Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

पुनः संयोजक प्रोटीन फँसाना चाहे का उपयोग फेज प्रदर्शन और आत्मीयता चयन के लिए एक प्रोटोकॉल

Published: February 16, 2014 doi: 10.3791/50685
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Horticulture, University of Kentucky

Summary

फेज प्रदर्शन ब्याज की एक स्थिर अणु के साथ बातचीत कि प्रोटीन या प्रोटीन moieties कब्जा करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है. बनाने के लिए फेज सीडीएनए लाइब्रेरी के प्रकार और स्क्रीन के एक निर्णय लिया गया है, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल interactors की पहचान करने के लिए अग्रणी कुशल आत्मीयता चयन परमिट.

Abstract

Immobilized चारा अणुओं को एक directionally क्लोन सीडीएनए पुस्तकालय द्वारा इनकोडिंग विभिन्न प्रोटीन अंश पेश करने के लिए एक पाड़ के रूप में पुनः संयोजक फेज का उपयोग कर बातचीत की खोज के लिए एक कारगर साधन है. तकनीक काफी हद तक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की खोज करने के लिए इस्तेमाल किया गया है लेकिन चुनौती नहीं दी जा चारा अणु प्रोटीन तक ही सीमित नहीं होना चाहिए. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल फँसाना की एक मामूली संख्या में एक ही प्रोटीन पेश स्वतंत्र क्लोन की पहचान को अधिकतम करने के लिए replicates में जांच की अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया है. यह पहचान की बातचीत प्रोटीन चारा अणु की वैध interactors हैं कि अधिक से अधिक आत्मविश्वास परमिट. प्रत्येक आत्मीयता चयन के बाद फेज अनुमापांक निगरानी दौर आत्मीयता चयन नकारात्मक नियंत्रण की प्रभावकारिता पर और साथ ही चल रहा है के बारे में जानकारी प्रदान करता है. एक फेज titering, और कैसे के साधन और क्या इस प्रक्रिया के रूप में कुशलतापूर्वक के रूप में प्रगति करने के लिए अनुमति देने के लिए पहले से तैयार करने के लिएसंभव है, प्रस्तुत किया है. स्वतंत्र पट्टिका का अलगाव निम्नलिखित पुनः प्राप्त amplicons के गुण आत्मीयता चयन प्रगति की है कि कैसे अच्छी तरह से पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि डाला जाता है. मुसीबत झूठी सकारात्मक कम करने के लिए या लगातार फेज बरामद बायपास करने के लिए तकनीक की शूटिंग व्याख्या कर रहे हैं. वायरल संदूषण भड़क अप को कम करने के साधन चर्चा कर रहे हैं.

Introduction

क्यों बजाय अन्य अणुओं के साथ प्रोटीन बातचीत की खोज और जांच के लिए उपलब्ध असंख्य अन्य तकनीकों के फेज प्रदर्शन और आत्मीयता चयन का उपयोग करें? फेज प्रदर्शन निम्नलिखित सहित प्रोटीन ligand बातचीत 1-3 पता लगाने के अन्य तरीकों पर कुछ अद्वितीय लाभ का दावा कर सकते हैं:

चारा अणुओं की बहुत व्यापक प्रदर्शनों की सूची

सबसे प्रमुख कारण आत्मीयता चयन 4 में चारे के रूप में कार्य करने में सक्षम अणुओं की विविधता में है. फेज प्रदर्शन एक बहुलक / अणु एक वसूली का समर्थन करने के लिए संलग्न किया जा सकता है, तो अनिवार्य रूप से, यह फेज प्रदर्शित प्रोटीन के साथ आत्मीयता के लिए जांच की जा सकती अन्य प्रोटीन, न्यूक्लियोटाइड, कार्बोहाइड्रेट, 5 आदि के साथ बातचीत कि प्रोटीन टुकड़े को अलग करने का एक बहुत शक्तिशाली माध्यम है. स्थितियां आर करने के लिए इस्तेमाल किया ही, यदि चारा अणु, 6 immobilized जब यह जैविक गतिविधि को बरकरार रखे हुए निर्धारित करने के लिए पहुँचा जा सकता हैअपनी गतिविधि को खत्म / निष्कर्ष निकालना पूर्व आत्मीयता चयन करने के लिए प्रलोभन करने के बाद translational संशोधनों को पेश करने के लिए, 6 प्रभावी या कर रहे हैं.

बाहरी कारकों के फेज प्रतिरोध

फेज प्रदर्शन का उपयोग कर के लिए एक दूसरा कारण, यह कुछ फँसाना चाहे उनकी बातचीत के प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए पर्यावरण के तनाव (गर्मी, उच्च osmolyte सांद्रता, विशिष्ट cofactors, आदि.) की आवश्यकता हो सकती है कि संभव है कि है, या फेज प्रदर्शित प्रोटीन किसी तरह बदला जा करना पड़ सकता है आत्मीयता चयन करने से पहले. अध्ययन किया जा रहा प्राथमिक कारक चारा और प्रोटीन, नहीं यह परीक्षण जीव के लिए घातक है अगर बातचीत होने की अनुमति देता है या कि हालत के बीच बातचीत है. यह (T7 व्यवहार्यता के लिए प्रकाशित थर्मल अधिकतम ~ 60 डिग्री सेल्सियस 7 है उदाहरण के लिए) बरकरार है और व्यवहार्य दोनों कठोर प्रयोगात्मक परिस्थितियों का सामना कर सकते हैं क्योंकि T7 फेज इस तरह के अध्ययन के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है. फेरबदल फेज का एक उदाहरण समर्थक प्रदर्शितमरम्मत एंजाइम प्रोटीन substrates के लिए Arabidopsis thaliana बीज proteome की जांच जब teins, प्रोटीन Isoaspartyl मिथाइल Transferease (PIMT), इन अध्ययनों में इस्तेमाल वायरस परिचय प्रोत्साहित करने के लिए, पहले प्रत्येक आत्मीयता चयन करने के लिए दौर, एक सप्ताह के लिए "वृद्ध" किया गया था isoaspartate की (isoAsp) को समझते हैं और मरम्मत / ऐसी असामान्यताओं metabolize सकता है कि जीवों में संभव नहीं है जो अतिसंवेदनशील प्रोटीन 6 में अवशेष.

Metabolically निष्क्रिय

इसके अलावा, फेज आमतौर पर चयापचय जहर और, कम से कम, metabolically सक्रिय परीक्षण जीवों पर pleiotropic प्रभाव में नतीजा होगा कि छोटे अणुओं हस्तक्षेप करने के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. तंगी washes के बाद, जहर जहर बैक्टीरिया या बाद में फेज प्रतिकृति को अहानिकर एक श्रृंखला के लिए पतला है तो बैक्टीरिया की एक बड़ी मात्रा संक्रमण के लिए पेश कर रहे हैं से पहले हटा दिया जाता है. PIMT मरम्मत के लिए प्रोटीन लक्ष्य है जबकि जांचएंजाइम, एस adenosyl Methionine (AdoMet) एंजाइम को निष्क्रिय करने और एक उपयोगी नकारात्मक नियंत्रण में सुरक्षित प्रदान करने के लिए एस adenosyl homocysteine ​​(AdoHcy) पर निर्भर है, जबकि लक्ष्य प्रोटीन कब्जा अनुमति देने के लिए माइक्रो अनुमापांक प्लेट अच्छी तरह से स्थिर एंजाइम सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल किया गया था वायरस प्रतिकूल AdoMet या AdoHcy 6 या तो द्वारा प्रभावित नहीं होगा कि ज्ञान. साथ ही, इस प्रयोगशाला में जांच कुछ देर Embryogenesis प्रचुर मात्रा में (एल ई ए) प्रोटीन परिवारों के सदस्य, बिंदु पर सोयाबीन के बीज में 200 मिमी के रूप में उच्च सांद्रता प्राप्त कर सकते हैं जो ऐसे sucrose के रूप में 8 additives, की उपस्थिति में उनके आकार में परिवर्तन करने के लिए जाना जाता है शारीरिक परिपक्वता 9 की. वायरस को स्वतंत्र रूप से व्यावहारिक परीक्षण जीवों 10 के लिए ऐसा नहीं है जो कुछ एल ई ए के ग्राहक प्रोटीन बातचीत के लिए संभवतः आवश्यक प्रत्येक आत्मीयता चयन दौर, में 200 मिमी sucrose के अलावा द्वारा प्रभावित होने की उम्मीद नहीं है.

