En protokoll for Fag Display og Affinitetsutvelgelse Bruke rekombinante protein agn

Summary

Phage skjermen er en kraftfull teknikk for å fange proteiner eller proteinmolekyldeler som virker sammen med et immobilisert molekyl av interesse. Når en beslutning om hva slags fag cDNA bibliotek for å opprette og skjermen har blitt gjort, protokollen beskrevet her tillater effektiv affinitet valg som fører til identifisering av interactors.

Abstract

Ved hjelp av rekombinant fag som et stillas for å presentere ulike protein deler kodet av en retnings klonet cDNA bibliotek til immobilisert agn molekyler er et effektivt middel for å oppdage interaksjoner. Teknikken har i stor grad blitt brukt for å oppdage protein-protein interaksjoner, men agnet molekylet for å bli utfordret trenger ikke være begrenset til proteiner. Protokollen presenteres her har blitt optimalisert for å tillate et beskjedent antall agn for å bli vist i replikater å maksimere identifisering av uavhengige kloner presentere det samme proteinet. Dette tillater større tillit til at samspill proteiner identifisert er legitime interactors av agn molekylet. Overvåking av fag-titeret etter hver affinitet valg gir året informasjon om hvordan affinitet valg utvikler seg, så vel som på effekten av negative kontroller. Et virkemiddel titering fagen, og hvordan og hva de skal forberede seg på forhånd for å tillate denne prosessen for å komme videre så effektivt sommulig, er presentert. Attributter av amplicons hentet følgende isolering av uavhengige plakk er markert som kan brukes til å fastslå hvor godt affinitet utvalget har kommet. Feilsøking teknikker for å minimere falske positive eller å omgå vedvarende utvinnes fag er forklart. Virkemiddel for å redusere viruskontaminasjon blusse opp er diskutert.

Introduction

Hvorfor bruke fag-skjerm og affinitet utvalg i stedet for de utallige andre teknikker for å oppdage og etterforske protein interaksjoner med andre molekyler? Phage skjerm kan kreve noen unike fordeler fremfor andre fremgangsmåter for påvisning av protein-ligand interaksjoner ^1-3 inkludert følgende:

Svært bredt repertoar av agn molekyler

Den fremste årsaken er i mangfoldet av molekyler som kan opptre som agn i affinitet utvalg ^fire. Phage Display er en meget kraftig middel til å isolere proteinfragmenter som interagerer med andre proteiner, nukleotider, karbohydrater, etc. ⁵ I hovedsak, dersom en polymer / molekyl kan være festet til en gjenvinnbar støtte, kan det bli screenet for affiniteten med phage viste proteiner. I tillegg kan agnet molekyl er tilgjengelig for å bestemme om den beholder biologisk aktivitet når de immobilisert ^6, hvis betingelsene som brukes til å reduce / eliminere dens aktivitet er effektive ^{til 6,} eller for å innføre post-translasjonelle modifikasjoner til agnet før affinitet markering.

Fag motstand mot utenforliggende faktorer

En annen grunn for å bruke fag-display, er at det er mulig at noen agn krever miljøstress (varme, høy osmolyte konsentrasjoner, spesifikke kofaktorer, etc.) For å fange opp de interagerende proteiner, eller fagen viste proteiner kan trenge å bli noe forandret før affinitet utvalg. Den primære faktor som studeres er samspillet mellom agn og protein, ikke den tilstand som tillater interaksjon forekommer, eller hvis det er dødelig for testorganismen. Den T7 phage er spesielt godt egnet til slike studier fordi det kan tåle tøffe eksperimentelle betingelser både intakte og levedyktig (for eksempel den publiserte termo maksimum for T7 levedyktighet er ~ 60 ° C ^7). Som et eksempel på en endring phage viste proproteiner, når undersøke Arabidopsis thaliana frø proteomet for protein substrater for reparasjonen enzymet, Protein Isoaspartyl Methyl Transferease (PIMT), viruset som brukes i disse studiene hadde vært "gammel" i en uke, før hver affinitet utvalg runde, for å oppmuntre til innføring av isoaspartate (isoAsp) tørket i mottakelige proteiner ^seks som ikke er mulig i organismer som kan gjenkjenne og reparasjon / forbrenne slike misdannelser.

Metabolsk inert

Videre fagen er vanligvis motstandsdyktige mot metabolske giftstoff og forstyrrer små molekyler som kan, i det minste resultere i mitogen effekt på metabolsk aktive testorganismer. Etter stringens vaskinger, er giften fjernes før et stort volum av bakterier er innført for infeksjon slik at giften fortynnes til et område uskadelige for bakterier eller påfølgende fag-replikasjon. Mens undersøke protein mål av PIMT reparasjonenzym, ble S-adenosylmetionin (AdoMet) som brukes til å aktivere mikro titer-plate-brønn immobilisert enzym for å tillate målprotein fangst samtidig avhengig av S-adenosylhomocystein (AdoHcy) for å inaktivere enzymet, og gir en nyttig negativ kontroll fiksere vissheten om at viruset ikke ville bli negativt påvirket av enten AdoMet eller AdoHcy ^seks. I tillegg er visse medlemmer av sen embryogenese Rikelig (LEA) proteinfamilier, som er undersøkt i dette laboratoriet, er kjent for å endre sin form, i nærvær av additiver, slik som sakkarose ^8, som kan oppnå konsentrasjoner så høye som 200 mM i soyabønne frø ved punktet av fysiologisk modenhet ^ni. Viruset er ikke forventet å være påvirket ved tilsetning av 200 mM sukrose i hver affinitet valg runde, eventuelt nødvendig for visse LEA-client protein interaksjoner, som ikke er tilfelle for autonomt levedyktige testorganismer ^10.

