组蛋白并不重视本身向孔，因此能够改变第缓冲电子组成/ pH值显着（碳酸盐缓冲液pH值10.0），或添加离液剂（尿素），以试图协助蛋白质附着在微孔板。然而，重新建立该重组蛋白：1）保持结合的亲和选择的条件下，在微量滴定板的孔中和，2）保留了其生物活性下面的除去高pH /离液剂的推荐。
2。用于滴定生长的细菌宿主（BLT5403）
- 高压釜（ 图2A）10 250ml锥形烧瓶中并培养3管。使LB液体和LB琼脂浇注固体介质板。凉爽的LB琼脂至50℃，并加入氨苄青霉素到前asceptically倒入培养皿中一个流罩（ 图2B），100微克/毫升。
- 此外，在一个流罩（ 图2B）条纹的LB，100微克/毫升氨苄青霉素（LB AMP100）琼脂平板上对库存单菌落BLT5403的保持在15％（体积/体积）甘油在-80℃（ 图2C）。在孵化器成长（ 图2D）将板倒置于37℃过夜。
- 在早晨，接种50毫升LB AMP100在250ml锥形烧瓶中以单菌落从平板中取出。在37℃，200rpm下在水平摇动器（ 图2E和2F），并使用分光光度仪监测细胞密度为OD 600 = 0.5至0.6（ 图2H）。
- 倾细胞到50ml Falcon管中，或相似的，并保持在4℃直至使用（ 图2G）。细胞通常会保持可行性〜1周。
- 制成500毫升LB培养基，将其放置在一个莫名其妙的费氏烧瓶中，高压灭菌它。一旦它是无菌的，放置在烧瓶中，在4℃（ 图2G）或室温下，直到下面的“第一天”的夜。
注意：主机的细菌细胞BLT5403，表达T7天然衣壳蛋白没有这种T7中，和低拷贝载体不能成功地复制的质粒携带的源，是非常容易感染病毒。当务之急是要避免污染。污染最终会出现在这一点上与病毒/细菌感染接触的所有表面必须擦拭，用70％（V / V）乙醇或使用洗涤剂（ 图2I）擦洗。如果这是无效的，能抵御Envirocide（ 图2J）所有表面进行彻底的消毒是必需的。开始BLT5403细胞冷冻股票每一轮新亲和选择，以帮助减轻股票的污染在4℃，并确保蓬勃细胞被在协议中使用。过滤屏障移液器吸头是必不可少的。
3。亲和选择
第一天
- 标记微孔板与永久性墨水，并指定哪些井将包含普罗特EIN的/修订。 （由于污染问题，板绝不重复使用）。在井的每个蛋白质和处理3次重复执行此。
- 用水充分冲洗板和拍打板4层之间清洗纸巾倒挂去除水。固定，在100μl的Tris，pH为7.5，在6井（或所选择的缓冲液中）的重组蛋白（10微克/毫升），或BSA（10微克/毫升）的3孔，共9井中的第一轮亲和选择的。盖菜用保鲜膜并留下过夜，4℃（ 图2G）。
- 保证有9×250毫升锥形瓶中（见2.1以上）清洗，高压灭菌，并适当地标记（用彩色胶带编码效果很好， 图2F）。
- 计算噬菌体裂解液的体积，以用于每个孔的基础上正在使用的文库的滴度和被筛选的噬菌体的数量。
- 保证新鲜BLT5403细胞准备使用对于这滴定亲和选择轮明日（ 图3A）。
- 确保足够的1X TBS（150mM的氯化钠，50mM的Tris碱，pH值7.6）和1X TTBS（1×TBS +0.05％（V / V）吐温20）可用于执行10×200微升洗涤液为正在使用的井的数量。此外，在预孵育TTBS在亲和选择温度。确保备份，密封，1个TTBS为50毫升猎鹰管存在于亲和选择温度有足够的1X TTBS。
- 准备3个处理的1.5ml离心管（27总）×3次重复×3式三份用990微升每个LB 100 AMP和正确标记（ 例如 10-2）。这些都是从微孔板检索明天的感染细菌。标记上的管（10 -2）的一侧的稀释和在另一侧的上升号码（“1”）。对于每个Eppendorf管中，并标示1硼硅管和一个LB 100 AMP板。在这种W唉，板和硼硅酸盐试管编号为1，2，3，4，5， 等等 。使滴定走得更快。后来的简单的数字可以匹配到稀释和治疗上的Eppendorf管中（ 如第12管是BSA控制稀释10-5的第一个复制的第三式三份）。商店Eppendorf管和LB 100 AMP板一夜之间在4℃（ 图2G和3B）。
例如：开始标记1.5ml离心管3 10 -2稀释度的噬菌体从BSA复制1以及1，2，和3（三一式三份的噬菌体滴度复制1的读数），然后标记硼硅酸盐试管1， 2，和3，其中，感染细菌会与未感染的细菌和顶层琼脂糖浇注在LB 100 AMP的琼脂平板上（ 图3C）之前进行混合。