इस प्रयोगशाला discoverin पर ध्यान केंद्रित किया हैजी प्रोटीन प्रोटीन निर्जलीकरण 11 या बीज 6 आत्मसात किया है एक बार isoAsp गठन के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं कि संग्रहीत proteome के घटकों की मरम्मत के दौरान संग्रहित proteome सुरक्षा का तंत्र कायम करना है कि परिपक्व, निर्जलित या germinating बीज में बातचीत. इस प्रकार, उत्पादन और शोधन के एक सक्रिय राज्य में चारे के रूप में आवश्यक पुनः संयोजक प्रोटीन की, और वे स्थिर रहे हैं और इससे पहले के बाद अक्सर मुश्किल, हमारे काम करने के लिए एक आधार है, हालांकि वे, तो रहना सुनिश्चित करना है कि. प्रत्येक पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन परिदृश्य अलग है लेकिन, जैसा कि पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए अनुकूलन की स्थिति यहां संबोधित नहीं किया जाएगा. उपयोगकर्ता (यह एक एंजाइम है अगर microtiter प्लेट कुओं में एक एंजाइम परख करते हैं, उदाहरण के लिए) immobilized प्रोटीन अभी भी कार्य है, यह निर्धारित करने के लिए, जहां भी संभव हो, प्रयास करने के लिए आग्रह कर रहे हैं. यह किसी भी खोज की बातचीत कर रहे हैं कि, चारा इसलिए जैविक रूप से सक्रिय है और कुछ विश्वास है कि प्रदान करेगाजैविक प्रासंगिकता है करने के लिए कुछ और अधिक होने की संभावना है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

बी) एक शुद्ध रीकॉम्बीनैंट चारा, एक) एक फेज प्रदर्शन सीडीएनए चारा के लिए आत्मीयता के साथ सांकेतिक शब्दों में प्रोटीन की संभावना पुस्तकालय और: (चित्रा 1) नीचे वर्णित प्रक्रिया का एक ग्राफिक चित्रण एक फेज प्रदर्शन पुस्तकालय का उपयोग कर आत्मीयता चयन के लिए दो प्राथमिक घटकों पर प्रकाश डाला गया प्रोटीन. चारा (पुनः संयोजक प्रोटीन) का उत्पादन बड़े पैमाने पर जांच की गई है और साहित्य ई. से घुलनशील, सक्रिय पुनः संयोजक प्रोटीन हासिल करने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं की रूपरेखा कोली 12-13, यूकेरियोटिक खमीर 14, कीट 15-16, संयंत्र 17-18, या स्तनधारी 19-20 कोशिकाओं लाजिमी है.

निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, एक hexahistidyl पुनः संयोजक प्रोटीन चारे के रूप में इस्तेमाल किया गया है टैग किया. यह चारा प्रोटीन रात ऊष्मायन और धोने कदम के बाद कुओं में रहते हैं कि सत्यापन की अनुमति देता है.

1. Microtiter प्लेट वेल्स में पुनः संयोजक प्रोटीन बनाए रखने के लिए एलिसा

  1. मार्क एकस्थायी स्याही, और कुओं जो प्रोटीन सांद्रता में शामिल होंगे जो नामित साथ microtiter प्लेट. कुओं की 3 अनुकरण में इस कार्य करें. (; बीएसए इस पृष्ठभूमि की जाँच के रूप में अच्छी तरह से काम करता है गैर hexahistidyl टैग प्रोटीन) एक नकारात्मक नियंत्रण एकाग्रता श्रृंखला के 3 अनुकरण शामिल करें.
  2. पानी के साथ बड़े पैमाने पर प्लेट धो लें और उल्टा washes के बीच 4 परतों कागज तौलिया पर थाली smacking से पानी निकाल दें.
  3. Tris, 7.5 पीएच, (पसंद का या बफर) पुनः संयोजक प्रोटीन (10 माइक्रोग्राम / एमएल) के सर्वोच्च एकाग्रता के 100 μl में, पहले 3 कुओं में, स्थिर. अगले तीन कुओं को नीचे 1.0 एनजी / एमएल आदि (1.0 माइक्रोग्राम / एमएल), पर पुनः संयोजक प्रोटीन, जोड़ें. बीएसए एकाग्रता श्रृंखला के साथ भी ऐसा ही.
  4. प्लास्टिक की चादर के साथ बर्तन कवर और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ दें
  5. अगली सुबह, उल्टा 4-5 परतों कागज तौलिया पर थाली smacking द्वारा प्रोटीन को हटा दें.
  6. धो कुओं बफर छोड़ने, टीबीएस 1x 200 μl प्रत्येक समय के साथ 5x~ 1 मिनट प्रत्येक समय और उल्टा प्रत्येक धोने के बाद कागज तौलिए पर थाली smacking द्वारा बफर धोने को दूर करने के लिए कुओं में.
  7. (W / v) बीएसए या 200 μl 5% 200 μl 5% का उपयोग कर एक रोटरी प्रकार के बरतन पर एलिसा थाली ब्लॉक (w / v) 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर टीबीएस में अभिकर्मक अवरुद्ध (या 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रात भर बैठे सुविधाजनक अगर ) प्लास्टिक की चादर में लपेटा.
  8. उल्टा कागज तौलिए पर थाली smacking द्वारा अतिरिक्त अवरुद्ध समाधान निकालें. उल्टा थाली smacking से धोने के समाधान को हटाने, 1x टीबीएस के 200 μl साथ 4x 1 मिनट हर बार धोएं.
  9. अवरुद्ध बफर में Penta-उनकी प्राथमिक एंटीबॉडी 1/2, 000 पतला और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 100 μl उद्धार. थाली स्थिर साथ कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे सेते हैं.
  10. उल्टा कागज तौलिए पर थाली smacking द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें. 1x TBST के 200 μl के साथ 4x 1 मिनट हर बार धोएं. उल्टा थाली smacking द्वारा प्रत्येक धोने निकालें.
  11. माध्यमिक एंटीबॉडी पतलाअवरुद्ध बफर और प्लेट स्थिर साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्रत्येक कुएं में 100 μl सेते में (बकरी विरोधी माउस alkaline फॉस्फेट संयुग्म),.
  12. उल्टा कागज तौलिए पर थाली smacking द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें. 1x TBST के 200 μl के साथ 4x 1 मिनट हर बार धोएं. उल्टा थाली smacking द्वारा प्रत्येक धोने निकालें.
  13. प्रत्येक कुएं में पैरा nitrophenylphosphate (pNPP) सब्सट्रेट समाधान के 200 μl रखें. सब्सट्रेट तो aliquots बनाने के लिए और यह पूरी तरह से इस स्तर से thawed है इतनी अच्छी तरह से समय से आगे फ्रीजर के बाहर का पता लगाने के लिए आवश्यक aliquots की अपेक्षित संख्या प्राप्त -20 डिग्री सेल्सियस पर एक ठोस है.
  14. 30 मिनट में अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 3 एम NaOH के 50 μl जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो.
  15. तुरंत एलिसा प्लेट रीडर पर 405 एनएम पर absorbance पढ़ें.

नोट: ब्याज की पुनः संयोजक प्रोटीन कुओं को संलग्न नहीं करता है, यह वें को बदलने के लिए संभव हैई रचना / बफर का पीएच काफी (कार्बोनेट बफर पीएच 10.0) या microtiter प्लेट वेल्स को प्रोटीन कुर्की की सहायता के लिए प्रयास करने के लिए chaotropes (यूरिया) जोड़ें. 2) उच्च पीएच / chaotrope को निकालने के बाद अपने जैविक गतिविधि को बरकरार रखे हुए सिफारिश की है; 1) आत्मीयता चयन के लिए शर्तों के तहत microtiter प्लेट वेल्स को बाध्य बनी हुई है और: हालांकि, पुनः संयोजक प्रोटीन है कि फिर से स्थापित.

2. Titering के लिए बैक्टीरियल होस्ट (BLT5403) बढ़ रहा है

  1. आटोक्लेव (2A चित्रा) दस 250 मिलीलीटर Erlenmeyer बोतल और 3 संस्कृति ट्यूबों. लेग तरल और ठोस मीडिया प्लेटों डालने का कार्य के लिए लेग अगर बनाओ. कूल लेग 50 डिग्री सेल्सियस के लिए अगर और पहले asceptically एक प्रवाह हुड (चित्रा 2 बी) में पेट्री डिश में डालने के लिये 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन जोड़ें.
  2. इसके अलावा एक प्रवाह हुड (चित्रा 2B) लकीर एक लेग में, स्टॉक से BLT5403 के एकल कालोनियों के लिए 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन (लेग AMP100) अगर प्लेट 15% में रखा (v / v)-80 डिग्री सेल्सियस (चित्रा -2) में ग्लिसरॉल. विकास के लिए एक मशीन (चित्रा 2 डी) में 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर उल्टा प्लेट रखें.
  3. सुबह में, थाली से उठाया एक ही कॉलोनी के साथ एक 250 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में 50 मिलीलीटर लेग AMP100 टीका लगाना. 37 डिग्री सेल्सियस, एक क्षैतिज प्रकार के बरतन (आंकड़े 2 ई और 2 एफ) में 200 rpm पर सेते हैं, और = 0.5-0.6 (चित्रा 2H) 600 आयुध डिपो में सेल घनत्व पर नजर रखने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें.
  4. एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब या इसी तरह की कोशिकाओं डालो, और उपयोग चित्रा (2 जी) तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखना. कोशिकाओं आमतौर पर ~ 1 सप्ताह के लिए व्यवहार्य रहेगा.
  5. 500 मिलीलीटर लेग बनाओ, एक चकित Fernbach फ्लास्क में डाल दिया है और यह आटोक्लेव. यह बाँझ है एक बार, नीचे "एक दिन" की रात तक 4 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2 जी) या कमरे के तापमान पर कुप्पी जगह है.