Dette laboratoriet har fokusert på discovering protein-protein interaksjoner i modne, dehydrerte eller spirende frø som ligger til grunn for mekanismen av lagret proteom beskyttelse under dehydrering ¹¹ eller reparasjon av komponenter av den lagrede proteomet som er utsatt for isoAsp formasjon når frøet har imbibed ^seks. Dermed produksjon og rensing av rekombinante proteiner som kreves som agn i en aktiv stat, og å sikre at de forblir slik, før og etter at de er immobilisert, men ofte vanskelig, er en hjørnestein i vårt arbeid. Men som hver rekombinant protein produksjon scenario er forskjellig, optimalisere forholdene for rekombinant protein produksjonen vil ikke bli behandlet her. Brukere oppfordres til å forsøke, der det er mulig, for å avgjøre om det immobiliserte protein er fortsatt funksjonell (for eksempel hvis det er et enzym, gjør et enzym assay i mikrotitreringsplate brønnene). Dette vil gi en viss tillit til at agnet er biologisk aktive og derfor at enhver oppdaget interaksjoner ernoe mer tilbøyelige til å ha biologisk relevans.

Protocol

En grafisk fremstilling av fremgangsmåten beskrevet nedenfor (fig. 1) fremhever de to primære komponenter for affinitet valg ved hjelp av et fag display-bibliotek: A) et fag display-bibliotek cDNA sannsynlig å koder proteiner med affinitet for agnet, og, b) et renset rekombinant agn protein. Produksjon av agn (rekombinant protein) har blitt grundig undersøkt og litteratur som beskriver beste praksis for å sikre løselig, aktiv rekombinant protein fra E. coli ^12-13, eukaryote gjær ^14, insekt ^15-16, anlegg ^17-18, eller pattedyr ^19-20 celler florerer.

I den følgende protokoll, en hexahistidyl merket rekombinant protein som har vært brukt som agn. Dette tillater verifisering på at agnet proteiner forblir i brønnene etter inkubering over natten, og vasketrinnene.

En. ELISA for Rekombinant Protein retensjon i mikrotiterplate Wells

1. Mark enmikrotitreringsplate med permanent blekk, og utpeke hvilke brønner vil inneholde hvilke protein konsentrasjoner. Utfør dette i tre gjennomkjøringer av brønner. Inkluder tre gjennomkjøringer av en negativ kontroll konsentrasjon serie (non-hexahistidyl-merket protein, BSA fungerer godt som denne bakgrunn sjekk).
2. Vask platen grundig med vann og fjern vannet ved smacking platen opp ned på fire lag tørkepapir mellom vasker.
3. Immobilisere, i de første tre brønnene i 100 pl Tris, pH 7,5, (eller buffer for valg) den høyeste konsentrasjonen av det rekombinante protein (10 pg / ml). Legg til de neste tre brønner rekombinant protein på (1,0 mikrogram / ​​ml), osv., ned til 1,0 ng / ml. Gjør det samme med den BSA konsentrasjon serien.
4. Dekk retter med plastfolie og la over natten ved 4 ° C.
5. Neste morgen, fjerne protein ved smacking plate opp ned på 4-5 lag papirhåndkle.
6. Vask brønner 5x med 200 mL 1x TBS hver gang, forlater bufferi brønnene for ~ 1 min hver gang og fjerne buffer vask ved smacking platen opp ned på tørkepapir etter hver vask.
7. Blokker ELISA-plate på en rotasjonsrister ved hjelp av 200 pl 5% (w / v) BSA eller 200 ul 5% (w / v) blokkerende reagens i TBS ved romtemperatur i 2 timer (eller sitter stasjonært over natten ved 4 ° C dersom praktisk ) innpakket i plastfolie.
8. Fjern overflødig blokkering løsning ved smacking platen opp ned på papirhåndklær. Vask 4x 1 min hver gang med 200 mL av 1x TBS, fjerne vaskeløsningen ved smacking platen opp ned.
9. Fortynn penta-HIS primære antistoff 1/2, 000 i blokkeringsbuffer og levere 100 pl til hver brønn. Inkuber 1-2 timer ved romtemperatur med platen i ro.
10. Fjern den primære antistoffet ved smacking platen opp ned på papirhåndklær. Vask 4x 1 min hver gang med 200 mL av 1x TBST. Fjern hver vask ved smacking platen opp ned.
11. Spe den sekundære antistoff(Geit anti-mus alkalisk fosfatase-konjugat), i blokkeringsbuffer og inkuber 100 ul i hver brønn i 1 time ved romtemperatur med platen i ro.
12. Ta ut den sekundære antistoff ved smacking platen opp ned på papirhåndklær. Vask 4x 1 min hver gang med 200 mL av 1x TBST. Fjern hver vask ved smacking platen opp ned.
13. Sett 200 ul av para-nitrofenylfosfat (pNPP) substratoppløsning i hver brønn. Substratet er et fast stoff ved -20 ° C, så foreta alikvoter og hente det nødvendige antall porsjoner som er nødvendige for påvisning ut av fryseren i god tid slik at den er fullstendig tint ved dette stadiet.
14. Ved 30 min stopp reaksjonen ved å tilsette 50 pl av 3 M NaOH til hver brønn.
15. Les absorbansen ved 405 nm umiddelbart på ELISA-plateavleser.

Merk: Hvis det rekombinante protein av interesse ikke fester seg til brønnene, er det mulig å endre the sammensetning / pH av buffer betraktelig (karbonatbuffer pH 10.0) eller legge chaotropes (urea) for å forsøke å hjelpe til protein feste til microtiter plate brønnene. Imidlertid re-etablere at det rekombinante proteinet: 1) forblir bundet til mikrotiter-platebrønnene under betingelsene for affinitet utvalg og, 2) beholder sin biologiske aktivitet etter fjerning av den høye pH / chaotrope anbefales.

2. Økende Bakteriell Host (BLT5403) for Titering

1. Autoklav (Figur 2A) ti 250 ml kolber og tre kultur rør. Gjør LB væske og LB agar for å helle solide medieplater. Kul LB agar til 50 ° C og tilsett ampicillin til 100 ug / ml før aseptisk strømme inn i Petri-skåler i en strømningshette (figur 2B).
2. Også i en strømningshette (figur 2B) strek et LB, 100 pg / ml ampicillin (LB ^AMP100) agarplate for enkeltkolonier av BLT5403 fra lager holdt i 15% (v / v)glycerol ved -80 ° C (figur 2C). Plasser platen opp-ned ved 37 ° C over natten i en inkubator for vekst (figur 2D).
3. Om morgenen inokulere 50 ml LB ^AMP100 i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe med en enkelt koloni plukket fra skålen. Inkuber ved 37 ° C, 200 rpm på en horisontal riste (figurene 2E og 2F), og bruke et spektrofotometer for å overvåke celletetthet på OD ₆₀₀ = 0,5 til 0,6 (figur 2H).
4. Hell cellene i en 50 ml Falcon rør eller lignende, og holde ved 4 ° C inntil bruk (figur 2G). Cellene vil vanligvis være levedyktig i ~ 1 uke.
5. Gjør 500 ml LB, legg den i en baffled Fernbach kolbe og autoklav det. Når det er sterilt, plassere kolben ved 4 ° C (figur 2G) eller romtemperatur før natten av "dag én" nedenfor.