- 对于串行ðilutions，标签Eppendorf管中，并给每个加900微升的LB 100 AMP的。一旦最初的稀释液（10 -2）感染的细菌为每个蛋白/治疗，复制和一式三份，明天制成，它们将被充分混合并离开他们加入100μl并加入到含有900微升的LB 100上的适当的Eppendorf管AMP为10 -3稀释（管4，5，6和复制1 BSA的控制）。在轮到他们这些将被充分混合并在10 -3稀释液将被用来使10 -4稀释液（7，8，9）。用10 -4稀释度为10 -5稀释液（10，11，12）， 等等 。获得滴度为第一三个重复的BSA（井）的。
- 同样将为BSA的复制是在两个来完成（当然2），BSA的复制三（以及3），这三个复制的有毒的诱饵，最后诱饵井重复3次。最后，应该有管标记的FROM 1-135（135是诱饵在10 -6的最大摊薄上次复制的最后一式三份）。隔夜存放这些Eppendorf管中，在4℃（ 图3C显示了Eppendorf公司和硼硅管对BSA的三次重复（三口井）的一式三份的所有稀释。
- 开始BLT5403细胞的2个或3培养管（从单个菌落挑从新鲜的划线过夜的LB AMP100板;从步骤2.2以上）生长在培养摇床（ 图2E和2F）作为过夜培养。以500毫升的LB（点2.5以上），加氨苄青霉素至100微克/毫升，然后将费恩巴赫烧瓶在摇床夹具所以这将是在37°C和充气第二天早上（ 图2F）。
注：第三轮和四个可能需要的p多达10 -10体积的近似稀释哈格到到LB AMP100量。
DAY TWO
- 第二天早晨，将高压灭菌的空9×250毫升锥形瓶中（每个微量滴定板孔）中的孵育摇床夹具。接种500毫升的LB 100 AMP与BLT5403细胞过夜培养的一个500微升昨晚开始（参见上面的步骤3.8），重新封装并启动它成长（37℃，220转）。打开分光光度计（ 图2H），并把它设置为读取吸光度在600 nm处。
- 从4℃取出酶标板，取下塑料薄膜，并用10倍的洗涤用200μl1X TBS的pH为7.5，每次打孩子和平板上洗的纸巾倒挂从板块中删除任何未结合的蛋白质。用200μl的5％（重量/体积）牛血清白蛋白或200微升5％（重量/体积）封闭剂在TBS 1小时（或过夜，如果方便的）与所述板包裹在保鲜膜阻塞。
- 洗掉阻塞s辨率的10倍与200μL1X TBST中的每一次，打孩子的板4层之间清洗纸巾倒挂。有可能重新填充孔用200μl水在此阶段，用保鲜膜覆盖它们，并把它们在4℃下储存最多为1周。
注：启动文化很快就好了，由当时的噬菌体感染，BLT5403从完成的亲和力选择准备添加，细胞在500毫升的0.6和1.0外径600之间。如果他们的成长远远超出1.0，裂解可能不会由于资源限制发生的细胞接近固定相。如果该细胞不达到的OD 600 0.6的至少前引入噬菌体，感染复数能太高，迅速 地杀死细胞，这可影响裂解物的代表性。如果细胞尚未完成亲和选择，INOC的接近的OD 600为0.6乌拉特与来自第二（或什至两个第二和第三个）试管振摇，在37℃（ 图2F）更BLT5403烧瓶中。如果一个外径600 1.0将至太快，关闭加热器和振动筛，打开盖子冷却文化和挨饿的细菌对氧气。重新开始加热/摇动一旦噬菌体已被添加。
从这里使用过滤器阻挡提示，以避免噬菌体交叉污染。
- 一旦烧瓶中接种，将噬菌体文库（100微升）中的蛋白质，用保鲜膜重新密封板并在室温下孵育1小时。
- 在55分钟，记录OD 600的细胞。倍增时间大约是每20分钟。采取相应的行动（见“注”以上）。
- 在一个小时结束时从板取下保鲜膜，并立即通过摇动出噬菌体进入转化废物，然后迅速添加200μl1X结核病的洗意法半导体。 （使用带1 = 100微升头multipipettor和移液器上设置2 [ 即提供200微升/柱塞抑郁症]，这和它过得很快）。设置为1分钟的计时器。 1分钟后，摇出缓冲器转化成浪费，嫌板纸巾上倒过来，放回板凳上（25°C板）。重复洗涤步骤10倍。
- 第 10 次洗涤后，取200微升BLT5403细胞从50毫升猎鹰管在4℃，并把它们从中TTBS中的最后一次洗涤已被删除井底。包裹板块在保鲜膜置于37℃下20分钟，得到仍坚持诱饵来感染任何细菌噬菌体（见注中讨论的胡乱结合的噬菌体关于坚持检索噬菌体和/或高背景）。