नोट: मेजबान बैक्टीरियल कोशिकाओंBLT5403, T7 मध्य, और कम प्रतिलिपि वैक्टर सफलतापूर्वक नकल नहीं कर सकते जो बिना T7 देशी capsid प्रोटीन की एक प्लाज्मिड जनित स्रोत व्यक्त वायरस के लिए अत्यंत अतिसंवेदनशील होते हैं. यह संक्रमण से बचने के लिए जरूरी है. वायरस / संक्रमित जीवाणुओं के संपर्क में सभी सतहों 70% (v / v) इथेनॉल के साथ साफ हो या डिटर्जेंट (चित्रा 2I) का उपयोग कर झाड़ी की जानी चाहिए जो बिंदु पर संदूषण अंत में घटित होगा. इस अप्रभावी है, तो Envirocide (चित्रा 2j) सामना कर सकते हैं कि सभी सतहों का पूरी तरह से परिशोधन की आवश्यकता है. 4 डिग्री सेल्सियस में स्टॉक के प्रदूषण को कम करने में मदद करने के लिए फ्रीजर स्टॉक से BLT5403 कोशिकाओं आत्मीयता चयन के प्रत्येक नया दौर शुरू, और जोरदार कोशिकाओं प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा रहा सुनिश्चित करते हैं. फ़िल्टर बाधा विंदुक युक्तियाँ आवश्यक हैं.

3. आत्मीयता चयन

एक दिन

  1. मार्क कुओं जो prot में शामिल होंगे जो एक microtiter स्थायी स्याही के साथ थाली, और नामितEins / संशोधन. (कारण संक्रमण के मुद्दों के लिए, प्लेटें reused कभी नहीं कर रहे हैं). प्रत्येक प्रोटीन और उपचार के लिए कुओं की 3 अनुकरण में इस कार्य करें.
  2. पानी के साथ बड़े पैमाने पर प्लेट धो लें और उल्टा washes के बीच 4 परतों कागज तौलिया पर थाली smacking से पानी निकाल दें. पहले के लिए Tris, 7.5 पीएच, छह कुओं में (पसंद के या बफर) पुनः संयोजक प्रोटीन (10 माइक्रोग्राम / एमएल), या बीएसए 9 कुओं की कुल के लिए तीन कुओं में (10 माइक्रोग्राम / एमएल) के 100 μl में, स्थिर आत्मीयता चयन का दौर. प्लास्टिक की चादर के साथ पकवान कवर और 4 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2 जी) पर रात भर छोड़ दें.
  3. Autoclaved, और उचित लेबल साफ 9 एक्स 250 मिलीलीटर Erlenmeyer बोतल (ऊपर 2.1 देखें), (रंग का टेप के साथ कोडिंग, अच्छी तरह से चित्रा 2 एफ काम करता है) कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा रहा पुस्तकालय की अनुमापांक और जांच की जानी फेज की संख्या के आधार पर के लिए उपयोग करने के लिए फेज lysate की मात्रा की गणना.
  5. ताजा BLT5403 कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए तैयार कर रहे हैं कि सुनिश्चित करेंदौर इस आत्मीयता चयन कल (चित्रा 3) titering के लिए.
  6. पर्याप्त 1x टीबीएस (150 मिमी NaCl, 50 मिमी Tris बेस, पीएच 7.6) और 1x TTBS (1x टीबीएस + 0.05% (v / v) के बीच 20) सुनिश्चित कुओं का इस्तेमाल किया जा रहा है की संख्या के लिए 10 x 200 μl washes के प्रदर्शन करने के लिए उपलब्ध हैं . इसके अतिरिक्त, आत्मीयता चयन के तापमान पर TTBS preincubate. सील एक बैकअप, 1x TTBS की 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब पर्याप्त 1x TTBS साथ आत्मीयता चयन के तापमान पर मौजूद सुनिश्चित करें.
  7. लेग 100 एएमपी प्रत्येक के 990 μl के साथ 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब (27 कुल) के 3 उपचार एक्स 3 अनुकरण एक्स 3 triplicates तैयार है और उचित रूप से (जैसे 10 -2) लेबल. ये कल microtiter प्लेट कुओं से लिया गया संक्रमित जीवाणुओं के लिए कर रहे हैं. ट्यूब (10 -2) के एक तरफ कमजोर पड़ने और दूसरी तरफ एक आरोही संख्या ("1") मार्क. प्रत्येक Eppendorf ट्यूब के लिए, यह भी एक borosilicate ट्यूब और एक लेग 100 एएमपी थाली लेबल. इस w मेंप्र, प्लेटें और borosilicate टेस्ट ट्यूब आदि,, 4, 3, 2, 5 1 गिने जा रहे हैं. titering तेजी से जाना बनाने के लिए. बाद में साधारण संख्या Eppendorf ट्यूब पर कमजोर पड़ने और उपचार के लिए मिलान किया जा सकता है (उदाहरण के लिए # 12 ट्यूब कमजोर पड़ने से 10 -5 के लिए बीएसए नियंत्रण की पहली प्रतिकृति के तीसरे तीन प्रतियों था). स्टोर Eppendorf ट्यूब और लेग 100 एएमपी प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर (2 जी आंकड़े और 3 बी).

उदाहरण के लिए:, बीएसए प्रतिकृति एक अच्छी तरह से 1, 2, और 3 (प्रतिकृति एक के लिए फेज अनुमापांक की तीन तीन प्रतियों रीडिंग) के रूप में से फेज के तीन 10 -2 dilutions के लिए 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों लेबलिंग, और फिर borosilicate टेस्ट ट्यूब 1 अंक प्रारंभ संक्रमित जीवाणुओं लेग 100 एएमपी अगर प्लेट (चित्रा -3 सी) पर गिरने से पहले असंक्रमित बैक्टीरिया और शीर्ष agarose के साथ मिलाया जाएगा जिसमें 2, और 3.

  1. धारावाहिक घ के लिएप्रत्येक के लिए ilutions, लेबल Eppendorf ट्यूबों और,, लेग 100 एएमपी के 900 μl जोड़ें. प्रारंभिक dilutions संक्रमित जीवाणुओं की (10 -2) प्रत्येक प्रोटीन / उपचार, प्रतिकृति, और तीन प्रतियों, कल के लिए बना रहे हैं, वे अच्छी तरह से मिलाया जाएगा और 100 μl उन लोगों से ले लिया और लेग 100 900 μl युक्त उपयुक्त Eppendorf ट्यूब में जोड़ा (प्रतिकृति एक बीएसए नियंत्रण के लिए ट्यूब 4, 5 और 6) 10 -3 कमजोर पड़ने के लिए एएमपी. ये अपनी बारी में अच्छी तरह से मिलाया जाएगा और 10 -3 dilutions 10 -4 dilutions बनाने के लिए उपयोग किया जाएगा (7, 8, 9). 10 -5 dilutions (10, 11, 12), आदि के लिए 10 -4 dilutions का प्रयोग करें. तीन बीएसए अनुकरण (वेल्स) के पहले के लिए अनुमापांक पाने के लिए.
  2. एक ही बीएसए प्रतिकृति दो के लिए किया जाएगा (अच्छी तरह 2), बीएसए प्रतिकृति तीन अच्छी तरह से (3), जहर चारा की तीन अनुकरण, और अंत में चारा वेल्स के तीन अनुकरण. अंत में, च लेबल ट्यूब होना चाहिएROM 1-135 (135 10 -6 की अधिकतम कमजोर पड़ने पर चारा के अंतिम प्रतिकृति के अंतिम तीन प्रतियों है). 4 डिग्री सेल्सियस (चित्रा -3 सी Eppendorf और बीएसए के तीन अनुकरण (तीन कुओं) के triplicates के सभी dilutions के लिए borosilicate ट्यूब से पता चलता है पर रात भर इन Eppendorf ट्यूबों स्टोर.
  3. एक रात में संस्कृति के रूप में incubating प्रकार के बरतन (आंकड़े 2 ई और 2 एफ) में बढ़ रही है, (2.2 कदम से ऊपर एक हौसले से परेशान रातोंरात लेग AMP100 थाली से एकल कालोनियों से उठाया) BLT5403 कोशिकाओं के 2 या 3 संस्कृति ट्यूब प्रारंभ करें. 500 मिलीलीटर लेग (बिंदु से ऊपर 2.5) के लिए, 100 ग्राम / मिलीलीटर एम्पीसिलीन जोड़ सकते हैं और यह 37 डिग्री सेल्सियस से कम हो जाएगा तो मिलाते इनक्यूबेटर में दबाना में Fernbach कुप्पी जगह है और अगली सुबह (चित्रा 2 एफ) वातित.

नोट: दौर तीन और चार पी के रूप में ज्यादा -10 के रूप में 10 मात्रा का लगभग dilutions आवश्यकता हो सकती हैलेग AMP100 करने की मात्रा को हेग.