Merk: Det vert bakteriecellerBLT5403, som uttrykker en plasmid-båret kilden til T7 opprinnelige kapsid protein uten som T7 mid-og low-kopi vektorer ikke kan replikere med hell, er svært mottagelige for viruset. Det er viktig å unngå forurensning. Forurensning vil etter hvert oppstå på hvilket tidspunkt alle overflater som er i kontakt med de virus / infiserte bakterier må tørkes med 70% (v / v) etanol eller skrubbes med vaskemiddel (Figur 2I). Hvis dette er ineffektiv, er en grundig rensing av alle overflater som tåler Envirocide (figur 2J) påkrevd. Begynn BLT5403 celler fra fryseren lager hver ny runde av affinitet utvalget å bidra til å redusere forurensning av bestanden i 4 ° C, og sikre livskraftige cellene blir brukt i protokollen. Filter barriere pipetter er avgjørende.

Tre. Affinitetsutvelgelse

DAY ONE

1. Mark en mikrotiterplate med permanent blekk, og utpeke hvilke brønner vil inneholde hvilke protEins / endringer. (På grunn av forurensning problemer, er platene aldri gjenbrukes). Utføres denne i tre reproduksjoner av brønner for hvert protein og behandling.
2. Vask platen grundig med vann og fjern vannet ved smacking platen opp ned på fire lag tørkepapir mellom vasker. Immobilisere, i 100 pl Tris, pH 7,5, (eller buffer for valg) det rekombinante protein (10 pg / ml) i seks brønner, eller BSA (10 mikrogram / ml) i tre brønner, for totalt ni brønner for først runde av affinitet utvalg. Dekk fatet med plastfolie og la over natten ved 4 ° C (figur 2G).
3. Sørg for at det er 9 x 250 ml kolber (se 2.1 ovenfor) rengjøres, autoklaveres, og merket på riktig måte (koding med farget tape fungerer godt, Figur 2F).
4. Beregn volum av fag-lysat som skal brukes for hver brønn basert på titer av biblioteket som benyttes og antallet av fag som skal siktes.
5. Sørg for at ferske BLT5403 cellene er klar til brukfor titering denne affinitet utvalg runde i morgen (figur 3A).
6. Sikre tilstrekkelig 1x TBS (150 mM NaCl, 50 mM Tris Base, pH 7,6), og 1x TTBS (1x TBS + 0,05% (v / v) Tween 20), er tilgjengelige for å utføre 10 x 200 mL vasker for antall brønner som benyttes . I tillegg forinkubere TTBS ved affinitets valg temperatur. Sørg for at en backup, forseglet, 50 ml Falcon rør av 1x TTBS finnes på affinitet utvalg temperaturen med tilstrekkelig 1x TTBS.
7. Forbered tre behandlinger x 3 replications x 3 triplicates av 1,5 ml Eppendorf-rør (27 totalt) med 990 mL av LB ^{100 AMP} hver og merke hensiktsmessig (f.eks 10 ^-2). Dette er for de infiserte bakterier hentet fra mikrotitreringsplate brønnene i morgen. Merk fortynningen på den ene siden av røret (10 ^-2) og en stigende nummer på den annen side ("1"). For hver Eppendorf tube, også merke en borsilikat tube og en LB ^{100 AMP} plate. I denne way, er platene og borsilikat reagensrør nummerert 1, 2, 3, 4, 5, osv.. å gjøre titering gå raskere. Etterpå den enkle antallet kan være tilpasset fortynning og behandling på Eppendorf rør (f. eks 12 røret var det tredje tre eksemplarer av det første replikering av BSA kontroll for fortynning 10 ^-5). Lagre Eppendorfrør og LB ^{100 AMP} plater over natten ved 4 ° C (figur 2G og 3B).

For eksempel: Start merking 1,5 ml Eppendorf-rør i tre 10 ^-2 fortynninger av phage fra BSA replikering en brønn som 1, 2 og 3 (tre tredoble målinger av fag-titeret for replikering en), og deretter merke borosilicate reagensrør 1, 2 og 3 hvor de infiserte bakterier vil bli blandet med ikke-infiserte bakterier og topp agarose før helling på LB ^{100 AMP-agarplater} (figur 3C).

8. For serie dilutions, etikett Eppendorf rør og, til hver, legg 900 mL av LB ^{100 AMP.} Når de innledende fortynninger (10 ^-2) av infiserte bakterier er laget for hvert protein / behandling, replikering, og tre eksemplarer, i morgen, vil de blandes godt og 100 mL tatt fra dem og lagt til riktig Eppendorf rør som inneholder 900 mL LB ^{100 AMP} til 10 ^-3 fortynning (rørene 4, 5 og 6 for replikasjon av en BSA kontroll). Disse vil bli blandet godt i sin tur, og de ​​10 ^-3 fortynninger vil bli brukt til å lage 10 ^-4 fortynninger (7, 8, 9). Bruk 10 ^-4 fortynninger i 10 ^-5 fortynninger (10, 11, 12), etc. for å få titer for den første av de tre gjennomkjøringer BSA (brønner).
9. Det samme vil skje for BSA replikering to (brønn 2), BSA replikering tre (brønn 3), er de tre gjennomkjøringer av den forgiftede lokkemat, og til slutt tre paralleller av agnet brønner. På slutten, bør det være rør merket from 1-135 (135 er den siste tre eksemplarer av siste replikering av agnet ved maksimal fortynning på 10 ^-6). Oppbevar disse Eppendorf-rør over natten ved 4 ° C (figur 3C viser Eppendorf og borsilikat-rør for alle fortynninger av triplicates av de tre gjennomkjøringer (de tre brønner) med BSA.
10. Begynn to eller tre kultur rør av BLT5403 celler (plukket fra enkeltkolonier fra en fersk stripete over natten LB ^AMP100 plate, fra trinn 2.2 ovenfor) vokser i rugende shaker (Tall 2E og 2F) som en overnatting kultur. Til 500 ml LB (punkt 2.5 ovenfor), legge ampicillin til 100 mikrogram / ​​ml og plasser Fernbach kolbe i klemmen i risteinkubator så det vil være på 37 ° C og luftet følgende morgen (figur 2F).