- 在20分钟结束后，拆开包装板，并采取10微升细菌由BSA在25°C复制一个孔，并把它在990微升的LB 100 AMP的标记“1”。重复两次以上为良好（管2和3），从而导致从该井3一式三份的噬菌体的1/100稀释液。这是BSA复制1采样三次。这些稀释液将被用来估计平均滴度±SEM对BSA的复写。
- 做相同的BSA（各10微升3一式三份样品）的复制2和3，用于中毒诱饵蛋白的三个复制的井，和用于诱饵蛋白。设置这些27 Eppendorf管放在一边，让剩下的170微升的感染细菌在井中朝着裂解生长。
- 如果细菌在烧瓶中是在OD 600 = 0.6-1.0，滗50毫升细胞从烧瓶中费恩巴赫到每个9 250ml锥形烧瓶中。走其余的170微升噬菌体感染BLT5403细菌在BSA的复制1井，并把它添加到50ml的细胞标记为“BSA代表1”（黄色胶带）。这样做对所有九井把它们放在培养箱振荡（
- 监测细胞中从37℃温育摇床时间 - 时间为溶解（约3从接种时小时）。在此期间，使从27的初始稀释液（10 -2），在适当时，标记的Eppendorf管中的稀释液。
- 从3.12以上，从最初27稀释液进行稀释液，取100微升的LB从Eppendorf管1（BSA复制1，首先从这个1/100从该孔稀释的一式三份样品）的细菌，并将其添加到900微升的LB在Eppendorf管4（1×10 -4稀释的BSA复制1，首先，从该井的一式三份样品）。
- 丢弃滤波器阻挡针尖用于获取100微升的LB从Eppendorf管4菌添加到900微升的LB在Eppendorf管7（1×10 -5稀释度的第一一式三份的BSA复制一个，前一个新的从该井的样品）。继续稀释（四自己到1×10 -6）的所有蛋白质和治疗（135管计）的所有复制的所有一式三份。
- 一旦细胞裂解，使培养至0.5M NaCl的加5ml从5M的NaCl和库存转移到标记的离心瓶中。
- 离心机在8000×g离心10分钟，在4℃下倒出上清液（病毒）到一个干净的，无菌50毫升Falcon管中。
- 添加几滴氯仿在Falcon管中的滗析上清液。
- 储存在4℃下，为下一轮亲和选择的。
4。第三天
- 高压灭菌或漂白已经在使用这个生成亲和选择轮为下一轮做准备所有的实验设备。
5。滴定
- 数量之多固体LB 100 AMP板因为有稀释液按升序排列（有现在应该是1片，每硼硅管和Eppendorf管中，具有相同的号码）。 PUT斯达康板在37℃培养箱（ 图3D）。
- 顶部融化琼脂糖（1.0克细菌蛋白胨，0.5克酵母提取物，0.5克氯化钠0.6克琼脂糖，请至100ml，高压灭菌器）通过松开顶部琼脂糖瓶盖和微波交替的瓶子和旋转它来搭 配它，直到顶部琼脂糖完全熔化。把瓶子在水浴中冷却至50℃（ 图3E）。
- 采取一种硼硅酸盐10毫升吸管使用吸管泵。点燃本生灯。打开一个发泡胶猎鹰管座或冷却器盖在板凳上翻过来放在了LB100 AMP板1到6（新鲜出炉的37℃培养箱中培养的）就可以了，1板最上面的（ 图4A）。该发泡胶保持板温暖。
- 把250微升BLT5403细胞从4℃到每一个准备在上面一天（第3.7节和图4b和4c）的编号为硼硅酸盐试管。 AR范围相同的递增系列中的1.5ml离心管中（ 图4A）的稀释液中的编号为硼硅酸盐试管中。
- 把100微升的稀释液在Eppendorf管1中的250微升细胞中的硼硅酸盐试管1（ 图4D和4E）。热火在吸管的第一个5比火焰一点（不要太多！〜3挥笔， 图4F），并投身到顶部熔化琼脂糖。拉起3毫升并提供快速插入细胞/噬菌体（ 图4G）上方的试管中。
- 通过轻弹用手指握住筒用另一只手（ 图4H），并且倒在平板上（ 图4I）的内容混合。倾斜板，并使用试管追逐泡沫和干点，直到整个板块所覆盖的顶层琼脂糖。把它放在一边，直立在板凳上冷却。
- 丢弃硼硅管，弹出过滤屏障尖，得到新鲜和继续，直到所有的稀释已镀。从培养箱中检索LB 100 AMP板，因为它们被耗尽，但不超过6个在一个时间或在冷却和顶琼脂糖固化太快。
- 一旦顶层琼脂糖扎实，把板倒置（这一点很重要要做到这一点）。否则，将琼脂/琼脂“哭”，凝结在盖，滴下来的顶层琼脂糖和运行在它，接受噬菌体与它使得不可能准确的滴度），并且：1）将板在37℃彗星孵化器[回到4小时后计数滴度为T7是咄咄逼人]或：2）给他们在板凳上倒过来，他们已经准备好，第二天早上来算滴度。