दो दिन

  1. अगली सुबह, incubating प्रकार के बरतन में clamps में autoclaved, खाली 9 एक्स 250 मिलीलीटर Erlenmeyer बोतल (प्रत्येक अच्छी तरह से microtiter प्लेट के लिए एक) रखें. BLT5403 कोशिकाओं के रातोंरात संस्कृतियों में से एक से 500 μl के साथ 500 मिलीलीटर लेग 100 एएमपी टीका लगाना, (ऊपर कदम 3.8 देखें) reseal और यह (37 डिग्री सेल्सियस, 220 आरपीएम) बढ़ शुरू कल रात शुरू कर दिया. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (चित्रा 2H) पर मुड़ें और 600 एनएम पर absorbance को पढ़ने के लिए यह निर्धारित किया है.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस से microtiter प्लेट निकालें, प्लास्टिक की फिल्म हटाने, और 200 μl के साथ 1x टीबीएस पीएच 7.5 से हर समय 10x धोने और उल्टा washes के बीच एक कागज तौलिया पर थाली smacking द्वारा थाली से किसी भी अनबाउंड प्रोटीन को हटा दें. 200 μl 5% प्लास्टिक की चादर में लिपटे प्लेट के साथ (w / v) बीएसए या 200 μl 5% (w / v) 1 घंटे के लिए टीबीएस में अभिकर्मक अवरुद्ध (या रात भर सुविधाजनक हो) के साथ ब्लॉक.
  3. अवरुद्ध बंद धो लेंolution 10x उल्टा washes के बीच एक कागज तौलिया के 4 परतों पर थाली smacking 1x TBST के 200 μl प्रत्येक समय के साथ. यह इस स्तर पर 200 μl पानी से कुओं फिर से भरना प्लास्टिक की चादर के साथ कवर और अधिकतम 1 सप्ताह के लिए स्टोर करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर डाल करने के लिए संभव है.

नोट: समय से आत्मीयता चयन के पूरा होने से फेज संक्रमित-BLT5403 जोड़ने के लिए तैयार कर रहे हैं, कि जल्द ही संस्कृति शुरू, 500 मिलीलीटर में कोशिकाओं 0.6 और 1.0 ओवर ड्राफ्ट 600 के बीच हैं. वे ज्यादा 1.0 से आगे हैं कोशिकाओं स्थिर चरण दृष्टिकोण के रूप में, सेल के कारण संसाधन प्रतिबंध के लिए नहीं हो सकता है. कोशिकाओं 600 0.6 से कम से कम पिछले फेज की शुरुआत करने के लिए एक आयुध डिपो को प्राप्त नहीं करते हैं, संक्रमण की बहुलता तेजी lysate के प्रतिनिधित्व को प्रभावित कर सकते हैं, जो कोशिकाओं को मारने, बहुत अधिक हो सकता है. कोशिकाओं अभी तक आत्मीयता चयन, inoc के पूरा होने से एक आयुध डिपो 0.6 के 600 के करीब पहुंच नहीं कर रहे हैंulate दूसरा (या भी से दूसरे और तीसरे दोनों) 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2 एफ) को मिलाते हुए टेस्ट ट्यूब से अधिक BLT5403 साथ कुप्पी. एक आयुध डिपो 1.0 की 600 बहुत तेजी से आ रहा है, हीटर और शेखर बंद और संस्कृति शांत और ऑक्सीजन के लिए बैक्टीरिया को भूखा ढक्कन खुला. फेज एक बार झटकों / हीटिंग recommence जोड़ दिया गया है.

यहाँ से फेज पार संक्रमण से बचने के लिए फिल्टर बाधा सुझावों का उपयोग करें.

  1. कुप्पी टीका है, एक बार, प्रोटीन के साथ में फेज पुस्तकालय (100 μl) डाल प्लास्टिक की चादर के साथ प्लेट reseal और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  2. 55 मिनट में, आयुध डिपो कोशिकाओं की 600 रिकॉर्ड. दुगनी समय मोटे तौर पर हर 20 मिनट है. अधिनियम तदनुसार (ऊपर नोट "" देखें).
  3. एक घंटे के अंत में थाली से प्लास्टिक की चादर को हटा दें और तुरंत बदल बेकार में फेज बाहर मिलाते और फिर तेजी से 1x टीबी के 200 μl जोड़कर धोनेअनुसूचित जनजाति. (एक 1 = 100 μl सिर के साथ एक multipipettor और पर सेट pipettor का प्रयोग 2 इस के लिए [यानी 200 μl / सवार अवसाद उद्धार] और यह जल्दी हो जाता है). 1 मिनट के लिए एक टाइमर सेट. 1 मिनट के बाद, तब्दील हो बर्बाद, उल्टा कागज तौलिया पर एक प्रकार का जहाज़ थाली में बफर बाहर मिलाने और बेंच (25 डिग्री सेल्सियस) थाली पर वापस जगह है. दोहराएँ धोने 10x कदम.
  4. 10 वें धोने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब से BLT5403 कोशिकाओं के 200 μl ले और अच्छी तरह से TTBS के पिछले धोने हटा दिया गया है जिसमें से के तल में डाल दिया. प्लास्टिक की चादर में प्लेटों लपेटें और (अंधाधुंध फेज बंधन से लगातार पुनः प्राप्त फेज और / या उच्च पृष्ठभूमि के विषय में चर्चा में नोट देखें) अभी भी बैक्टीरिया को संक्रमित करने के लिए प्रलोभन के लिए अटक किसी भी फेज प्राप्त करने के लिए 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर डाल दिया.
  5. 20 मिनट के अंत में, प्लेटें खोल देना और 25 डिग्री सेल्सियस प्रतिकृति एक अच्छी तरह पर बीएसए से 10 μl बैक्टीरिया ले और चिह्नित लेग 100 एएमपी के 990 μl में डाल दिया"1". कि अच्छी तरह से करने के लिए दो बार अधिक दोहराएँ (ट्यूब 2 और 3) है कि अच्छी तरह से फेज के 1/100 dilutions की 3 triplicates हो जाती है. इस तीन बार जांचा बीएसए प्रतिकृति एक है. इन dilutions बीएसए की है कि नकल के लिए ± SEM के औसत अनुमापांक अनुमान लगाने के लिए उपयोग किया जाएगा.
  6. जहर चारा प्रोटीन की तीन दोहराया कुओं के लिए, बीएसए (10 μl प्रत्येक के तीन तीन प्रतियों नमूने) की प्रतिकृति 2 और 3 के लिए एक ही है, और चारा प्रोटीन के लिए. एक तरफ इन 27 Eppendorf ट्यूबों सेट और सेल की ओर बढ़ रहा कुओं में संक्रमित जीवाणुओं की शेष 170 μl मिलता है.
  7. फ्लास्क में बैक्टीरिया = 0.6-1.0 आयुध डिपो 600 पर है, तो Fernbach से 50 मिलीलीटर कोशिकाओं नौ 250 मिलीलीटर Erlenmeyer बोतल में से प्रत्येक में फ्लास्क छानना. अच्छी तरह से बीएसए प्रतिकृति 1 में फेज संक्रमित BLT5403 बैक्टीरिया की शेष 170 μl लो और "बीएसए प्रतिनिधि 1" (पीला टेप) के रूप में चिह्नित 50 मिलीलीटर कोशिकाओं में जोड़ें. सभी नौ कुओं के लिए यह करो और उन्हें (इनक्यूबेटर में मिलाते डाल
  8. सेल के लिए करने के लिए समय समय से 37 डिग्री सेल्सियस incubating प्रकार के बरतन (टीका के समय से लगभग 3 घंटे) में कोशिकाओं मॉनिटर. इस समय के दौरान उपयुक्त, लेबल Eppendorf ट्यूबों में 27 प्रारंभिक dilutions (10 -2) से dilutions बनाओ.
  9. ऊपर 3.12 से प्रारंभिक 27 dilutions से इन dilutions प्रदर्शन करने के लिए, Eppendorf ट्यूब 1 (अच्छी तरह से इस से यह 1/100 कमजोर पड़ने से तीन प्रतियों के नमूनों की पहली बीएसए प्रतिकृति एक,) से बैक्टीरिया के साथ लेग के 100 μl लेने के लिए और इसे जोड़ने Eppendorf ट्यूब 4 में लेग के 900 μl (पहले अच्छी तरह से इस से तीन प्रतियों के नमूनों की बीएसए प्रतिकृति एक की 1 एक्स 10 -4 कमजोर पड़ने,).
  10. Eppendorf ट्यूब 7 में लेग के 900 μl पहले तीन प्रतियों का बीएसए प्रतिकृति एक की (1 x 10 -5 कमजोर पड़ने, को जोड़ने के लिए Eppendorf ट्यूब 4 से बैक्टीरिया के साथ लेग के 100 μl हो रहा से पहले एक नया एक के लिए फिल्टर बाधा टिप त्यागें यह अच्छी तरह से नमूने). Dilutions (D जारीस्वयं सभी प्रोटीन और उपचार (कुल 135 ट्यूब) के सभी अनुकरण के सभी triplicates के लिए) -6 10 एक्स 1 के.
  11. कोशिकाओं lysed करने के बाद, एक 5 एम NaCl स्टॉक से 5 मिलीलीटर जोड़कर 0.5 एम NaCl के लिए संस्कृति लाने के लिए और एक लेबल अपकेंद्रित्र बोतल के लिए स्थानांतरण.
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 8000 XG पर अपकेंद्रित्र एक स्वच्छ, बाँझ 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला (वायरस) छानना.
  13. फाल्कन ट्यूब में निथर सतह पर तैरनेवाला को क्लोरोफॉर्म की कुछ बूँदें जोड़ें.
  14. आत्मीयता चयन के अगले दौर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.