Merk: Runde tre og fire kan kreve nøyaktig fortynninger av så mye som 10 ^-10 volum av pHage til volum på til LB ^AMP100.

Dag to

11. Neste morgen, plasserer de autoklaveres, tomme 9 x 250 ml kolber (en for hver mikrotitreringsplate godt) i klemmene i den rugende shaker. Dyrk 500 ml LB ^{100 AMP} med 500 mL fra en av overnatting kulturer av BLT5403 celler startet i går kveld (se trinn 3.8 ovenfor), forsegle og starte den voksende (37 ° C, 220 rpm). Slå på spektrofotometer (figur 2H) og sette den til å lese absorbans ved 600 nm.
12. Fjern mikrotitreringsplate fra 4 ° C, fjern plastfilmen, og fjern eventuell ubundet protein fra platen ved å vaske 10x med 200 ul hver gang for 1x TBS pH 7,5 og smacking platen opp ned på papirhåndkle mellom hver vask. Blokker med 200 ul 5% (w / v) BSA eller 200 ul 5% (w / v) blokkerende reagens i TBS i 1 time (over natten, eller hvis passende) med platen innpakket i plastfolie.
13. Vask av blokkering solution 10x med 200 mL hver gang av 1x TBST, smacking platen opp ned på fire lag med tørkepapir mellom hver vask. Det er mulig å fylle på brønner med 200 mL vann på dette stadiet, dekk dem med plastfolie og legg dem ved 4 ° C for å lagre for maksimal en uke.

Legg merke til: Start kulturen raskt nok til at, etter den tid fagen smittet-BLT5403 fra fullføringen av affinitet valg er klar til å legge til, celler i 500 ml er mellom 0,6 og 1,0 OD _600. Hvis de vokser mye utover 1,0, kan lyse ikke oppstå på grunn av ressursbegrensninger som celler nærmer stasjonær fase. Dersom cellene ikke oppnå en OD ₆₀₀ på 0,6 i det minste forut for innføring av fag, kan den infeksjonsmangfoldighet være for høy, hurtig dreping av cellene, noe som kan påvirke fremstilling av lysatet. Dersom cellene er ennå ikke nærmer seg en OD ₆₀₀ på 0,6 ved avslutning av affinitet markering, INOCUlate kolben med mer BLT5403 fra den andre (eller til og med fra både andre og tredje) reagensglass risting ved 37 ° C (figur 2F). Hvis en OD ₆₀₀ på 1,0 nærmer seg for fort, slå av varmeapparatet og shaker og åpne lokket for å kjøle kulturen og sulte bakterier for oksygen. Recommence oppvarming / risting når fag har blitt lagt til.

Herfra bruker filter barriere tips for å unngå fag krysskontaminering.

14. Når kolben er podet, sett fagen biblioteket (100 ul) i med proteiner, forsegle platen med plastfolie og inkuber ved værelsestemperatur i 1 time.
15. Ved 55 min, ta opp OD ₆₀₀ av cellene. Doblingstiden er omtrent hvert 20 min. Loven tilsvarende (se "Note" ovenfor).
16. Ved slutten av en time fjernes plastfolie fra platen og vasker ved utrysting av fagen i den transformerte avfall og deretter hurtig å legge 200 ul av 1 x TBST. (Bruk en multipipettor med en 1 = 100 mL hodet og pipettor satt på 2 [dvs. leverer 200 mL / stempelet depresjon] for dette, og det går fort). Sett en timer for 1 min. Etter 1 min, riste ut buffer inn forvandlet avfall, smack plate opp ned på papirhåndkle og sett tilbake på benk (25 ° C plate). Gjenta vasking trinn 10x.
17. Etter den ^10. vaske, ta 200 ul av BLT5403 celler fra 50 ml Falcon rør ved 4 ° C og sette dem inn i bunnen av brønnen hvorfra den siste vaskingen med TTBS er fjernet. Pakk platene i plastfolie og legg ved 37 ° C i 20 min for å få noen fag fortsatt fast til agn for å infisere bakterier (se merknad i diskusjonen om vedvarende hentet fag og / eller høy bakgrunn fra ukritisk bindende fag).
18. Ved slutten av 20 min, pakke platene og ta 10 ul bakterier fra BSA ved 25 ° C replikering en brønn, og sette den i 990 pl LB ^{100 AMP} merkede"1". Gjenta to ganger mer for at brønnen (rørene 2 og 3) som resulterer i tre triplicates av 1/100 fortynninger av phage fra at brønnen. Dette er BSA replikering en samplet tre ganger. Disse fortynninger vil bli brukt til å beregne den gjennomsnittlige titer ± SEM for at replikering av BSA.
19. Gjør det samme for replikering 2 og 3 av BSA (tre triplikatprøvene av 10 pl hver), for de tre replikerte brønner av den forgiftede lokkemat protein, og for agnet protein. Sett disse 27 Eppendorf-rør til side og får de resterende 170 ul av den infiserte bakterier i brønnene som vokser mot lysering.
20. Dersom bakteriene i kolben er ved OD ₆₀₀ = 0,6 til 1,0, dekanter 50 ml celler fra Fernbach kolbe inn i hver av de ni 250 ml Erlenmeyer-kolber. Ta de resterende 170 mL av fag-smittet BLT5403 bakterier i BSA replikering en godt og legge den til 50 ml celler merket "BSA Rep 1" (gul tape). Gjør dette for alle ni brønner og sette dem risting i inkubatoren (
21. Overvåk cellene i 37 ° C inkubering av shaker fra tid til annen for lysis (ca. 3 timer fra tidspunktet for inokulering). Gjør de fortynninger fra de 27 første fortynninger (10 ^-2) i de riktige, merket Eppendorfrør løpet av denne tiden.
22. For å utføre disse fortynninger fra de første 27 fortynninger fra 3.12 ovenfor, ta 100 mL av LB med bakterier fra Eppendorf tube 1 (BSA replikering ett, først av de triplikatprøvene fra denne 1/100 fortynning fra denne brønnen) og legge den til i 900 pl av LB i Eppendorf rør 4 (1 x 10 ^-4 fortynning av BSA replikering en første av de triplikatprøvene fra denne brønn).
23. Kast filter barriere spissen for en ny en før du får 100 mL av LB med bakterier fra Eppendorf tube 4 for å legge til 900 mL av LB i Eppendorf tube 7 (1 x 10 ^-5 fortynning av BSA replikering ett, først av tre eksemplarer prøver fra denne brønnen). Fortsett fortynningene (degen til en x 10 ^-6) for alle triplicates av alle reproduksjoner av alle proteiner og behandlinger (135 rør totalt).
24. Når cellene har lysert, bringe kulturen til 0,5 M NaCl ved tilsetning av 5 ml av et 5 M NaCl lager og overfør til en merket sentrifugeflaske.
25. Sentrifuger ved 8000 xg i 10 min ved 4 ° C. Dekanter supernatanten (virus) i en ren, steril 50 ml Falcon-røret.
26. Til noen få dråper kloroform til den dekanterte supernatant i Falcon-røret.
27. Oppbevar ved 4 ° C for neste runde av affinitet utvalg.