- 采取一切必要的预防措施，以防止玻璃破碎，或伤害，如果是这样，把顶层琼脂糖瓶盖回松散和微波炉的顶部琼脂糖至沸腾。这样做两次。让它冷却，拧紧帽，并把它扔掉。打开水浴下降到其正常的温度或关闭它。把稀释液在4℃冰箱。他们将需要解释的滴度和/或重做一些滴定的。
6。确定和计算滴度
- 研究形成于板的牌匾，并丢弃那些与融合裂解（ 图5A 如 10 -2稀释）。确定哪些剩余的连续稀释的产生了足够少斑块，使一个准确的数字式连接（ 图5A钕5B）。从这些板（; 图5B表1）记录空斑数。
- 由稀释乘菌斑的数目，然后乘以100这个数字来得到每毫升从孔（取自被感染的细菌的噬斑形成单位的数量，即只加入10μl感染的细菌被采取为每个一式三份和s的O此必须乘以100得到每毫升计数）。平均斑块形成单位数（PFU）每毫升（PFU / ml的取出来的微量滴定板孔未稀释的细菌感染的），对面这口井采取三个一式三份。
- 形成吻合三个重复孔的大平均并计算这意味着（ 表1）的标准误差。这是将被记录在该增加的噬菌体效价的数字，每个亲和选择圆形和处理（ 图5C）。
7。斑块隔离，PCR和测序
- 在亲和选择第4轮结束后，选择18个人，以及定义，牙菌斑和菌落，用无菌巴斯德移液管，牙签，黄色枪头或类似装置，这些核心斑块从滴定板中。如果使用管或技巧，先弄湿里面用的Tris-HCl，pH值为8.5的Eppendorf管（ 图5D）。
- 驱逐核心为100微升的Tris-HCl，pH值为8.5的适当管（ 图5G）和涡简要介绍。
- 加热从该体积20μl，在65℃10分钟。
- 离心加热的量在13000×g离心在台式离心机在室温下放置10分钟。取3微升从该等分试样中的PCR反应，用T7-UP和T7-DOWN的引物中使用的上清液。
- 对于每个18分离的噬菌斑，加热溶液，使用58℃的退火温度和35个循环，在50μl的PCR反应。
- 运行20微升选管会在1％的反应2h（重量/体积）含0.015％（体积/体积）溴化乙锭的琼脂糖凝胶。可视化与使用适当的眼部防护和丁腈手套实验室透射器。 （注意：溴化乙锭是一种强诱变剂）拍摄凝胶和妥善处置受污染的材料（ 图6A和6B）。
- 如果扩增子是单一的产品，而不是从空载体（产品运行接近100bp的在1％（重量/体积）的TAE琼脂糖凝胶上， 图6A和6B箭头），清理剩余的30微升用作测序模板。如果不是在凝胶上（ 图6B，斑块15）的单品，切出的最突出的频带（次）从凝胶中提取和从凝胶中使用的试剂盒中的DNA。
- 序列，该序列是不使用T7-UP底漆空载体的扩增子。
- 检查每个序列链接器和武器，从这些信息中，确定在何处插入开始的位置。使用巴原文局部比对搜索工具（BLAST;国立医学图书馆），以确定所述经编码cDNA的同一性，该插入是否处于帧，如果有的话，已被显示和捕获的蛋白质的哪部分编码序列（CDS）由诱饵。
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Representative Results
能够削弱诱饵与噬菌体展示蛋白质相互作用（代谢中毒诱饵）的能力提供了一个有力的阴性对照这一技术。这也是可取的，以确定该诱饵，当结合到微量滴定板孔，保持其功能。这两个检查将增加信心，由nonpoisoned诱饵回收相互作用，噬菌体展示的蛋白质是合法的。
从各孔中取样3式三份大大增加参与了亲和选择的时间和工作，但提供的滴度内每孔一个更准确的估计比采样一次。虽然大多数的滴度为一式三份的有较好的一致性，注意，在第四轮的一式三份的牛血清白蛋白复制2有很大的不同（ 表1）。通过取样几次，最后估计吻合并不像容易移液误差和t的更准确的估计他实际效价和解决这个估计的变化，以及对好，得到（ 表1，图5C）。
增加噬菌体滴度，优选为nonpoisoned诱饵，作为亲和选择的数量舍入的增加，还提供了信心，该技术是工作（ 图5C）。的噬菌体含有插入在nonpoisoned诱饵井作为亲和选择的数量的增加而增加的百分比保留也是吉利（ 图6A和图6B）。