4. तीन दिन

  1. अगले दौर के लिए तैयार करने के दौर में इस आत्मीयता चयन पैदा करने में इस्तेमाल किया गया है कि सभी Labware आटोक्लेव या ब्लीच.

5. Titering

  1. Dilutions के आरोही क्रम में के रूप में वहाँ संख्या कई ठोस लेग 100 एएमपी प्लेटों के रूप में (अब हर borosilicate ट्यूब और Eppendorf ट्यूब, यही संख्या से प्रत्येक के लिए 1 प्लेट होनी चाहिए). पी37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (चित्रा 3 डी) में प्लेटें ut.
  2. शीर्ष agarose पिघल (1.0 ग्राम Bacto tryptone, 0.5 ग्राम खमीर निकालने, 0.5 ग्राम NaCl, 0.6 जी agarose, 100 मिलीलीटर, आटोक्लेव को बनाने के लिए) शीर्ष agarose बोतल कैप ढीला और बारी - बारी से बोतल microwaving और यह शीर्ष तक यह मिश्रण करने के लिए घूमता से agarose पूरी तरह पिघल गया है. 50 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 3E) को शांत करने के लिए पानी के स्नान में बोतल रखो.
  3. संलग्न एक विंदुक पंप के साथ एक borosilicate 10 एमएल पिपेट ले लो. एक लेम्प बर्नर लाइट. उल्टा बेंच पर एक स्टायरोफोम फाल्कन ट्यूब धारक या कूलर ढक्कन मुड़ें और उस पर 1 से 6 (ताजा 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में से) LB100 एएमपी प्लेटें प्लेस, प्लेट 1 ऊपरवाला (चित्रा -4 ए). स्टायरोफोम गर्म प्लेटें रहता है.
  4. ऊपर एक दिन पर तैयार (धारा 3.7 और 4 बी और 4C आंकड़े) गिने borosilicate टेस्ट ट्यूब में से प्रत्येक में 4 डिग्री सेल्सियस से 250 μl BLT5403 कोशिकाओं डाला. एर1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब (चित्रा -4 ए) में dilutions के रूप में एक ही आरोही श्रृंखला में गिने borosilicate ट्यूब लेकर.
  5. Borosilicate टेस्ट ट्यूब 1 (आंकड़े 4D और 4E) में कोशिकाओं के 250 μl में Eppendorf ट्यूब 1 में कमजोर पड़ने से 100 μl रखो. एक सा (बहुत ज्यादा नहीं! ~ 3 swipes, चित्रा 4F) लौ पर पिपेट की में पहले 5 गर्मी और पिघला हुआ शीर्ष agarose में उतर रही है. 3 मिलीलीटर ऊपर खींचो और कोशिकाओं / फेज (चित्रा 4 जी) के शीर्ष पर टेस्ट ट्यूब में जल्दी देने.
  6. दूसरी ओर (चित्रा 4H) के साथ ट्यूब पकड़ और प्लेट (चित्रा 4I) पर सामग्री डाल जबकि एक उंगली से flicking द्वारा मिक्स. थाली झुकाएँ और पूरी थाली शीर्ष agarose द्वारा कवर किया जाता है जब तक बुलबुले और सूखी स्पॉट का पीछा करने के लिए टेस्ट ट्यूब का उपयोग करें. ईमानदार शांत करने के लिए बेंच पर, इसे रद्द करना.
  7. Borosilicate ट्यूब त्यागें, फिल्टर बाधा टिप बेदखल, एक मिलताजा एक और सभी dilutions चढ़ाया गया है जब तक जारी है. वे समाप्त हो गया, लेकिन कोई अधिक से अधिक 6 एक बार में या वे शांत और शीर्ष agarose भी जल्दी solidifies रहे हैं इनक्यूबेटर से लेग 100 एएमपी प्लेटें निकालते हैं.
  8. शीर्ष agarose ठोस है एक बार, (यह करने के लिए महत्वपूर्ण है) उल्टा प्लेटें बदल जाते हैं. अन्यथा, अगर / agarose, "रोते" ढकने पर संघनित, शीर्ष agarose पर नीचे चला जाता है और यह यह असंभव भी और) सही अनुमापांक को बनाने के साथ फेज ले रही है, इस पर चलाता है: 1) 37 डिग्री में प्लेटें डाल सी इनक्यूबेटर या [T7 आक्रामक है के रूप में अनुमापांक गिनती करने के लिए 4 घंटा बाद में वापस हो]: 2) अनुमापांक गिनती करने के लिए अगली सुबह उल्टा बेंच पर उन्हें छोड़ और वे तैयार हैं.
  9. यह फोड़े जब तक यह, शिथिल और माइक्रोवेव शीर्ष agarose पर वापस जाएँ agarose बोतल कैप रखा है अगर टूट कांच, या चोट के खिलाफ की रक्षा के लिए सभी आवश्यक सावधानियों लेने. दो बार करो. यह शांत, कस दो.टोपी और इसे दूर रखा. अपनी सामान्य तापमान के लिए पानी स्नान नीचे बंद या इसे बंद. 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में dilutions रखो. वे titers व्याख्या और / या titering के कुछ फिर से करना करने की जरूरत होगी.

6. टिटर निर्धारण और गणना

  1. प्लेटों पर गठित पट्टिका की जांच करने और मिला हुआ सेल (चित्रा 5A जैसे 10 -2 कमजोर पड़ने) के साथ उन लोगों को त्यागें. शेष धारावाहिक dilutions की जो (आंकड़े 5A एक एन डी 5 ब) एक सटीक मिलान सक्षम करने के लिए पर्याप्त रूप से कुछ पट्टिका का उत्पादन किया है का निर्धारण करते हैं. इन प्लेटों (चित्रा 5 ब तालिका 1) से पट्टिका की संख्या रिकॉर्ड.
  2. कमजोर पड़ने से पट्टिका की संख्या गुणा और उसके बाद यानी संक्रमित जीवाणुओं की केवल 10 μl triplicates और एस से प्रत्येक के लिए ले जाया गया वेल्स (से लिया संक्रमित जीवाणुओं के प्रति मिलीलीटर पट्टिका गठन इकाइयों की संख्या प्राप्त करने के लिए 100 द्वारा इस संख्या को गुणाओ इस मिलीलीटर प्रति मायने रखता है) प्राप्त करने के लिए 100 से गुणा किया जाना चाहिए. यह अच्छी तरह से लिया तीन triplicates भर में, (अच्छी तरह से microtiter प्लेट से बाहर ले जाया undiluted संक्रमित जीवाणुओं की pfu / एमएल), मिली लीटर प्रति पट्टिका गठन इकाइयों की संख्या (pfu) औसत.
  3. तीन को दोहराने के कुओं के लिए हिसाब के एक भव्य जवाब बनता है और मतलब है (तालिका 1) के मानक त्रुटि की गणना. यह प्रत्येक आत्मीयता चयन दौर और उपचार (चित्रा 5C) के लिए फेज अनुमापांक में वृद्धि के आंकड़े में दर्ज हो जाएगा क्या है.