4. Dag tre

1. Autoklav eller bleke alt labware som har blitt brukt på å generere denne affinitet utvalg runde for å forberede seg til neste runde.

5. Titering

1. Antall som mange solide LB ^{100 AMP} plater som det er fortynninger i stigende rekkefølge (det skal nå være en plate for hver borsilikat rør og Eppendorf rør, hver med samme antall). Putca platene i en 37 ° C inkubator (figur 3D).
2. Smelt toppen agarose (1,0 g Bacto Tryptone, 0,5 g gjærekstrakt, 0,5 g NaCl, 0,6 g agarose, gjør til 100 ml, autoklav) ved å løsne den øverste agarose korken og vekselvis microwaving flasken og virvlende det å blande det før toppen agarose har helt smeltet. Plasser flasken i vannbad for å avkjøle til 50 ° C (figur 3E).
3. Ta en borsilikat 10 ml pipette med en pipette pumpe festet. Tenn en Bunsen-brenner. Slå en styrofoam Falcon rørholder eller kjøligere lokket opp ned på benken og plassere LB100 AMP plater 1 til 6 (frisk ut av 37 ° C inkubator) på den, Plate 1 øverste (Figur 4A). Styrofoam holder platene varm.
4. Sett 250 mL BLT5403 celler fra 4 ° C til hver av de nummererte borsilikat prøverør forberedt på dag én ovenfor (pkt. 3.7 og figurer 4B og 4C). Arspenner de nummererte borsilikat-rør i samme stigende serie i fortynningene i 1,5 ml Eppendorf-rør (figur 4A).
5. Sett 100 ul av fortynningen i Eppendorf rør 1 i 250 ul av celler i borsilikat reagensrør 1 (figurene 4D og 4E). Varm opp første fem i av pipetten over flammen litt (ikke for mye! ~ 3 swipes, figur 4F) og stupe inn i den smeltede toppen agarose. Trekk 3 ml og levere raskt inn i testrøret på toppen av celler / fagen (fig. 4G).
6. Bland ved å flikke med en finger mens du holder røret med den andre hånden (figur 4H) og helle innholdet på platen (figur 4I). Vippe plate og bruke testrøret til å jage bobler og tørre flekker inntil hele platen er dekket av den øverste agarose. Sett den til side, stående på benken til avkjøling.
7. Kast borosilicate tube, ta ut filteret barriere spissen, får enny en og fortsette inntil alle fortynninger er belagt. Hent LB ^{100 AMP} plater fra inkubatoren som de er tømt, men ikke mer enn seks om gangen, eller de avkjøles og toppen agarose stivner for raskt.
8. Når toppen agarose er solid, snu platene opp ned (det er viktig å gjøre dette). Ellers, agar / agarose "gråter", kondenserer på lokket, faller ned på den øverste agarose og løper over den, idet det fagen med den gjør det umulig å titer nøyaktig) og enten: 1) å sette platene i de 37 ° C inkubator [være tilbake fire timer senere for å telle titer som T7 er aggressive] OR: 2) La dem opp ned på benken og de er klare neste morgen for å telle titer.
9. Tar alle nødvendige forholdsregler for å beskytte mot glassplinter, eller skade hvis den gjør det, sette den øverste agarose korken tilbake på løst og mikrobølgeovn toppen agarose til det koker. Gjør dette to ganger. La den avkjøles, strammecap og sette det bort. Snu vannbad ned til sin vanlige temperatur eller slå den av. Sett fortynninger i 4 ° C kjøleskap. De vil være nødvendig for å tolke titere og / eller gjøre noe av titering.

6. Fastsettelse og Beregning Titer

1. Undersøk plakk dannes på platene, og forkaste de som konfluent lyse (figur 5A eksempel 10 ^-2 fortynning). Bestem hvilke av de gjenværende seriefortynning har produsert nok få plakett for å muliggjøre en nøyaktig oversikt (figur 5A en nd 5B). Registrere antall plakk fra disse platene (tabell 1; Figur 5B).
2. Multiplisere antall plakk ved fortynning og deretter multiplisere dette tallet med 100 for å få antallet plakkdannende enheter per ml av infiserte bakterier som tas fra brønnene (dvs. kun 10 pl av infiserte bakterier ble tatt for hver av de triplicates og so dette må multipliseres med 100 for å få tellinger pr ml). Gjennomsnittlig antall Plaque Forming Units (PFU) per milliliter, (PFU / ml ufortynnet infiserte bakterier tatt ut av mikrotiterplate vel), på tvers av de tre triplicates tatt fra denne brønnen.
3. Danne en Grand Gjennomsnittet av tallies for de tre replikat brønner og beregne standardfeilen for dette gjennomsnittet (tabell 1). Dette er hva som vil bli tatt opp i figuren av økningen i fag titer for hver affinitet utvalg runde og behandling (figur 5C).