后先进轮亲和选择的，增加的数目独立地回收噬菌体已插入（可辨别为PCR扩增子在容量上大于约100 bp的; 图6B），相对于第一轮（ 图6A），以及所述沉降在图6B <数相同大小的条带（注车道5-9，11-18这些扩增子/ STRONG>），是一个很好的迹象，特别是克隆的亲和选择被选中（ 图6A和6B）。测序的数目在最终亲和性选择得到的圆斑之后，类似的相同的蛋白质的区域（不同的克隆）的检索是独立验证，显示的蛋白质的部分具有用于诱饵善意的亲和力。这些独立地回收噬菌体还提供关于什么的全部蛋白质的部分是能够与诱饵相互作用的信息。如果显示的cDNA文库一直用随机引物构建的噬菌体，局部和全长蛋白覆盖的巨大差异可以预期的（在噬菌体容忍的cDNA插入大小的限制），导致多个独立的克隆覆盖该蛋白的相同部分。即使是连续的失帧命中应仔细审查，以确定它们编码一个类似的主题，本巴它结合。 （这是假设使用ORF-3的技术并没有构建的库）。
表1为计算的平均滴度/毫升感染从第四轮亲和选择的三个疗程的水井细菌。为10 -3稀释的牌匾从诱饵井的第一个复制所采取的每一个一式三份的数字取自图5B。 点击这里查看更大的表 。
噬菌体展示方法的图1，总体图形描绘 ：A）获得了噬菌体展示库，最好使用构造随机引物，聚选定的RNA，产生的cDNA;和B），诱饵就是在尽可能的，可核查的生物活性，在固体载体上固定化，如果可能，通过添加抑制剂呈现为非活动状态，即使（ 如从竞争性结合诱饵蛋白抑制）。 RT：反转录。
。图2的一些所需的设备和用于执行噬菌体展示材料的无菌技术需要访问这两个：a）在高压釜和，B）在层流罩。噬菌体库和BLT5403细菌股票需要-80＆＃ 176，C温度下长时间贮存C）成长噬菌体和细菌需要，DF）的 37℃恒温箱，其中之一，EF）是能够生长液培养（轨道）的。通过颜色编码，F）的优化实验最大限度地减少失误。 BLT5403细胞滴定可以在4℃下可保存长达一周，G）优化布局的， 高）分光光度计对下列细胞密度旁边的轨道摇床可以节省时间。经常处理表面和移液器与我）强大的清洁剂和j）Envirocide，可协助降低的病毒污染的风险。 点击这里查看大图。
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图3。一个可能的建立，以允许平滑的亲和选择。一）BLT5403中有用的一两天之前，滴定种植和镀，无病毒的介绍，以确定他们没有沾染病毒。滴定的亲和选择的天可以通过预先制备得到促进：B）预先标注的埃芬道夫和，C），用于硼硅酸盐试管B）的等分LB 100AMP的稀释溶液，并将其存储在4℃下过夜ð。 ）将预先编号，LB 100AMP含有琼脂，培养皿在37℃滴定的 E前预热约1小时）融化的无菌顶琼脂糖（松开盖），并放置在预热50℃的水浴中冷却这个温度滴定前一小时开始。使用乐广告甜甜圈避免了瓶子弄翻作为顶层琼脂糖被删除。 点击这里查看大图。
图4。滴定从轮亲和选择回收的噬菌体 。电镀尽快开始感染后防止滴度A）第一组病毒感染BLT5403稀释并组装在机架硼硅管的人工通货膨胀。使用过滤器阻挡提示：BC）250微升BLT5403细胞从股价从4℃转移到硼硅管。使用过滤器阻挡提示：DE）的BLT5403在第一硼硅管感染科幻RST病毒稀释度F）的硼硅酸盐吸管被加热过明火，防止堵塞，并保持顶部琼脂糖温暖。不要加热过度吸管或细菌就会被烫伤和死亡G）3毫升熔化的顶层琼脂糖迅速检索并倒在细菌中的硼硅管高）管弹简单地混合内容和; 我）内容倒入预热的LB 100AMP琼脂平板上，用管子移动气泡板的两侧，以确保最高的琼脂糖覆盖了整个板块。 点击这里查看大图。
图5。典型滴度再sults A）的低稀释液（10 -2），几乎总是导致汇合裂解为在所述第一亲和选择轮的所有处理（图中的病毒已生长过长导致过度斑块大小以方便照相）。 乙）斑块的适当稀释使用的是骗子，以保持计数的斑块轨道计算。 三）滴度大幅度增加为诱饵井，而其余的更多或更少稳定BSA或有毒的诱饵。在后来的几轮，从诱饵井高地，进一步亲和选择滴度是非生产性的。D）以及隔离的牌匾已被选定为测序和收集润湿牧场吸管从Eppendorf管中的解决方案，一定要消除多余的液体至少它运行于多个牌匾和污染的核心。 五）移液管已通过与已经压缩吸管灯泡的牌匾推F）的灯泡已被释放，而吸管仍然是在顶层琼脂糖，吸吮斑块向上进入移液管（箭头）。G）的芯斑块即将被输送到液体中适当的Eppendorf管中。噬菌体稀释液（每LB 100AMP的体积感染细菌的体积）被描绘在皮氏培养皿（ 例如 10 -3 = 1/1，000稀释）。从复制以及1三个一式三份样品缩写为旅程。 1，跳闸。 2，和旅行。 3，所有的复制1（重复1 =以及1）。在板的B中的底部）中的数字是相吻合的板的实际菌斑数目。这些都为10 -3稀释细菌从第四轮亲和选择（R4在数字）诱饵。 点击这里查看大图 。