7. फलक अलगाव, पीसीआर, और अनुक्रमण

  1. आत्मीयता चयन दौर 4 के अंत में, 18 व्यक्ति, अच्छी तरह से परिभाषित, पट्टिका कालोनियों और, एक बाँझ पाश्चर पिपेट, दन्तखुदनी का उपयोग करते हुए, पीले पिपेट टिप या इसी तरह के उपकरण, कोर इन पट्टिका titering प्लेटों से चयन करें. ट्यूब या सुझावों का उपयोग करते हैं, तो पहले Tris-एचसीएल, Eppendorf ट्यूब (चित्रा 5D) में पीएच 8.5 के साथ अंदर गीला.
    2. (चित्रा 5E) के लिए एक अच्छी तरह से पृथक पट्टिका के माध्यम से borosilicate पिपेट टिप धक्का. अब भी अगर / शीर्ष agarose में पिपेट टिप के साथ बल्ब को छोड़ दें और कोर चूसना (चित्रा 5F, तीर देखें).
  2. संक्षेप में उपयुक्त ट्यूब (चित्रा 5G) और भंवर में 100 μl Tris-एचसीएल, 8.5 पीएच में कोर निष्कासित.
  3. 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इस मात्रा से 20 μl गरम करें.
  4. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक benchtop अपकेंद्रित्र में 13,000 XG पर गर्म मात्रा अपकेंद्रित्र. T7 अप और T7 डाउन प्राइमरों के साथ पीसीआर प्रतिक्रियाओं में प्रयोग की जाने वाली इस विभाज्य की सतह पर तैरनेवाला से 3 μl ले लो.
  5. 18 अलग पट्टिका से प्रत्येक के लिए, गर्म समाधान, एक annealing 58 डिग्री सेल्सियस के तापमान और 35 चक्रों का उपयोग कर एक 50 μl पीसीआर प्रतिक्रिया करते हैं.
  6. पूर्वी वायु कमान के 20 μl चलाएँएक 1% पर ज प्रतिक्रिया (w / v) 0.015% (v / v) ethidium ब्रोमाइड युक्त agarose जेल. उचित नेत्र सुरक्षा और Nitrile प्रयोगशाला दस्ताने का उपयोग कर एक transilluminator साथ कल्पना. (चेतावनी: ethidium ब्रोमाइड एक शक्तिशाली उत्परिवर्तजन है.) जेल तस्वीर और ठीक से दूषित सामग्री के निपटान (आंकड़े 6A और 6B).
  7. Amplicons खाली वेक्टर से ही उत्पाद हैं, और यदि नहीं (उत्पाद w / वी) TAE agarose जेल (1% पर 100 बीपी के पास चलाता है, आंकड़े 6A और 6B तीर), एक अनुक्रमण टेम्पलेट के रूप में उपयोग के लिए शेष 30 μl साफ. यदि नहीं, तो जेल (चित्रा 6B, पट्टिका 15) पर एक एकल उत्पाद, जेल से सबसे प्रमुख बैंड (ओं) को काट कर और एक किट का उपयोग कर जेल से डीएनए निकालने.
  8. अनुक्रम T7 प्रदेश प्राइमर का उपयोग कर खाली वैक्टर नहीं हैं कि amplicons.
  9. लिंकर हथियारों के लिए प्रत्येक दृश्य की जांच करने और सम्मिलित के प्रारंभ स्थित है जहां इस जानकारी से, निर्धारित करते हैं. बा का प्रयोग करेंइस प्रकार से स्थानीय संरेखण खोज उपकरण (ब्लास्ट, मेडिसिन के राष्ट्रीय पुस्तकालय) डालने फ्रेम में है, चाहे इनकोडिंग सीडीएनए की पहचान निर्धारित करने के लिए और, यदि हां, तो प्रोटीन का क्या भाग कोडन अनुक्रम (सीडीएस) द्वारा प्रदर्शित और कब्जा कर लिया गया है चारा.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

(पाचन चारा विषाक्तता) फेज प्रदर्शित प्रोटीन के साथ बातचीत करने के लिए चारा की क्षमता क्षीण करने में सक्षम होने के नाते इस तकनीक के लिए एक शक्तिशाली नकारात्मक नियंत्रण प्रदान करता है. यह चारा, अच्छी तरह से microtiter प्लेट के लिए बाध्य करते हैं, अपने कार्य को बरकरार रखती है तो यह निर्धारित करने के लिए भी सलाह दी जाती है. इन चेकों के दोनों nonpoisoned चारा द्वारा बरामद बातचीत, फेज-प्रदर्शित प्रोटीन वैध हैं कि आत्मविश्वास में वृद्धि होगी.

प्रत्येक अच्छी तरह से तीन triplicates नमूना आत्मीयता चयन में शामिल समय और काम करने के लिए काफी कहते हैं, लेकिन केवल एक बार नमूने से प्रत्येक अच्छी तरह से भीतर अनुमापांक की एक अधिक सटीक अनुमान प्रदान करता है. Triplicates के लिए titers का सबसे अच्छा समझौते में हैं, वहीं चार दौर में बीएसए की प्रतिकृति 2 के लिए triplicates (1 टेबल) व्यापक रूप से भिन्न है कि ध्यान दें. कई बार नमूना, अंतिम अनुमान के अनुसार हिसाब pipetting त्रुटियों और टी के एक अधिक सटीक अनुमान के रूप में अतिसंवेदनशील नहीं हैंवह वास्तविक अनुमापांक और यह अनुमान चारों ओर बढ़ रहे हैं, अच्छी तरह से अच्छी तरह से, (1 टेबल, चित्रा 5C) प्राप्त कर रहे हैं.

आत्मीयता चयन की संख्या में वृद्धि दौर के रूप में, preferentially nonpoisoned चारा के लिए, फेज अनुमापांक बढ़ाने से भी तकनीक (चित्रा 5C) काम कर रहा है कि आत्मविश्वास प्रदान करता है. आत्मीयता सेलेक्शन बढ़ जाती है की संख्या के रूप में nonpoisoned चारा कुओं में डालने युक्त फेज में वृद्धि एक प्रतिशत की अवधारण भी शुभ (आंकड़े 6A और 6B) है.

(चित्रा 6B पीसीआर ~ 100 बीपी की तुलना में आकार में बड़ा amplicons के रूप में प्रत्यक्ष), पहला दौर (चित्रा 6A) के सापेक्ष, और के निपटाने आत्मीयता चयन की उन्नत राउंड की संख्या में वृद्धि के लिए स्वतंत्र रूप से सम्मिलित किया है कि फेज बरामद करने के बाद चित्रा 6B <में कुछ समान आकार के बैंड (नोट गलियों 5-9, 11-18 पर इन amplicons)> / मजबूत, विशेष क्लोन आत्मीयता चयन में (आंकड़े 6A और 6B) चयनित किया जा रहा है कि एक अच्छा संकेत है. दौर अंतिम आत्मीयता चयन में प्राप्त पट्टिका की एक संख्या अनुक्रमण के बाद, एक ही प्रोटीन की एक ऐसी ही क्षेत्र (अलग क्लोन) की पुनर्प्राप्ति प्रदर्शित प्रोटीन के हिस्से चारा के लिए एक सदाशयी आत्मीयता है कि स्वतंत्र सत्यापन है. ये स्वतंत्र रूप से बरामद फेज भी चारे के साथ बातचीत करने में सक्षम है पूरे प्रोटीन के किस हिस्से पर जानकारी प्रदान करते हैं. फेज सीडीएनए पुस्तकालय यादृच्छिक भड़काना प्रयोग का निर्माण किया गया है प्रदर्शित की हैं, आंशिक और पूर्ण लंबाई प्रोटीन कवरेज के एक महान विविधता एकाधिक, स्वतंत्र क्लोन करने के लिए अग्रणी (सीडीएनए प्रविष्टि आकार को सहन करने फेज की सीमाओं के भीतर) पूर्वानुमानित किया जा सकता है प्रोटीन के एक ही हिस्से को कवर. यहां तक ​​कि सन्निहित बाहर के फ्रेम हिट वे जो बीए के लिए एक समान आकृति सांकेतिक शब्दों में अगर निर्धारित करने के लिए छानबीन की जानी चाहिएयह बांध. (यह पुस्तकालयों ओआरएफ प्रौद्योगिकी 3 का उपयोग कर निर्माण नहीं किया गया है कि मानता है).

तालिका 1
तालिका 1. तीन उपचार के लिए आत्मीयता चयन के चौथे दौर के कुओं से औसत अनुमापांक / एमएल संक्रमित जीवाणुओं के लिए गणना. अच्छी तरह से चारा की पहली प्रतिकृति से लिया पट्टिका का 10 -3 कमजोर पड़ने से प्रत्येक तीन प्रतियों के लिए संख्या चित्रा 5 ब से ले रहे हैं. बड़ा टेबल देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 1
फेज प्रदर्शन प्रक्रिया के चित्रा 1. कुल मिलाकर ग्राफिक चित्रण एक) अधिमानतः cDNAs पैदा करने के लिए बेतरतीब ढंग से primed, पाली, एक चयनित आरएनए, प्रयोग का निर्माण एक फेज प्रदर्शित पुस्तकालय के लिए उपयोग, और बी) के अब तक संभव के रूप में में, है कि एक चारा, जैविक रूप से सक्रिय रूप निरीक्षण, एक ठोस समर्थन पर स्थिर और, यदि संभव हो तो, एक अवरोध करनेवाला के अलावा द्वारा निष्क्रिय प्रदान भी जब (जैसे प्रतिस्पर्धात्मक रूप चारा प्रोटीन बंधन से हिचकते हैं). आरटी: रिवर्स प्रतिलेखन.