7. Plakk Isolation, PCR, og sekvensering

1. Ved slutten av affinitet valg runde 4 velger 18 individuelle, veldefinert, plakk kolonier, og ved hjelp av en steril Pasteur-pipette, tannpirker, gul pipettespiss eller tilsvarende innretning, kjerne disse plakk fra titering platene. Ved å bruke rør eller tips, først fukte innsiden med Tris-HCl, pH 8,5 i Eppendorf rør (fig. 5D).
(figur 5E). Slipp pære med pipettespissen fortsatt i agar / topp agarose og suge opp kjernen (Figur 5F, se pilen).
2. Utvise kjernen inn i 100 pl Tris-HCl, pH 8,5 i den aktuelle røret (figur 5G) og vortex kort.
3. Varm 20 ul fra dette volum ved 65 ° C i 10 min.
4. Sentrifuger det oppvarmede volum på 13 000 xg i en bordsentrifuge ved romtemperatur i 10 min. Ta 3 pl av supernatanten av denne prøve for å bli brukt i PCR-reaksjoner med T7-OPP-og NED-T7-primere.
5. For hver av de 18 isolerte plakk, oppvarmede løsninger, få en 50 pl PCR-reaksjon ved bruk av en glødetemperatur på 58 ° C og 35 sykluser.
6. Kjør 20 mL av EACh reaksjonen på en 1% (w / v) agarosegel inneholdende 0,015% (v / v) etidiumbromid. Visualiser med en transilluminator ved hjelp av egnet øyebeskyttelse og nitril lab hansker. (OBS: etidiumbromid er en potent mutagen.) Fotografere gel og kast forurensede materialer riktig (Fig. 6A og 6B).
7. Dersom amplikonene er enkeltprodukter, og ikke fra tom vektor (produktet går i nærheten av 100 bp på en 1% (w / v) TAE-agarosegel, figurene 6A og 6B piler), vaske de gjenværende 30 ul for anvendelse som en mal for sekvensering. Hvis ikke et enkelt produkt i gelen (fig. 6B, plakk 15), skjære ut den mest fremtredende bånd (r) fra gelen og ekstrahere DNA fra gelen ved hjelp av en kit.
8. Sequence de amplicons som ikke er tomme vektorer ved hjelp av T7-UP primer.
9. Undersøk hver sekvens etter linker armene, og fra denne informasjonen, bestemme hvor oppstart av innsatsen er plassert. Bruk Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; National Library of Medicine) for å fastslå identiteten til den kodede cDNA, enten innsatsen er i rammen, og hvis så, har andelen av protein kodende sekvens (CDS) blitt vist og tatt til fange av åte.

Representative Results

Å være i stand til å nedsette evnen av agnet til å interagere med phage-tall proteiner (metabolsk forgiftning agnet) er et potent negativ kontroll for denne teknikken. Det er også tilrådelig å fastslå om agnet, når bundet til mikrotiter-plate-brønn, beholder sin funksjon. Begge disse kontrollene vil øke tilliten som samhandlende, fagplakker-vises proteiner utvinnes av nonpoisoned agn er legitime.

Prøvetaking tre triplicates fra hver brønn legger vesentlig til tid og arbeid involvert i matching utvalg, men gir en mer nøyaktig estimat av titer innenfor hver brønn enn prøvetaking bare én gang. Mens de fleste av titere for triplicates er i god avtale, oppmerksom på at triplicates for replikering to av BSA i runde fire variere mye (Tabell 1). Ved prøvetaking flere ganger, de endelige beregnede tallies er ikke så utsatt for pipettering feil og et mer nøyaktig estimat av than faktisk titer og variasjonen rundt dette anslaget, godt å vel, oppnås (tabell 1, figur 5C).

Økende fag titer, fortrinnsvis for den nonpoisoned agn, som antall affinitet utvalg runder øker, gir også tillit til at teknikken fungerer (figur 5C). Oppbevaring av en økende andel av fag som inneholder innsats i nonpoisoned agn brønner som antall affinitet valg økninger er også lykkebringende (Fig. 6A og 6B).

Etter avanserte runder affinitets valg, en økning i antall uavhengig utvinnes fagen som har innsats (merkbar som PCR amplikoner større i størrelse enn ~ 100 bp, figur 6B), i forhold til den første runden (figur 6A), og settling av disse amplicons på noen identisk band (note baner 5-9, 11-18 i figur 6B </ Strong>), er en god indikasjon på at spesielle kloner blir valgt i affinitet utvalget (Fig. 6A og 6B). Etter sekvensering av flere av plakk oppnådd i det endelige affinitet valg rund, er henting av en lignende region (forskjellig kloner) av det samme protein uavhengig bekreftelse på at den del av det fremviste proteinet har en bona fide affinitet for agnet. Disse uavhengig utvinnes fag også gi informasjon om hvilken del av hele proteinet er i stand til å kommunisere med agn. Dersom fag vises cDNA bibliotek har blitt bygget ved hjelp av tilfeldig priming, kan et stort mangfold av delvis og full-lengde-protein dekning påregnes (innenfor rammene av fag å tolerere cDNA innsetting størrelse), som fører til flere, uavhengige kloner som dekker den samme delen av proteinet. Selv de sammenhengende out-of-frame treff bør granskes for å finne ut om de kode et lignende motiv som BAdet binder. (Dette forutsetter at bibliotekene ikke ble konstruert ved hjelp av ORF-teknologi ^3).

Tabell 1.. Beregninger for den gjennomsnittlige titer / ml infiserte bakterier fra brønnene til den fjerde runden med affinitet valg for de tre behandlinger. Tallene for hver tre eksemplarer av 10 ^-3 fortynning av plakk tatt fra det første replikering av agnet godt er tatt fra figur 5B. Klikk her for å vise større bord .

Figur 1. Generell grafisk fremstilling av fag display-prosessen A) tilgang til et fag-bibliotek som vises, fortrinnsvis utført ved hjelp av tilfeldig primet, utvalgt poly-A RNA, for å generere cDNA-ender, og B) et agn som er, i den utstrekning det er mulig, som kontrollerbar biologisk aktiv, selv når det er immobilisert på en fast bærer og, om mulig, gjøres inaktiv ved tilsetning av en inhibitor (for eksempel kompetitivt inhibert fra binding agn protein). RT: revers transkripsjon.

.. Figur 2. En del av utstyr og materiale som er nødvendig for utførelse av fag display-steril teknikk krever tilgang til begge: A) en autoklav, og, b) en laminær strømningshette. Fag-biblioteker og BLT5403 bakteriell lager krever -80 & # 176, C-temperaturer for lengre lagrings C) Dyrking fagen og bakterier krever, DF) 37 ° C inkubator, hvorav den ene, EF) er i stand til å vokse flytende kulturer (orbital). Optimalisere eksperimentet gjennom fargekoding, F) minimerer feil. BLT5403 celler for titering kan lagres i opp til en uke, G) ved 4 ° C. Optimal plassering av, H) spektrofotometer for å følge celletetthet ved siden av den bane rundt shaker kan spare tid. Ofte behandling av overflater og pipetter med, jeg) kraftig vaskemiddel og J) Envirocide, kan bidra til å minimere risikoen for viruskontaminasjon. Klikk her for å se større bilde.

85fig3.jpg "fo: src =" / files/ftp_upload/50685/50685fig3highres.jpg "/>
Figur 3. En mulig konfigurasjon nyttige for å tillate jevn affinitet markering. A) BLT5403 er dyrket en dag eller to før titering og er belagt, uten viral innføring, for å fastslå at de ikke er kontaminert med virus. Titering på dagen av den affinitet utvalget kan gjøres lettere ved å forberede på forhånd av: B) prelabeling Eppendorf og, C) borsilikat rør som skal brukes B) Aliquoting utvannings løsninger av LB ^100AMP og lagre dem ved 4 ° C over natten D.. ) Plasser prenumbered, LB ^100AMP agar-inneholdende, Petri-skåler ved 37 ° C for å varme omtrent 1 time før titering. E) Smelte den sterile topp agarose (løsne hetten) og plassere den i en på forhånd oppvarmet 50 ° C vannbad for å avkjøle på denne temperatur en time før titering starter. Bruk en leannonse donut å unngå flasken kantring som topp agarose er fjernet. Klikk her for å se større bilde.

Figur 4 Titering fagen utvinnes fra en runde med affinitet utvalg.. Plette begynner så snart som mulig etter infeksjon for å hindre kunstig oppblåsning av titer. A) Et første sett av virus-infiserte BLT5403 fortynninger og borsilikat-rør montert i stativene. Ved hjelp av filter barriere tips: BC) 250 mL BLT5403 celler fra lager fra 4 ° C blir overført til borsilikat rør. Ved hjelp av filter barriere tips: DE) The BLT5403 i første borosilicate tube er infisert med first virus fortynning. F) Den borsilikat pipette blir oppvarmet over en åpen flamme for å hindre tilstopping og for å holde den øvre agarose varm. . Ikke varm pipetten overdrevet eller bakterier vil bli skåldet og dø G) 3 ml smeltet topp agarose er raskt hentes og helles over bakteriene i borsilikat tube H) Røret er knipset kort for å blande innholdet og;. Jeg) Innholdet helles over i forvarmet ^100AMP LB agar plater, ved hjelp av røret til å bevege seg bobler til sidene av platen, og for å sikre den øvre agarose dekker hele platen. for å vise større bilde.

Figur 5. Typisk titer resultater. A) De lavere fortynninger (10 ^-2) nesten alltid resultere i sammenflytende lysering for alle behandlinger i den første affinitet valg runde (viruset i figuren er blitt dyrket altfor lang resulterer i overdreven plakkstørrelse for å lette fotografier). B) De aktuelle fortynninger av plakk telles ved hjelp av en tusj å holde styr på telt plakk. C) titer øker drastisk for agn brønner mens resterende mer eller mindre stabil for BSA eller forgiftet åte. I senere runder, er titer fra agn brønner platåer og ytterligere utvalg affinitet uproduktivt. D) En godt isolert plakk har blitt valgt for sekvensering og samlet inn ved å fukte beite pipette med løsningen fra Eppendorf tube, være sikker på å fjerne overflødig væske minst det løpe over multiple plakk og forurense kjerne. E) Pipetten er blitt presset gjennom plaque med pipette bulb som allerede er komprimert. F) Pæren er frigitt, mens pipetten fremdeles er i den øverste agarose, suger plakk opp inn i pipetten (pil). G) Den cored plakk er i ferd med å bli levert inn i væsken i den respektive Eppendorf-rør. Fagplakker fortynninger (volum av infiserte bakterier per volum av LB ^100AMP) er avbildet på petriskåler (f.eks 10 ^-3 = 1/1, 000 fortynning). De tre triplikatprøvene fra replikering vel en forkortes som Trip. 1, Trip. 2, og Trip. 3, alle for replikasjon 1 (Rep 1 = vel 1). Tallene i bunnen av platene i B) er de faktiske plaque stemte tall på platene. Disse er for de 10 ^-3 fortynning av bakterier fra den fjerde runden av affinitet utvalg (R4 i figuren) over agnet. Klikk her for å se større figur .

Figur 6. Typiske PCR-resultater for affinitet valg over en passende agn. A) Andelen tom vektor plakk (piler) er vanligvis ganske høy i utgangspunktet, men, i agn brønner; B) reduseres i påfølgende runder. Plakett som inneholder innsatsen har hatt en tendens til å slå seg ned på de som inneholder identisk innsats i denne senere affinitet utvalg runde. MWM: Molecular Vekt Marker.

Discussion

Ved å kjøre forsøket i tre replikerte brønner, kan uavhengig ervervet phage av samme proteinbinding til agn skilles selv om de er de samme klon (dvs. ingen forskjell i nukleotid-sekvensen til det CDS region som er blitt ervervet, men disse har vært hentes fra uavhengige brønner). Hvis ikke, er den eneste måte å skille blant fag som koder for den samme proteinbinding til agn hvis de uavhengig er omvendt transkriberte regioner som er forskjellige på en eller annen del av nukleotid-sekvensen.