图6。典型的PCR结果为亲和选择在适当的诱饵。 A）的空载体斑块（箭头）的比例通常是最初相当高，但在诱饵井，B）在随后的几轮降低。含牌匾插入倾向于定居在那些含有相同大小插入在这以后亲和选择轮。 MWM：分子量标记。
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Discussion
通过运行该实验在3复制的井，同一蛋白结合到所述诱饵的独立获得的噬菌体可以区分，即使它们是相同的克隆（ 即在已经获得的编码区的碱基序列没有差异，但这些已从独立的水井中检索）。否则，噬菌体编码相同的蛋白质结合到所述诱饵之间区分的唯一途径是如果它们是独立地扭转这种不同的核苷酸序列中的某些部分转录区域。
使用1费恩巴赫烧瓶中，在其中在扩增的亲和性筛选噬菌体生长的所有细菌的使用允许一个更忙碌监测细菌生长导致对感染下列亲和选择的不是试图监视9锥形瓶中。滗这些细菌，只是之前的感染，为预热锥形瓶也消除子库滴度差异由于阿尔特由于细菌生长在特定的瓶穷人口粮在感染复数。由此，从圆到圆的噬菌体效价的改变应取决于噬菌体保留在井的数量和复制的井间的变化滴度应该是最小的。
利用噬菌体展示一个特殊优势是大国的技术具有识别噬菌体展示蛋白有一个特定的诱饵的亲和力。由于效率与该噬菌体复制中的BLT5403主机，代表被保持在一个良好的亲和力第一轮选择一种罕见的CDS甚至单个噬菌体，如果涂层融合蛋白具有对诱饵的高亲和性，将通过更大的数字在第二轮来表示。到了第四轮，这种噬菌体应占多数噬菌体的存在于裂解文化。
噬菌体复制到高滴度的这种能力也是高科技的限制NIQUE。如果一个特定的诱饵具有相互作用蛋白伴侣对于其具有在库中的高亲和力，这是非常难以捕捉的蛋白质，可以合法地绑定诱饵但以较低的亲和力，因为这些将趋向于以高亲和力结合蛋白被排挤。利用新一代测序技术来识别这种罕见的噬菌体是绕过这个限制1的一个可能的手段。此外，BLT5403的T7噬菌体的结果为“污染”的较量整个实验室需要毅力，而恶劣的净化剂（ 如 Envirocide）和优异的无菌技术来克服的易感性。污染可导致亲和选择的进度相当大的损失的时间，一个人试图找出并消除干扰源。
手段之一，已在分区噬菌体成功限制到紧与松“粘合剂”，就是要尝试恢复宽松的粘合剂第一个BÝ引入到井设计用于去除噬菌体被不太紧密结合到所述诱饵中的溶液（1％SDS或类似离液剂）。该解决方案然后可以先移除，引进细菌带入这是预计将感染那些噬菌体剩余绑定到诱饵井前。这种技术还可以减少的背景下，不合逻辑的结合噬菌体，增色不少。然而，如果该技术被追求，子库，重复，重复的亲和力在随后的几轮选择的数量增加一倍，这大大增加了时间和费用。
以下的噬菌体滴度上升的过程中通过几轮亲和选择的可以通过一个大体积的LB和大量的LB AMP 100的板，过滤器阻挡提示，Eppendorf管等运行。这是昂贵的，因为是研究噬菌体即使是温和的数量所需的测序。滴定大量的TR的几个重复稀释一式三份eatments需要相当的时间，以便建立尽可能多的材料尽可能的前一天的亲和性选择的重要性是至关重要的。
目前正在研究的一个令人兴奋的可能性是使用独立的噬菌体蛋白的位置，结合到诱饵，来模拟物理属性和蛋白质与诱饵相互作用的区域的三维结构。例如，审查的蛋白质目标是绑定到一组同源的胚胎发育晚期的属性从拟南芥属（ 拟南芥 ）和大豆 （Glycine max）丰富的（LEA）的蛋白质，其中一个重要结论是，绑定到的该区域的LEA蛋白蛋白质是结合蛋白11的最（或其中的大多数）的亲水性。追溯，考虑到LEA蛋白被假定来保护他们的客户端从分子变性脱水过程中，它可以是Surmised客户端分子最容易受到执法机关没有保护功能障碍的区域可能是那些最能结合水（亲水性）。