चित्रा 2
.. चित्रा 2 उपकरण और फेज प्रदर्शन के प्रदर्शन के लिए आवश्यक सामग्री के कुछ बाँझ तकनीक दोनों के लिए उपयोग की आवश्यकता है: एक) एक आटोक्लेव और, बी) एक लामिना का प्रवाह हुड. फेज पुस्तकालयों और BLT5403 बैक्टीरियल स्टॉक आवश्यकता -80 & # 176, लंबे समय तक भंडारण के लिए सी सी तापमान) बढ़ रही फेज और बैक्टीरिया), एफई)) (कक्षीय तरल संस्कृतियों बढ़ नहीं सकता है, जिनमें से एक 37 डिग्री सेल्सियस इन्क्यूबेटरों, लोमो की आवश्यकता है. रंग कोडिंग, एफ) के माध्यम से प्रयोग अनुकूलन गलतियों को कम करता है. Titering के लिए BLT5403 कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए एक सप्ताह, जी) के लिए भंडारित किया जा सकता है अगले परिक्रमा प्रकार के बरतन के लिए सेल घनत्व निम्नलिखित के लिए, एच) स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की नियुक्ति अनुकूलन समय बचा सकते हैं. अकसर साथ सतहों और pipettes इलाज, मैं) शक्तिशाली डिटर्जेंट और जे) Envirocide, वायरल संक्रमण के जोखिम को कम करने में मदद कर सकते हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

85fig3.jpg "के लिए: src =" / files/ftp_upload/50685/50685fig3highres.jpg "/>
चित्रा 3. एक संभव सेट अप चिकनी आत्मीयता चयन. ए) BLT5403 अनुमति देने के लिए उपयोगी एक या दो दिन पूर्व titering हो गई है और कर रहे हैं कि वे वायरस से दूषित नहीं कर रहे हैं कि यह निर्धारित करने के लिए, वायरल परिचय के बिना, चढ़ाया जाता है. Eppendorf prelabeling) बी और सी) borosilicate ट्यूब लेग 100AMP के कमजोर पड़ने समाधान aliquoting और 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर उन्हें भंडारण बी) का उपयोग किया जा करने के लिए डी: आत्मीयता चयन के दिन Titering द्वारा पहले से तैयार करके की जा सकती है.. ) बाँझ शीर्ष agarose (टोपी ढीला) पिघलने और शांत करने के लिए एक preheated 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में डाल). ई titering से पहले लगभग 1 घंटा गर्म करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर prenumbered, लेग 100AMP अग्रवाल युक्त, पेट्री डिश रखें इस तापमान को titering पहले एक घंटे के आरम्भ होता है. एक le उपयोगशीर्ष agarose निकाल दिया जाता है के रूप में बोतल पलटने से बचने के लिए विज्ञापन डोनट. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. आत्मीयता चयन के एक दौर से बरामद फेज Titering. चढ़ाना अनुमापांक. ए) वायरस से संक्रमित BLT5403 dilutions और रैक में इकट्ठे borosilicate ट्यूबों के पहले सेट के कृत्रिम मुद्रास्फीति को रोकने के लिए संक्रमण के बाद जितनी जल्दी हो सके शुरू. फिल्टर बाधा सुझावों का प्रयोग: 250 μl 4 डिग्री सेल्सियस से स्टॉक से BLT5403 कोशिकाओं ई.पू.) borosilicate ट्यूबों के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. फिल्टर बाधा सुझावों का उपयोग: पहली borosilicate ट्यूब में डे) BLT5403 फाई से संक्रमित हैRST वायरस के कमजोर पड़ने. एफ) borosilicate पिपेट clogging रोकने के लिए और शीर्ष agarose गर्म रखने के लिए एक खुली आग पर गर्म किया जाता है. . जरूरत से ज्यादा पिपेट गर्मी नहीं है या बैक्टीरिया जला हुआ हो जाएगा और मरने जी) 3 मिलीग्राम पिघला हुआ शीर्ष agarose जल्दी से लिया गया है और borosilicate ट्यूब एच) ट्यूब सामग्री मिश्रण करने के लिए संक्षिप्त flicked और है में बैक्टीरिया के ऊपर डाल दिया जाता है;. मैं) सामग्री थाली के पक्षों के लिए बुलबुले को स्थानांतरित करने के लिए और शीर्ष agarose पूरी थाली को शामिल किया सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब का उपयोग कर, prewarmed लेग 100AMP अगर प्लेट पर डाल दिया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. ठेठ अनुमापांक पुनःsults. ए) कम dilutions (10 -2) लगभग हमेशा पहले आत्मीयता चयन दौर में सभी उपचार (चित्रा में वायरस पीढ़ी तक फोटोग्राफी की सुविधा के लिए अत्यधिक पट्टिका आकार में जिसके परिणामस्वरूप हो गया है) के लिए मिला हुआ सेल में परिणाम. बी) पट्टिका का उपयुक्त dilutions गिनती हुई पट्टिका का ट्रैक रखने के लिए एक sharpie गिनती का उपयोग कर रहे हैं. सी) काफी बीएसए या जहर चारा के लिए स्थिर और अधिक या कम, जबकि शेष चारा वेल्स के लिए अनुमापांक बढ़ जाती है. बाद के दौर में, चारा कुओं पठारों और आगे आत्मीयता चयन से अनुमापांक अनुत्पादक है. डी) एक अच्छी तरह से पृथक पट्टिका अतिरिक्त तरल कम से कम इसे खत्म करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा Eppendorf ट्यूब से समाधान के साथ चराई पिपेट गीला द्वारा अनुक्रमण के लिए चुना है और एकत्र किया गया है कई पट्टिका से अधिक रन और कोर दूषित. ई) पिपेट पहले से ही संकुचित पिपेट बल्ब के साथ पट्टिका के माध्यम से धक्का दिया गया हैपिपेट cored पट्टिका उपयुक्त Eppendorf ट्यूब में तरल में वितरित किया जाना है के बारे में है ऊपर पिपेट में पट्टिका (तीर). जी) चूसने, शीर्ष agarose में अभी भी है. एफ) बल्ब जारी की गई है. फेज dilutions (लेग 100AMP की मात्रा प्रति संक्रमित जीवाणुओं की मात्रा) पेट्री डिश (जैसे 10 -3 = 1/1, 000 कमजोर पड़ने) पर चित्रित कर रहे हैं. प्रतिकृति अच्छी तरह से 1 से तीन तीन प्रतियों नमूने यात्रा के रूप में संक्षिप्त कर रहे हैं. 1, ट्रिप. 2, और यात्रा. 3, सभी प्रतिकृति 1 (निरसित 1 = अच्छी तरह से 1) के लिए. बी में प्लेटों के नीचे) पर संख्या प्लेटों पर गिनती हुई वास्तविक पट्टिका संख्या हैं. ये चारा अधिक आत्मीयता चयन (चित्रा में R4) के चौथे दौर से बैक्टीरिया की 10 -3 कमजोर पड़ने के लिए कर रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .


चित्रा 6. एक उपयुक्त चारा अधिक आत्मीयता के चयन के लिए विशिष्ट पीसीआर परिणाम. ए) खाली वेक्टर पट्टिका (तीर) का प्रतिशत आम तौर पर काफी शुरू में उच्च लेकिन, चारा कुओं में है, बी) बाद के दौर में कम हो जाती है. पट्टिका युक्त डालने यह बाद में आत्मीयता चयन दौर में समान आकार के सम्मिलित युक्त उन पर व्यवस्थित करने के लिए खड़ा किया है. MWM: आण्विक वजन मार्कर.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

तीन दोहराया कुओं में प्रयोग चल रहे हैं, चारा के लिए बाध्य ही प्रोटीन की स्वतंत्र रूप से प्राप्त कर लिया फेज वे एक ही क्लोन का अधिग्रहण किया गया है कि सीडीएस क्षेत्र के nucleotide अनुक्रम में (यानी कोई अंतर नहीं है, लेकिन इन किया गया है, भले ही प्रतिष्ठित किया जा सकता ) स्वतंत्र कुओं से लिया गया. अन्यथा, चारा के लिए बाध्य ही प्रोटीन एन्कोडिंग फेज के बीच भेद करने के लिए एक ही रास्ता है कि वे स्वतंत्र रूप से कर रहे हैं nucleotide अनुक्रम के कुछ हिस्से में अलग है कि लिखित क्षेत्रों रिवर्स है.

आत्मीयता चयनित फेज amplifying के लिए उपयोग में बैक्टीरिया के सभी विकसित करने के लिए, जिसमें एक Fernbach कुप्पी का उपयोग 9 Erlenmeyer बोतल पर नजर रखने की कोशिश कर रहा से आत्मीयता चयन निम्नलिखित संक्रमण के लिए अग्रणी बैक्टीरिया विकास का एक बहुत कम व्यस्त निगरानी परमिट. Prewarmed Erlenmeyer बोतल में, बस से पहले संक्रमण के लिए, इन बैक्टीरिया decanting भी कारण Alte को sublibrary अनुमापांक विसंगतियों समाप्तकारण विशिष्ट बोतल में गरीब बैक्टीरिया विकास के लिए संक्रमण की बहुलता में राशन. इस प्रकार, गोल करने वाली दौर से फेज अनुमापांक में परिवर्तन कुओं में बनाए रखा फेज की संख्या और दोहराया कुओं के बीच अनुमापांक में भिन्नता कम किया जाना चाहिए पर निर्भर होना चाहिए.