Bruken av en Fernbach kolbe til å vokse alle bakterier for bruk ved forsterkning av affinitet valgt phage tillater en mye mindre hektisk kontroll av bakterievekst som fører opp til infeksjon etter affinitet valg enn å prøve å overvåke 9 Erlenmeyer-kolber. Dekantering disse bakteriene, like før smitte, inn i forvarmet kolber eliminerer også sublibrary titer avvik som skyldes alterasjoner i multiplisitet for infeksjon på grunn av dårlig bakterievekst i bestemte kolber. Således bør endringer i fag-titeret fra runde til runde avhenge av antallet av fagen holdes tilbake i brønnene, og variasjonen i titer mellom replikerte brønner bør være minimal.

En enestående fordel ved å bruke fag-skjerm er det stor kraft teknikken har i å identifisere fag-tall-protein som har en affinitet for et bestemt agn. På grunn av effektiviteten med hvilken fagen replikere i BLT5403 vert, og med en enkelt-fag som representerer en sjelden CDS som holdes tilbake i en brønn i den første affinitet valg runde, skal coat-sammensmeltet protein som har en høy affinitet for agnet, skal være representert i den andre runden med mye større tall. Ved den fjerde runden, bør denne phage utgjør majoriteten av fagen til stede i den lyserte kultur.

Denne kapasiteten av fagen til å replikere i høy titer er også en begrensning av teknikkennique. Hvis en bestemt agn har et samspill protein partner som den har høy affinitet i biblioteket, er det svært vanskelig å fange opp proteiner som kan legitimt binder agnet, men til en lavere affinitet da disse vil ha en tendens til å bli utkonkurrert av den høye affinitet bindende protein . Bruken av neste generasjons sekvensering teknikker for å identifisere slike sjeldne fag er en mulig måte å omgå denne begrensningen ^en. Videre mottakelighet av BLT5403 til T7 fagplakker resulterer i anfall av "forurensning" i hele lab som krever utholdenhet, heller tøffe decontaminants (f.eks Envirocide) og utmerket steril teknikk for å overvinne. Forurensning kan resultere i et betydelig tap av tid i fremdriften av affinitet utvelgelse som man forsøker å identifisere og eliminere kilden.

Et virkemiddel som har begrenset suksess i partisjone fag inn i trange og løse "permer" er å prøve og komme seg løs permer første by innføre i brønnen en oppløsning (1% SDS eller tilsvar chaotrope) er utformet for å fjerne phage som er mindre tett bundet til agnet. Denne oppløsningen kan deretter bli fjernet først, før innføringen av bakteriene inn i brønnene som er antatt å være infisert av disse phage gjenværende bundet til agnet. Denne teknikken kan også redusere bakgrunns, spuriously binding phage, betraktelig. Men hvis denne teknikken er forfulgt, er antall sublibraries, gjentak og duplikater affinitet valgte i senere runder doblet, som legger vesentlig til tid og kostnader.

Etter løpet av fag-titeret økning over flere runder affinitets valg kan drives gjennom et stort volum av LB, og et stort antall LB ^{100 AMP-plater,} filter barrieretips, Eppendorf-rør el. Dette er dyrt som er sekvenseringen som kreves for å undersøke med et beskjedent antall fag. Titering et stort antall fortynninger av flere kopier av treatments i triplikat krever betydelig tid, slik at betydningen av å sette opp så mye av materialet som mulig dagen før affinitets-valget er av vesentlig betydning.

En praktisk mulighet for at for tiden blir utforsket, er å benytte plasseringen av de uavhengige fag-proteiner, binding til et åte, for å modellere de fysiske egenskaper og den tredimensjonale struktur av regionen av proteinet i samspill med agnet. For eksempel å undersøke egenskapene til protein mål som er bundet til et sett av homolog Late embryogenese Rikelig (LEA) proteiner fra Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) og soyabønner (Glycine max), en viktig konklusjon var at LEA proteiner bundet til den regionen i proteiner som var mest mulig (eller blant de) hydrofile av de bindende proteiner ^11. Retrospektivt, gitt at Lea proteiner er antatt å beskytte sin klient molekyler fra denaturering under dehydrering, kan det være surmised at regionen av klient molekyler mest utsatt for dysfunksjon uten LEA beskyttelse kan være de som er mest i stand til å binde vann (hydrofile).

Det er tilrådelig å minimere tiden mellom innføringen av bakteriene inn i brønnene og deres gjenfinning slik titer ikke er oppblåst. Påse at fortynninger er tilstrekkelige ved plettering uten noen BLT5403 viral infeksjon for å bekrefte at den bakterielle lager ikke er forurenset, og at de største fortynninger er tilstrekkelig til å unngå sammenflytende lysering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	Becton Dickinson Co.	211705
Yeast Extract	Becton Dickinson	212750
Agar	Becton Dickinson	214010
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Agarose	Research Products International	A20090
Blocking Reagent	EMD Chemicals Inc.	69064
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-212
Sodium Dodecyl Sulfate	Fisher Scientific	BP166-500
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Escherichia coli BLT5403	EMD Chemicals Inc.	BLT5403	Genotype: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicillin, Sodium Salt	Research Products International	A40040
Ethidium bromide	Fisher Scientific	BP102-1
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich Corp.	A-9647
Penta-HIS primary antibody	Qiagen Inc.	34660
Goat anti-mouse alkaline phosphatise conjugate	Sigma-Aldrich Corp.	A-5153
para-Nitrophenylphosphate	Sigma-Aldrich Corp.	N-7653
T7-UP primer	EMD Chemicals Inc.		5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'
T7-DOWN primer	EMD Chemicals Inc.		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'
Qiaquick PCR Purification kit	Qiagen Inc.	28104
Qiaquick Gel Extraction kit	Qiagen Inc.	28706
Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit	Invitrogen Life Technologies	4336917
Heating Block	Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)	18780
96-well Cell Culture Plates	Corning	Costar 3590
Isotemp Incubator Oven	Fisher Scientific	516D
Pasteur Pipettes, 5 ¾ in	Fisher Scientific	13-678-20A
ChromaView Transilluminator	UVP Inc.	TS-15
UV Shield	Oberon	071AF
Gloves, Nitrile	Fisher Scientific	19-170-010C
Sterile 1.5 ml tubes	USA Scientific Inc	1615-5500
10 ml Borosilicate Pipettes	Fisher Scientific	13-678-25E
Borosilicate culture tubes	Fisher Scientific	14-961-27
Uniskan I, ELISA plate reader	Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland	Type 362