明智的做法是引入了细菌入井和检索之间的时间最小化，因此滴度不充气。确保该稀释液是足够通过电镀一些BLT5403未经病毒感染，以验证该细菌库存不被污染，并且最大稀释度是足够的，以避免汇合裂解。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
哈奇，麦金太尔 - 斯坦尼斯（AD421 CRIS），美国农业部种子格兰特（2011-04375）和弗雷德里克·麦克马斯特研究奖学金爵士ABD;该项目部分由美国国家科学基金会的IOS（0849230）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Becton Dickinson Co. | 211705 | |
| Yeast Extract | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Blocking Reagent | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotype: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR) |
| Ampicillin, Sodium Salt | Research Products International | A40040 | |
| Ethidium bromide | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| Penta-HIS primary antibody | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Goat anti-mouse alkaline phosphatise conjugate | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| T7-UP primer | EMD Chemicals Inc. | 5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3' | |
| T7-DOWN primer | EMD Chemicals Inc. | 5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3' | |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Heating Block | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| 96-well Cell Culture Plates | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubator Oven | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipettes, 5 ¾ in | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Gloves, Nitrile | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Sterile 1.5 ml tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 10 ml Borosilicate Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-25E | |
| Borosilicate culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, ELISA plate reader | Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland | Type 362 |
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