फेज प्रदर्शन का उपयोग कर एक असाधारण लाभ तकनीक एक विशेष चारा के लिए एक आकर्षण है कि फेज प्रदर्शित प्रोटीन की पहचान करने में महान शक्ति है. कारण फेज BLT5403 मेजबान में दोहराने दक्षता के साथ जो करने के लिए, पहले आत्मीयता चयन दौर में एक अच्छी तरह से बनाए रखा है कि एक दुर्लभ सीडीएस का प्रतिनिधित्व एक भी फेज, कोट इनकार प्रोटीन चारा के लिए एक उच्च संबंध है, होगा चाहिए बहुत अधिक से अधिक संख्या से दूसरे दौर में प्रतिनिधित्व किया. चौथे दौर तक, इस फेज lysed संस्कृति में मौजूद फेज के बहुमत का गठन करना चाहिए.

उच्च टिटर को दोहराने के लिए फेज की यह क्षमता भी तकनीक की एक सीमा हैnique. एक विशेष चारा यह पुस्तकालय में उच्च आत्मीयता है, जिसके लिए एक बातचीत के दौरान प्रोटीन साथी है, यह इन उच्च आत्मीयता बाध्यकारी प्रोटीन द्वारा outcompeted हो जाते हैं जाएगा के रूप में वैध तरीके से चारा बाँध लेकिन एक कम आकर्षण में हो सकता है कि प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए बहुत मुश्किल है . ऐसे दुर्लभ फेज की पहचान करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण तकनीकों का उपयोग इस सीमा 1 circumventing का एक संभावित साधन है. इसके अलावा, दृढ़ता, बल्कि कठोर decontaminants (जैसे Envirocide) और दूर करने के लिए उत्कृष्ट बाँझ तकनीक की आवश्यकता है कि प्रयोगशाला के दौरान "संदूषण" के मुकाबलों में T7 फेज परिणाम के लिए BLT5403 की संवेदनशीलता. एक स्रोत की पहचान करने और खत्म करने की कोशिश करता ही प्रदूषण आत्मीयता चयन की प्रगति में समय की काफी हानि हो सकती है.

तंग और ढीली "बाँधने" में विभाजन फेज में सफलता सीमित है कि एक का मतलब ढीला बाँधने पहले बी कोशिश करते हैं और ठीक करने के लिए हैY कुओं में कम कसकर चारा के लिए बाध्य कर रहे हैं कि फेज दूर करने के लिए बनाया गया एक समाधान (1% एसडीएस या इसी तरह chaotrope) शुरू. यह समाधान तो पूर्व उन फेज चारा के लिए बाध्य शेष से संक्रमित हो रहे हैं अनुमान है जो कुओं में बैक्टीरिया की शुरुआत करने के लिए, पहले हटाया जा सकता है. इस तकनीक को भी काफी, नकली तौर पर बाध्यकारी फेज पृष्ठभूमि को कम कर सकते हैं. इस तकनीक अपनाई है, तो हालांकि, बाद के दौर में चयनित sublibraries, replicates और डुप्लिकेट आत्मीयता की संख्या समय और खर्च करने के लिए काफी कहते हैं, जो दोगुनी है.

आत्मीयता चयन के कई दौर खत्म फेज अनुमापांक वृद्धि के कोर्स के बाद लेग की एक बड़ी मात्रा और लेग 100 एएमपी प्लेटों की एक बड़ी संख्या, फिल्टर बाधा सुझावों, Eppendorf ट्यूबों, आदि के माध्यम से चला सकते हैं. फेज का भी एक मामूली संख्या की जांच करने के लिए आवश्यक अनुक्रमण है के रूप में यह महंगा है. टीआर के कई replicates के dilutions की एक बड़ी संख्या Titeringतीन प्रतियों में eatments तो पूर्व आत्मीयता चयन करने के लिए दिन में संभव के रूप में सामग्री के रूप में ज्यादा की स्थापना के महत्व सर्वोपरि है काफी समय की आवश्यकता है.

वर्तमान में पता लगाया जा रहा है कि एक रोमांचक संभावना शारीरिक विशेषताओं और चारे के साथ बातचीत के दौरान प्रोटीन के क्षेत्र के तीन आयामी संरचना मॉडल पर, एक चारा के लिए बाध्य, स्वतंत्र फेज प्रोटीन के स्थान का उपयोग करने के लिए है. उदाहरण के लिए, मुताबिक़ देर embryogenesis के एक सेट करने के लिए बाध्य है कि प्रोटीन लक्ष्य की विशेषताओं की जांच Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) और सोयाबीन (Glycine अधिकतम) से प्रचुर मात्रा में (एल ई ए) प्रोटीन, एक महत्वपूर्ण निष्कर्ष था कि के क्षेत्र के लिए बाध्य एल ई ए प्रोटीन बंधनकारी प्रोटीन की 11 सबसे अधिक (या सबसे) के बीच में हाइड्रोफिलिक थे कि प्रोटीन. Retrospectively, एल ई ए प्रोटीन निर्जलीकरण के दौरान विकृतीकरण से उनके मुवक्किल के अणुओं की रक्षा के लिए धारणा यह देखते हुए कि, यह हो सकता हैएल ई ए के संरक्षण के बिना रोग के लिए सबसे अतिसंवेदनशील ग्राहक अणुओं के क्षेत्र (हाइड्रोफिलिक) पानी बाध्यकारी की सबसे सक्षम उन हो सकता है कि urmised.

यह अनुमापांक फुलाया नहीं है तो कुओं में बैक्टीरिया का परिचय और उनकी पुनर्प्राप्ति के बीच के समय को कम करने की सलाह दी जाती है. Dilutions बैक्टीरियल शेयर दूषित नहीं है सत्यापित और सबसे बड़ी dilutions मिला हुआ सेल से बचने के लिए पर्याप्त हैं कि वायरल संक्रमण के बिना कुछ BLT5403 चढ़ाना द्वारा पर्याप्त हैं कि सुनिश्चित करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हैच, McIntire-Stennis (AD421 सीआरआईएस), यूएसडीए बीज अनुदान (2011-04375), और अब्द सर फ्रेडरिक मैकमास्टर रिसर्च फैलोशिप, इस परियोजना के लिए आंशिक रूप से एक NSF IOS (0849230) द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone Becton Dickinson Co. 211705
Yeast Extract Becton Dickinson 212750
Agar Becton Dickinson 214010
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Agarose Research Products International A20090
Blocking Reagent EMD Chemicals Inc. 69064
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-212
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher Scientific BP166-500
Tris Base Fisher Scientific BP152-5
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1
Escherichia coli BLT5403 EMD Chemicals Inc. BLT5403 Genotype: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicillin, Sodium Salt Research Products International A40040
Ethidium bromide Fisher Scientific BP102-1
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich Corp. A-9647
Penta-HIS primary antibody Qiagen Inc. 34660
Goat anti-mouse alkaline phosphatise conjugate Sigma-Aldrich Corp. A-5153
para-Nitrophenylphosphate Sigma-Aldrich Corp. N-7653
T7-UP primer EMD Chemicals Inc. 5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'
T7-DOWN primer EMD Chemicals Inc. 5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'
Qiaquick PCR Purification kit Qiagen Inc. 28104
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen Inc. 28706
Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Invitrogen Life Technologies 4336917
Heating Block Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) 18780
96-well Cell Culture Plates Corning Costar 3590
Isotemp Incubator Oven Fisher Scientific 516D
Pasteur Pipettes, 5 ¾ in Fisher Scientific 13-678-20A
ChromaView Transilluminator UVP Inc. TS-15
UV Shield Oberon 071AF
Gloves, Nitrile Fisher Scientific 19-170-010C
Sterile 1.5 ml tubes USA Scientific Inc 1615-5500
10 ml Borosilicate Pipettes Fisher Scientific 13-678-25E
Borosilicate culture tubes Fisher Scientific 14-961-27
Uniskan I, ELISA plate reader Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland Type 362

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
  2. Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
  3. Li, W. ORF phage display to identify cellular proteins with different functions. Methods. 58, 2-9 (2012).
  4. Willats, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).
  5. Konthur, Z., Crameri, R. High-throughput applications of phage display in proteomic analyses. Targets. 2, 261-270 (2003).
  6. Chen, T., et al. Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning. J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).
  7. Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).
  8. Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).
  9. Egli, D. B., Bruening, W. P. Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean. Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).
  10. Badotti, F., et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).
  11. Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display. Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).
  12. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).
  13. Gasser, B., et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).
  14. Daly, R., Hearn, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).
  15. Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).
  16. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
  17. Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).
  18. Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions. Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).
  19. Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production. Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).
  20. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).

Tags

बायोकैमिस्ट्री अंक 84 आत्मीयता चयन फेज प्रदर्शन प्रोटीन प्रोटीन बातचीत
पुनः संयोजक प्रोटीन फँसाना चाहे का उपयोग फेज प्रदर्शन और आत्मीयता चयन के लिए एक प्रोटोकॉल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kushwaha, R., Schäfermeyer, K.… More

Kushwaha, R., Schäfermeyer, K. R., Downie, A. B. A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits. J. Vis. Exp. (84), e50685, doi:10.3791/50685 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter