Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En protokol for fagvisning og Affinity Selection Brug rekombinant protein Lokkemad

Published: February 16, 2014 doi: 10.3791/50685
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Horticulture, University of Kentucky

Summary

Fag-display er en kraftfuld teknik til at fange proteiner eller proteingrupper, der interagerer med et immobiliseret molekyle af interesse. Når først en beslutning om, hvilken type fag cDNA bibliotek til at oprette og skærmen er blevet foretaget, protokollen beskrevet her tillader effektiv affinitet udvælgelse fører til identifikation af interaktionskandidater.

Abstract

Ved hjælp af rekombinant fag som et stillads til at præsentere forskellige proteindele kodet af en retningsbestemt klonet cDNA-bibliotek til immobiliserede agn molekyler er et effektivt middel til at opdage interaktioner. Teknikken er i vid udstrækning blevet anvendt til at opdage protein-protein interaktioner, men agn molekyle udfordres behøver ikke være begrænset til proteiner. Protokollen præsenteres her er optimeret til at give et beskedent antal lokkemad, der skal screenes i replikater at maksimere identifikation af uafhængige kloner, der frembyder den samme protein. Dette tillader en større tillid til, at interagerende proteiner identificeret, er legitime interaktionskandidater af agn molekylet. Overvågning fagtiteren efter hvert valg affinitet runde indeholder oplysninger om, hvordan valget affinitet forløber såvel som på effekten af ​​negative kontroller. Et middel til titrering af fag, og hvordan og hvad man skal forberede sig på forhånd til at tillade denne proces at gøre fremskridt så effektivt somer muligt, præsenteres. Attributter for amplikoner hentes efter isolation af uafhængige plaque er fremhævet, kan anvendes til at konstatere, hvor godt valg affinitet der er forløbet. Fejlfinding teknikker til at minimere falske positiver eller at omgå vedvarende genvundet fag forklares. Middel til at reducere viral kontaminering blusser op diskuteres.

Introduction

Hvorfor bruge fagvisning og affinitet udvalg i stedet for de utallige andre teknikker til rådighed for at opdage og undersøge protein interaktioner med andre molekyler? Fagvisning kan kræve nogle unikke fordele i forhold til andre metoder til påvisning af protein-ligand interaktioner 1-3, herunder følgende:

Meget bredt repertoire af agn molekyler

Den forreste Årsagen er i mangfoldigheden af molekyler, der kan fungere som lokkemad i affinitet udvalg 4. Fagvisning er et meget effektivt middel til at isolere protein fragmenter, der interagerer med andre proteiner, nukleotider, kulhydrater osv. 5. Væsentlige, hvis en polymer / molekyle kan knyttes til en genindvindingsværdi støtte, det kan screenes for affinitet med fag viste proteiner. Derudover kan tilgås agn molekyle at afgøre, om det bevarer biologisk aktivitet, når immobiliseret 6, hvis betingelserne for at reduce / fjerne dens aktivitet er effektive 6 eller at indføre post-translationelle modifikationer til agn før affinitet valg.

Fagresistens til eksterne faktorer

En anden grund til anvendelse af fag-display, er, at det er muligt, at nogle lokkemad kan kræve miljøbelastninger (varme, høje osmolyt koncentrationer specifikke cofaktorer osv.) Til at fange deres interagerende proteiner, eller muligvis en eller anden måde ændret fag viste proteiner før affinitetsudvælgelse. Den primære faktor, der undersøges er samspillet mellem agn og protein, ikke den betingelse der tillader interaktion forekomme, eller hvis det er dødelig for testorganismen. T7-fagen er særligt velegnet til sådanne undersøgelser, fordi det kan modstå barske eksperimentelle betingelser både intakte og levedygtige (fx den termiske maksimale offentliggøres T7 levedygtighed er ~ 60 ° C 7). Som et eksempel på ændring fagen vises proproteiner, når man undersøger Arabidopsis thaliana frø proteom for proteinsubstrater af reparation enzym, Protein Isoaspartyl Methyl Transferease (PIMT), den virus, der anvendes i disse undersøgelser havde været "ældet" i en uge, før hvert valg affinitet runde, for at fremme en af isoaspartate (isoAsp) rester i modtagelige proteiner 6 hvilket ikke er muligt i organismer, der kan genkende og reparere / nedbryde sådanne abnormiteter.

Metabolisk inaktive

Endvidere fagen er normalt modstandsdygtige over for metaboliske giftstoffer og blande små molekyler, ville i det mindste resultere i pleiotrope virkninger på metabolisk aktive testorganismer. Efter stringens-vaske giften fjernes før en stor mængde af bakterier indføres for infektion så giften fortyndes til et område uskadeligt for disse bakterier eller efterfølgende fag-replikation. Mens undersøge protein-targets i PIMT reparationenzym, blev S-adenosylmethionin (AdoMet) anvendes til at aktivere mikro-titer-pladet godt immobiliserede enzym til at tillade målprotein capture mens afhængige S-adenosyl homocystein (AdoHcy) for at inaktivere enzymet og give en nyttig negativ kontrol sikre i den viden, at virusset ikke ville blive negativt påvirket af enten AdoMet eller AdoHcy 6. Derudover medlemmer af visse sen embryogenese Abundant (LEA) protein familier, undersøgt i dette laboratorium, er kendt for at ændre deres form i nærvær af additiver, såsom saccharose, 8, der kan nå så høje koncentrationer som 200 mM i sojabønnefrø ved punktet af fysiologiske modenhed 9. Virussen forventes ikke at blive påvirket ved tilsætning af 200 mM saccharose i hver affinitet udvælgelsesrunde, eventuelt nødvendigt visse LEA-client protein-interaktioner, hvilket ikke er tilfældet for autonomt levedygtige testorganismer 10.

Dette laboratorium har fokuseret på discovering protein-protein interaktioner i modne, tørrede eller spirende frø, der ligger bag den mekanisme af lagret proteom beskyttelse under dehydrering 11 eller reparation af dele af den lagrede proteom der er modtagelige for isoAsp dannelse, når frøene er drukket 6. Således produktion og rensning af rekombinante proteiner, der kræves som lokkemad i en aktiv tilstand, og sikre, at de forbliver det, før og efter de er immobiliseret, skønt ofte svært, er en hjørnesten i vores arbejde. Men da hver produktion af rekombinant protein scenario er anderledes, optimere betingelserne for produktion af rekombinante proteiner vil ikke blive behandlet her. Brugerne opfordres til at forsøge så vidt muligt at fastslå, om det immobiliserede protein er stadig funktionel (fx hvis det er et enzym, gøre et enzym assay i mikrotiterpladebrøndene). Det vil give nogle tillid til, at agn er biologisk aktive, og derfor, at eventuelle opdaget interaktioner ernoget mere tilbøjelige til at have biologiske relevans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En grafisk afbildning af den procedure, der er beskrevet nedenfor (fig. 1) fremhæver de to primære komponenter til affinitetsudvælgelse ved hjælp af en fag-display-bibliotek: A) en fag-display-cDNA-bibliotek kan kode for proteiner med affinitet for agn og b) et oprenset rekombinant agn protein. Produktion af agn (rekombinant protein) er blevet grundigt undersøgt og litteratur skitserer bedste praksis for sikring af opløselig, aktiv rekombinant protein fra E. coli 12-13 eukaryot gær 14 insekt 15-16, plante 17-18 eller mammale 19-20 celler overflod.

I den følgende protokol, en hexahistidyl tagget rekombinant protein er blevet anvendt som madding. Dette giver mulighed for kontrol af, at agn proteiner forbliver i brøndene efter inkubation natten og vaske trin.

1.. ELISA for rekombinant protein Tilbageholdelse i mikrotiterpladebrøndene

  1. Mark amikrotiterplade med permanent blæk, og udpege hvilke brønde vil indeholde hvilket protein koncentrationer. Udfør denne i 3 gentagelser af brønde. Medtag 3 gentagelser af en negativ kontrol koncentration serie (non-hexahistidyl-mærket protein; BSA fungerer godt som denne baggrund check).
  2. Vask pladen grundigt med vand og fjerne vand ved afklapsning pladen på hovedet på 4 lag papir håndklæde mellem vaskene.
  3. Immobilisere i de første 3 brønde i 100 pi Tris, pH 7,5, (eller puffer) den højeste koncentration af det rekombinante protein (10 ug / ml). Læg til de næste tre brønde det rekombinante protein ved (1,0 ug / ml), osv., ned til 1,0 ng / ml. Gør det samme med BSA koncentration serien.
  4. Dæk retter med plastfolie og lad natten over ved 4 ° C.
  5. Næste morgen, fjerne protein ved afklapsning plade op og ned på 4-5 lag køkkenrulle.
  6. Vask brøndene 5x med 200 pi 1x TBS hver gang, forlader buffereni brøndene for ~ 1 min hver gang og fjerne buffer vask ved afklapsning pladen på hovedet på papirservietter efter hver vask.
  7. Bloker ELISA-pladen på en rotationsryster under anvendelse af 200 pi 5% (w / v) BSA eller 200 pi 5% (w / v) blokerende reagens i TBS ved stuetemperatur i 2 timer (eller sidder stationært natten over ved 4 ° C, hvis praktisk ) pakket ind i plastfolie.
  8. Fjern overskydende blokerende opløsning ved afklapsning pladen på hovedet på papirservietter. Vask 4x 1 min hver gang med 200 pi 1x TBS fjernelse af vaskeopløsningen ved afklapsning pladen hovedet.
  9. Fortynd penta-HIS primære antistof 1/2, 000 i blokerende buffer, og levere 100 pi til hver brønd. Inkuberes 1-2 timer ved stuetemperatur med pladen stationære.
  10. Fjern det primære antistof ved afklapsning pladen på hovedet på papirservietter. Vask 4x 1 min hver gang med 200 pi 1x TBST. Fjern hver vask ved afklapsning pladen på hovedet.
  11. Fortynd det sekundære antistof(Gede-anti-muse-alkalisk phosphatase-konjugat) i blokerende puffer og inkuberes 100 ul i hver brønd i 1 time ved stuetemperatur med pladen stationære.
  12. Fjern det sekundære antistof ved afklapsning pladen på hovedet på papirservietter. Vask 4x 1 min hver gang med 200 pi 1x TBST. Fjern hver vask ved afklapsning pladen på hovedet.
  13. Placer 200 pi af para-nitrophenylphosphat (pNPP)-substrat-opløsning i hver brønd. Underlaget er en solid ved -20 ° C, så gør portioner og hente det nødvendige antal portioner, der er nødvendige til påvisning ud af fryseren i god tid, så det er helt optøet ved denne fase.
  14. Ved 30 min stoppe reaktionen ved tilsætning af 50 pi 3 M NaOH til hver brønd.
  15. Læs absorbans ved 405 nm straks på ELISA-pladelæser.

Bemærk: Hvis det rekombinante protein af interesse ikke knytte sig til brøndene, er det muligt at ændre the sammensætning / pufferens pH betydeligt (Carbonat pH 10,0) eller tilføje kaotroper (urea) for at forsøge at hjælpe protein fastgørelse til mikrotiterpladebrønde. Men genetablere at det rekombinante protein: 1) forbliver bundet til mikrotiterpladebrøndene under de betingelserne for udvælgelse affinitet og 2) bevarer sin biologiske aktivitet efter fjernelse af den høje pH / kaotrop anbefales.

2. Voksende bakterieværten (BLT5403) for titrering

  1. Autoklave (figur 2A) ti 250 ml Erlenmeyer-kolber og 3 podningsrør. Gør LB væske og LB-agar til at hælde faste medier plader. Cool LB-agar til 50 ° C og tilsættes ampicillin til 100 ug / ml inden aseptisk strømmer ind petriskåle i et stinkskab (figur 2B).
  2. Også i et stinkskab (figur 2B) streak en LB, 100 ug / ml ampicillin (LB AMP100) agarplade for enkelte kolonier af BLT5403 fra lager holdes i 15% (v / v)glycerol ved -80 ° C (figur 2C). Placer pladen på hovedet ved 37 ° C natten over i en inkubator for vækst (Figur 2D).
  3. I morgen, pode 50 ml LB AMP100 i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe med en enkelt koloni plukket fra pladen. Der inkuberes ved 37 ° C, 200 rpm i en horisontal ryster (figur 2E og 2F) og bruge et spektrofotometer til overvågning celledensitet på OD600 = 0,5 til 0,6 (figur 2H).
  4. Hæld cellerne i et 50 ml Falcon rør eller lignende, og holde ved 4 ° C indtil brug (figur 2G). Celler vil normalt være rentabelt for ~ 1 uge.
  5. Lav 500 ml LB, som anbringes i en forvirret Fernbach kolbe og autoklaver den. Når det er sterilt, anbringes kolben ved 4 ° C (figur 2G) eller stuetemperatur, indtil natten til "DAY ONE" nedenfor.

Bemærk: Værten bakteriecellerBLT5403, der udtrykker et plasmidbåret kilde til T7 native capsidprotein uden hvilken T7 midten, og lav-kopi vektorer kan ikke replikere succes, er yderst modtagelige for virusset. Det er bydende nødvendigt at undgå forurening. Forurening i sidste ende vil ske på hvilket tidspunkt alle overflader i kontakt med virus / inficerede bakterier skal tørres af med 70% (v / v) ethanol eller skrubbes bruge vaskemiddel (figur 2I). Hvis dette er ineffektiv, er en grundig sanering af alle overflader, der tåler Envirocide (figur 2J), der kræves. Start BLT5403 celler fra fryseren lager hver ny runde af affinitet udvælgelse for at afhjælpe forurening af bestanden i 4 ° C, og sikre energiske celler bliver brugt i protokollen. Filter barriere pipettespidser er afgørende.

3. Affinity Selection

Dag ét

  1. Markér en mikrotiterplade med permanent blæk, og udpege hvilke brønde vil indeholde hvilke protEins / ændringer. (På grund af forureningsproblemerne, er pladerne aldrig genbruges). Udfør denne i 3 gentagelser af brønde for hvert protein og behandling.
  2. Vask pladen grundigt med vand og fjerne vand ved afklapsning pladen på hovedet på 4 lag papir håndklæde mellem vaskene. Immobilisere i 100 pi Tris, pH 7,5 (eller puffer) det rekombinante protein (10 ug / ml) i seks brønde eller BSA (10 ug / ml) i tre brønde til i alt 9 brønde til første runde af affinitetsudvælgelse. Dæk skålen med plastfolie og lad natten over ved 4 ° C (figur 2G).
  3. Sørg for, at der er 9 x 250 ml Erlenmeyer-kolber (se 2.1 ovenfor) rengøres, autoklaveres og mærkes på passende måde (kodning med farvet tape fungerer godt, figur 2F).
  4. Beregn mængden af ​​faglysat bruge til hver brønd baseret på titeren af ​​det bibliotek, der anvendes, og antallet af fag, der skal screenes.
  5. Sørg for, at friske BLT5403 celler er klar til brugtil titrering denne affinitet udvælgelsesrunde i morgen (figur 3A).
  6. Sørg for tilstrækkelig 1x TBS (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Base, pH 7,6) og 1x TTBS (1x TBS + 0,05% (v / v) Tween 20) er til rådighed til at udføre 10 x 200 ul vasker for antallet af brønde, der anvendes . Derudover præinkubere den TTBS ved affinitetsudvælgelse temperatur. Sørg for, at en backup, forseglet, 50 ml Falcon rør af 1x TTBS eksisterer ved temperaturen affinitet udvælgelse med tilstrækkelig 1x TTBS.
  7. Forbered 3 behandlinger x 3 gentagelser x 3 tre eksemplarer af 1,5 ml Eppendorf-rør (27 i alt) med 990 ul LB 100 AMP hver og mærke passende (fx 10 -2). Disse er for de inficerede bakterier hentet fra mikrotiterpladebrøndene morgen. Afmærk fortynding på den ene side af røret (10 -2) og et stigende antal på den anden side ("1"). For hvert Eppendorf-rør, også mærke et borsilicat rør og en LB 100 AMP plade. I denne way pladerne og borosilicate reagensglas nummereret 1, 2, 3, 4, 5, osv. at gøre titrering gå hurtigere. Bagefter den simple tal kan matches til fortynding og behandling på Eppendorf rør (f.eks # 12 rør var den tredje tre eksemplarer af den første replikation af BSA kontrol til fortynding 10 -5). Store Eppendorf rør og LB 100 AMP-plader natten over ved 4 ° C (figur 2G og 3B).

For eksempel: Start mærkning 1,5 ml Eppendorf-rør i tre 10 -2 fortyndinger af fag fra BSA replikation ene samt 1, 2 og 3 (tre tredobbelte aflæsninger af fagtiteren for replikation én) og derefter markere borsilicat reagensglas 1, 2 og 3, hvor de inficerede bakterier vil blive blandet med ikke-inficerede bakterier og topagarose før hælde på LB 100 AMP agarplader (figur 3C).

  1. For den serielle dilutions, label Eppendorf-rør, og til hver, tilsættes 900 ul LB 100 AMP. Når de indledende fortyndinger (10 -2) af inficerede bakterier er lavet for hvert protein / behandling, replikation, og tre eksemplarer i morgen, vil de blive blandet godt og 100 ul taget fra dem og føjes til den relevante Eppendorf rør indeholdende 900 pi LB 100 AMP for 10 -3 fortynding (rør 4, 5 og 6 til replikering en BSA kontrol). Disse vil blive blandet godt i deres tur og 10 -3 fortyndinger vil blive anvendt til at gøre de 10 -4 fortyndinger (7, 8, 9). Brug 10 -4 fortyndinger for de 10 -5 fortyndinger (10, 11, 12) osv. at få titeren for den første af de tre BSA replikationer (brønde).
  2. Det samme vil ske for BSA replikation to (godt 2), BSA replikation tre (godt 3), de tre gentagelser af den forgiftede lokkemad, og endelig de tre gentagelser af agn brønde. Ved udgangen, bør der være rør mærket from 1-135 (135 er den sidste tre eksemplarer af sidste replikation af lokkemaden ved den maksimale fortynding af 10 -6). Gemme disse Eppendorf-rør natten over ved 4 ° C (figur 3C viser Eppendorf og borsilicat rør til alle fortyndinger af triplikater for de tre gentagelser (de tre brønde) af BSA.
  3. Start 2 eller 3 kultur rør BLT5403 celler (plukket fra enkelte kolonier fra en frisk stribet natten over LB AMP100 pladen; fra trin 2.2) vokser i inkubere shaker (figur 2E og 2F) som en overnatning kultur. Til 500 ml LB (punkt 2.5 ovenfor), tilsættes ampicillin til 100 mg / ml, og Fernbach kolben anbringes i klemme i rysteinkubator så det vil være på 37 ° C og beluftet den følgende morgen (figur 2F).

Bemærk: Runde tre og fire kan kræve omtrentlige fortyndinger af så meget som 10 -10 volumen pHage til volumen til LB AMP100.

DAG TO

  1. Næste morgen placere autoklaveres, tomme 9 x 250 ml Erlenmeyer-kolber (en for hver mikrotiterpladebrønd) i klemmerne i inkubering shaker. Podes 500 ml LB 100 AMP med 500 pi fra en af de overnattende kulturer af BLT5403 celler startede sidste nat (se trin 3.8 ovenfor), forsegle og starte det voksende (37 ° C, 220 rpm). Tænd spektrofotometer (figur 2H) og sæt den til absorbansen aflæses ved 600 nm.
  2. Tag mikrotiterpladen fra 4 ° C, fjernes plastfolien, og fjern eventuelt ubundet protein fra pladen ved at vaske 10x med 200 pi hver gang 1x TBS pH 7,5 og afklapsning pladen på hovedet på håndklædet papir mellem hver vask. Bloker med 200 pi 5% (w / v) BSA eller 200 pi 5% (w / v) blokerende reagens i TBS i 1 time (eller natten over hvis det er passende) med pladen indpakket i plastfolie.
  3. Skyl det blokerende solution 10x med 200 pi hver gang 1x TBST, smacking pladen på hovedet på 4 lag køkkenrulle mellem hver vask. Det er muligt at genopfylde brøndene med 200 ul vand på dette tidspunkt, dække dem med plastfolie og læg dem ved 4 ° C for at gemme i maksimalt 1 uge.

Bemærk: Start kulturen hurtigt nok, at ved den tid fagen inficerede-BLT5403 fra afslutningen af valget affinitet er klar til at tilføje, cellerne i de 500 ml er mellem 0,6 og 1,0 OD600. Hvis de vokser langt ud over 1,0, kan lysis ikke forekomme på grund af begrænsninger ressource som celler nærmer stationær fase. Hvis cellerne ikke nå en OD600 på 0,6 i det mindste forud for indførelsen af fag, kan mangfoldigheden af infektion være for høj, hurtigt at dræbe celler, som kan påvirke repræsentation af lysatet. Hvis cellerne endnu ikke nærmer sig en OD600 på 0,6 ved afslutningen af affinitetsselektion, inocUlate kolben med mere BLT5403 fra den anden (eller endog fra både anden og tredje) reagensglas omrystning ved 37 ° C (figur 2F). Hvis en OD600 på 1,0 nærmer for hurtigt, skal du slukke for varmelegemet og shaker og åbne låget for at afkøle den kultur og sulte bakterierne for oxygen. Genoptages opvarmning / ryster når fagen er blevet tilføjet.

Herfra bruge filter barriere tips til at undgå fag krydskontaminering.

  1. Når kolben podes, sætte fagbiblioteket (100 ul) i de proteiner, forsegl pladen med plastfolie, og der inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
  2. Ved 55 min, registrere OD600 af cellerne. Fordoblingstiden er omtrent hver 20 min. Handle i overensstemmelse hermed (se "Bemærk" ovenfor).
  3. Ved udløbet af en time fjerne plastic wrap fra pladen og vaske ved at ryste ud af fag i den transformerede affald og derefter hurtigt tilsætte 200 pi 1x TBST. (Brug en multipipettor med en 1 = 100 pi hovedet og pipette indstillet på 2 [dvs leverer 200 ul / stemplet depression] for dette, og det går hurtigt). Indstil en timer til 1 min. Efter 1 min, ryst buffer i transformeret affald, lugter plade op og ned på et stykke køkkenrulle og læg tilbage på bænken (25 ° C plade). Gentag vasketrin 10x.
  4. Efter den 10. vask, tage 200 pi BLT5403 celler fra 50 ml Falcon rør ved 4 ° C og læg dem i bunden af brønden, hvorfra den sidste vask af TTBS er blevet fjernet. Pak pladerne i plast wrap og sat ved 37 ° C i 20 min for at få nogen fag stadig sidder fast til agn til at inficere bakterier (se note i diskussionen om vedvarende hentet fag og / eller høj baggrund fra ukritisk bindende fag).
  5. I slutningen af 20 minutter, pakke pladerne og tage 10 ul bakterier fra BSA ved 25 ° C replikation én godt og sætte det i 990 ul LB 100 AMP mærket"1". Gentag to gange mere for at godt (rør 2 og 3), hvilket resulterer i 3 triplikater i 1/100 fortyndinger af fagen fra så godt. Dette er BSA replikation i stikprøven tre gange. Disse fortyndinger skal bruges til at vurdere den gennemsnitlige titer ± SEM for at replikation af BSA.
  6. Gør det samme for replikation 2 og 3 i BSA (tre tredobbelte prøver af 10 pi hver), for de tre replikerede brønde af den forgiftede lokkemad protein og for agn protein. Indstil disse 27 Eppendorf-rør til side og få de resterende 170 ul af de inficerede bakterier i brøndene vokser mod lysis.
  7. Hvis bakterierne i kolben på OD600 = 0,6-1,0 dekanteres 50 ml celler fra Fernbach-kolbe i hver af de ni 250 ml Erlenmeyer-kolber. Tag de resterende 170 pi fag-inficerede BLT5403 bakterier i BSA replikation 1 boringen og føje den til de 50 ml celler mærket "BSA Rep 1" (gul tape). Gør dette for alle ni brønde og sætte dem ryste i inkubatoren (
  8. Overvåg cellerne i 37 ° C inkubering rysteapparat fra tid-til-tid for lysis (ca. 3 timer fra podningstidspunktet). Gør fortyndinger fra de 27 indledende fortyndinger (10 -2) i det egnede, mærkede Eppendorf-rør i denne periode.
  9. For at udføre disse fortyndinger fra de første 27 fortyndinger fra 3.12 ovenfor tage 100 ul af LB med bakterier fra Eppendorf rør 1 (BSA replikation én første af de tredobbelte prøver fra denne 1/100 fortynding fra dette godt) og føje den til 900 ul LB i Eppendorf rør 4 (1 x 10 -4 fortynding af BSA replikation én, første af de tredobbelte prøver fra dette godt).
  10. Kassér filteret barriere tip til en ny, før det bliver 100 ul af LB med bakterier fra Eppendorf rør 4 for at tilføje til de 900 pi LB i Eppendorf rør 7 (1 x 10 -5 udvanding af BSA replikation én, først i tre eksemplarer prøver fra denne godt). Fortsætte de fortyndinger (Degne til 1 x 10 -6) for alle tre eksemplarer af alle gentagelser af alle proteiner og behandlinger (135 rør i alt).
  11. Når cellerne er lyseret, bringe kulturen til 0,5 M NaCl ved tilsætning af 5 ml fra en 5 M NaCl lager og overføres til et mærket centrifuge-flaske.
  12. Centrifuger ved 8.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Dekanteres supernatanten (virus) i en ren, steril 50 ml Falcon-rør.
  13. Tilsæt et par dråber chloroform til den dekanteret supernatant i Falcon røret.
  14. Opbevares ved 4 ° C for den næste runde af affinitetsudvælgelse.

4.. Dag tre

  1. Autoklave eller afblege alt laboratorieudstyr, der er blevet brugt til at frembringe denne affinitet udvælgelsesrunde at forberede sig til næste runde.

5.. Titrering

  1. Nummer som mange solide LB 100 AMP-plader, som der er fortyndinger i stigende rækkefølge (der skal nu være 1 plade for hver borosilicate rør og Eppendorf rør, hver med samme nummer). Put pladerne i 37 ° C inkubator (figur 3D).
  2. Smelt topagarose (1,0 g Bacto trypton, 0,5 g gærekstrakt, 0,5 g NaCl, 0,6 g agarose, at til 100 ml autoklave) ved at løsne den øverste agarose låget og skiftevis microwaving flasken og hvirvlende det at blande det indtil toppen agarosen er helt smeltet. Flasken sættes i vandbad for at afkøle til 50 ° C (figur 3E).
  3. Tag en borsilikat 10 ml pipette med en pipette pumpe vedlagt. Tænd et bunsenbrænder. Drej en styrofoam Falcon rør indehaver eller køligere låg på hovedet på bænken og placere LB100 AMP pladerne 1 til 6 (frisk ud af 37 ° C inkubator) på det, Plate 1 øverste (figur 4A). Styrofoam holder pladerne varm.
  4. Put 250 ul BLT5403 celler fra 4 ° C i hver af de nummererede borosilicate reagensglas forberedt på dag ét ovenfor (afsnit 3.7 og 4B og 4C). Arspænder de nummererede borosilicate rør i samme opadgående serie som fortyndinger i de 1,5 ml Eppendorf-rør (figur 4A).
  5. Put 100 gl fra fortyndingen i Eppendorf rør 1 i de 250 pi af celler i borsilikat reagensglas 1 (figur 4D og 4E). Varm første 5 i af pipetten over flammen lidt (ikke for meget! ~ 3 aflæser, figur 4F) og fordybe sig i den smeltede topagarose. Træk op 3 ml og levere hurtigt i reagensglasset på toppen af celler / fag (figur 4G).
  6. Bland ved at svirpe med en finger, mens du holder røret med den anden hånd (Figur 4H) og hælde indholdet på pladen (figur 4I). Vip pladen og bruge reagensglas at jage bobler og tørre pletter, indtil hele pladen er dækket af den øverste agarose. Sæt den til side, opretstående på bænken til afkøling.
  7. Kassér borsilicatet rør, skubbe filteret barriere tip, få enfrisk og fortsætter, indtil alle fortyndinger er belagt. Hent LB 100 AMP-plader fra inkubatoren, som de er udtømte, men ikke mere end 6 ad gangen eller de afkøles og topagarose størkner for hurtigt.
  8. Når topagarose er solid, vend pladerne på hovedet (det er vigtigt at gøre dette). Ellers agar / agarose "græder" kondenserer på låget falder ned på den øverste agarose og løber over den, under fagen med det gør det umuligt at titer nøjagtigt), og enten: 1) at bringe pladerne i 37 ° C inkubator [være tilbage 4 timer senere at tælle titeren da T7 er aggressiv] Eller: 2) Lad dem op og ned på bænken og de er klar næste morgen at tælle titer.
  9. At tage alle nødvendige forholdsregler for at beskytte mod glasset knuses eller personskade, hvis det gør, satte topagarose låget tilbage på løst og mikrobølge den topagarose indtil det koger. Gør dette to gange. Lad den køle af, strammehætte og lægge det væk. Drej vandbadet ned til sin sædvanlige temperatur eller lukke den ned. Sæt fortyndinger i 4 ° C køleskab. De vil være behov for at fortolke titre og / eller gentage nogle af titrering.

6.. Fastlægge og beregne Titer

  1. Undersøg plak dannes på pladerne og kassér dem med sammenflydende lysis (figur 5A fx 10 -2 fortynding). Afgøre, hvilke af de resterende seriefortyndinger har produceret tilstrækkeligt få plak at muliggøre en nøjagtig optælling (5A en nd 5B). Registrere antallet af plak fra disse plader (tabel 1, figur 5B).
  2. Gange antallet af plak ved fortynding og derefter multiplicere dette tal med 100 for at få antallet af plakdannende enheder per ml af inficerede bakterier taget fra brøndene (dvs. kun 10 ul af inficerede bakterier blev taget for hver af de tre eksemplarer og so dette skal ganges med 100 for at få tællinger per ml). Gennemsnittet antallet af plakdannende enheder (PFU) per milliliter (PFU / ml ufortyndet inficerede bakterier taget ud af mikrotiterpladebrønd), på tværs af de tre tredobbelte taget fra dette godt.
  3. Danne en Grand Gennemsnittet af optællinger for tredobbelte brønde og beregne standardfejlen dette gennemsnit (tabel 1). Dette er, hvad vil blive registreret i figuren af stigningen i fagtiteren for hver affinitetsselektion runde og behandling (figur 5C).

7.. Plaque-isolering og PCR og sekventering

  1. I slutningen af ​​affinitet udvælgelse runde 4 skal du vælge 18 individuelle, veldefinerede, plaque kolonier og ved hjælp af en steril Pasteur-pipette, tandstikker, gul pipettespids eller lignende enhed, core disse plak fra titrering plader. Hvis der anvendes rør eller tips første våd indersiden med Tris-HCI, pH 8,5 i Eppendorf-rør (fig. 5D).
    2. (figur 5E). Frigør pæren med pipettespidsen stadig i agar / topagarose og suge kernen (figur 5F, se pil).
  2. Pres kernen i 100 pi Tris-HCI, pH 8,5 i den passende rør (figur 5G) og vortexes kort.
  3. Opvarm 20 ul af denne volumen ved 65 ° C i 10 min.
  4. Centrifugeres den opvarmede volumen ved 13.000 xg i en bordcentrifuge ved stuetemperatur i 10 min. Tag 3 pi fra supernatanten af ​​denne portion, der skal anvendes i PCR-reaktioner med T7-UP og T7-DOWN primere.
  5. For hver af de 18 isolerede plak, opvarmede opløsninger, lave en 50 ul PCR-reaktion under anvendelse af en annealingstemperatur på 58 ° C og 35 cykler.
  6. Kør 20 ul each reaktion på en 1% (w / v) agarosegel indeholdende 0,015% (v / v) ethidiumbromid. Visualiser med et transilluminator anvendelse af passende øjenbeskyttelse og nitril lab handsker. (ADVARSEL: ethidiumbromid er et potent mutagen.) Fotografi gelen og bortskaffe forurenet materiale korrekt (figur 6A og 6B).
  7. Hvis amplikonerne enkelte produkter, og ikke fra tom vektor (produktet kører næsten 100 bp på en 1% (w / v) TAE agarosegel, 6A og 6B pile), rense de resterende 30 fil til brug som en sekventering skabelon. Hvis ikke et enkelt produkt på gelen (figur 6B, plaque 15), skåret ud af de mest fremtrædende bånd (r) fra gelen og ekstrahere DNA fra gelen ved hjælp af et kit.
  8. Sequence amplikonerne, der ikke er tomme vektorer ved hjælp af T7-UP primer.
  9. Undersøge hver sekvens for linker-arme, og fra denne information, bestemme, hvor påbegyndelsen af ​​indsatsen er placeret. Brug Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, National Library of Medicine) for at bestemme identiteten af ​​den kodede cDNA, hvorvidt indsatsen er i ramme, og hvis ja, hvad er del af proteinet sekvens (CDS) er blevet vist, og fanget af agn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

At være i stand til at forringe kapaciteten af ​​agn til at interagere med fag-viste proteiner (metabolisk forgifte lokkemad) giver en potent negativ kontrol for denne teknik. Det er også tilrådeligt at afgøre, om den lokkemad, når det er bundet til mikrotiterpladebrønd, bevarer sin funktion. Begge disse kontroller vil øge tilliden til at interagere, fag-viste proteiner inddrives af nonpoisoned agn er legitime.

Stikprøver tre tre eksemplarer fra hver brønd tilføjer væsentligt til den tid og arbejde involveret i udvælgelsen affinitet, men giver et mere præcist skøn over titeren inden for hver godt end prøveudtagning kun én gang. Mens de fleste af de titre for de tre eksemplarer er i god aftale, opmærksom på, at de tre eksemplarer for replikation 2 af BSA i runde fire varierer meget (tabel 1). Ved prøveudtagning flere gange, er de endelige estimerede optællinger er ikke så modtagelige for pipetteringsfejl og en mere præcis estimat af than faktisk titer og variationen omkring dette skøn, well-to-godt, opnås (tabel 1, figur 5C).

Stigende fagtiteren, fortrinsvis for nonpoisoned agn, da antallet af affinitetsudvælgelse runder stigning giver også tillid til, at teknikken arbejder (figur 5C). Fastholdelsen af en stigende procentdel af fag indeholdende insert i nonpoisoned agn brønde som antallet af affinitet valg stiger er også lovende (figur 6A og 6B).

Efter avancerede runder af affinitetsselektion, en stigning i antallet af selvstændigt genvundet fager, der indsætter (mærkbar PCR amplikoner større i størrelse end ~ 100 bp; figur 6B), i forhold til den første runde (fig. 6A), og løsning af disse amplikationsprodukter på få identisk mellemstore bands (note banerne 5-9, 11-18 i figur 6B </ Strong>), er en god indikation af, at bestemte kloner udvælges på udvælgelse affinitet (figur 6A og 6B). Efter sekventering af et antal af plak opnås i den endelige affinitet udvælgelsesrunde, hentning af et tilsvarende område (forskellige kloner) af det samme protein er uafhængig verifikation af, at den del af det viste protein har en bona fide affinitet for agn. Disse selvstændigt genvundet fag giver også oplysninger om, hvilken del af den samlede protein er i stand til at interagere med agn. Hvis fag viste cDNA bibliotek er blevet konstrueret ved hjælp af random priming, kan en stor mangfoldighed af partielle og fuldlængde protein dækning forventes (inden for rammerne af det fag at tolerere cDNA indsættelse størrelse), hvilket fører til flere uafhængige kloner dækker den samme del af proteinet. Selv de tilstødende out-of-frame hits skal undersøges for at afgøre, om de koder et lignende motiv, som badet binder. (Dette forudsætter, at bibliotekerne ikke blev konstrueret ved anvendelse ORF-teknologi 3).

Tabel 1
Tabel 1. Beregninger for den gennemsnitlige titer / ml inficerede bakterier fra brøndene i den fjerde runde af affinitet selektion for de tre behandlinger. Tallene for hver tre eksemplarer af 10 -3 fortynding af plak fra det første replikation af agn godt er taget fra figur 5B. Klik her for at se større tabel .

Figur 1
Fig. 1. Samlet grafisk afbildning af fag-display-processen A) adgang til et fag viste bibliotek, fortrinsvis konstrueret ved hjælp af tilfældigt primet, poly-A valgt RNA, til generering cDNAerne, og B) en agn, der er, så vidt muligt, verificerbare som biologisk aktive, selv når immobiliseret på en fast støtte og om muligt gøres inaktive ved tilsætning af en inhibitor (fx inhiberes kompetitivt at binde agn protein). RT: revers transkription.

Figur 2
.. Figur 2. Nogle af udstyr og materiel er nødvendige for at udføre fagdisplay Steril teknik kræver adgang til både: A) en autoklave og b) en laminar flow hætte. Fagbiblioteker og BLT5403 bakteriel lager kræver -80 & # 176 c temperaturer for længere tids opbevaring C) Voksende fag og bakterier kræver DF): 37 ° C væksthuse, hvoraf den ene, EF), er i stand til voksende flydende kulturer (orbital). Optimering eksperimentet gennem farvekodning, F) minimerer fejl. BLT5403 celler til titrering kan opbevares i op til en uge, G) ved 4 ° C. Optimering af placeringen af, H) spektrofotometer til følgende celledensiteter siden det kredsende rysteapparat kan spare tid. Ofte behandle overflader og pipetter med, I) kraftig vaskemiddel og J) Envirocide, kan bidrage til at minimere risikoen for viral kontaminering. Klik her for at se større billede.

85fig3.jpg "fo: src =" / files/ftp_upload/50685/50685fig3highres.jpg "/>
Figur 3. En mulig opstilling nyttigt for at tillade glat affinitetsselektion. A) BLT5403 dyrkes en dag eller to før titrering og udplades uden viral introduktion, at fastslå, at de ikke er kontamineret med virus. Titrering på dagen for valget affinitet kan lettes ved at forberede på forhånd af: B) prelabeling Eppendorf og C) der borsilicathulsfærer rør skal bruges B) alikvoteringsprocessen de fortyndingsopløsninger LB 100AMP og opbevare dem ved 4 ° C natten over D.. ) Placér prenumbered, LB 100AMP agarholdigt, petriskåle ved 37 ° C for at varme ca 1 time før titrering. e) Smeltepunkt den sterile topagarose (løsne cap) og placere den i en forvarmet 50 ° C vandbad til afkøling til denne temperatur en time før titrering påbegyndes. Brug en lead donut at undgå flasken kæntring som topagarose fjernes. Klik her for at se større billede.

Figur 4
Figur 4.. Titrering fag genvundet fra en runde af affinitet valg. Plating påbegyndes snarest muligt efter infektion for at forhindre en kunstig oppustning af titer. A) Det første sæt virusinficerede BLT5403 fortyndinger og borsilicatmaterialerne rørene samles i reoler. Brug filter barriere tips: BC) 250 ul BLT5403 celler fra bestanden fra 4 ° C overføres til borsilicatmaterialerne rør. Brug filter barriere tips: DE) BLT5403 i første borosilicate rør er inficeret med first virusfortynding. F) Borsilicatet pipette opvarmes over en åben flamme til at forhindre tilstopning og holde topagarose varm. . Må ikke opvarmes pipetten overdrevent eller bakterierne vil blive skoldet og dø G) 3 ml smeltet topagarose er hurtigt hentet og hældes over bakterier i borsilicatet rør H) Røret knipsede kortvarigt at blande indholdet og. I) Indholdet hældes på de forvarmede LB 100AMP agarplader, ved hjælp af rør til at flytte boblerne til siderne af pladen og sikre topagarose dækker hele pladen. Klik her for at se større billede.

Figur 5
Figur 5. Typisk titer reresultater. A) lavere fortyndinger (10 -2) næsten altid resultere i sammenflydende lysis for alle behandlinger i første affinitetsselektion runde (virus i figuren er blevet dyrket alt for lang resulterer i overdreven plak størrelse for at lette fotografering). B) De passende fortyndinger af plak tælles ved hjælp af en sharpie at holde styr på Optalte plak. C) de titer stiger drastisk for agn brønde, mens de resterende mere eller mindre stabile BSA eller forgiftet lokkemad. I senere runder, titer fra agn brønde plateauer og yderligere udvælgelse affinitet er uproduktive. D) Et godt isoleret plaque er blevet valgt til sekventering og indsamlet af fugte Pasture pipette med opløsningen fra Eppendorf rør, og sørg for at fjerne den overskydende væske mindst det køre over flere plak og forurene kernen. E) Pipetten er blevet skubbet gennem mindeplade med pipetten pære allerede komprimeret. F) Pæren er blevet frigivet, mens pipetten er stadig i top agarose, suger plaque op i pipetten (pil). G) uden kernehus plak er ved at blive leveret i væsken i den relevante Eppendorf rør. Fag-fortyndinger (volumen af inficerede bakterier pr volumen LB 100AMP) er afbildet på petriskåle (fx 10 -3 = 1/1, 000 fortynding). De tre tredobbelte prøver fra replikation og 1 forkortes Trip. 1, Trip. 2, og Trip. 3, alle for replikation 1 (Rep 1 = godt 1). Tallene i bunden af pladerne i B) er de faktiske plak numrene optalt på pladerne. Disse er for de 10 -3 fortynding af bakterierne fra den fjerde runde af affinitet selektion (R4 i figuren) over agn. Klik her for at se større figur .


Figur 6.. Typiske PCR resultater for affinitet udvælgelse over en passende agn. A) Den procentdel af tomme vektor plak (pile) er normalt ganske høj i begyndelsen, men i agn brønde, B) falder i de efterfølgende runder. Pladen indeholder insert har haft tendens til at bosætte sig på dem, der indeholder identisk størrelse insert i dette senere affinitet udvælgelsesrunde. MWM: molekylvægtsmarkør.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ved at køre eksperiment i tre replikerede brønde, uafhængigt kan erhverves phag samme proteinbinding til agn skelnes, selv om de er de samme klon (dvs. ingen forskel i nukleotidsekvensen CDS region, der er opnået, men disse har været hentet fra uafhængige brønde). Ellers er den eneste måde at skelne mellem fager, der koder for det samme protein binding til agn er, hvis de uafhængigt er revers transkriberet regioner, der adskiller sig i en del af nukleotidsekvensen.

Anvendelsen af ​​en Fernbach kolbe at vokse alle bakterierne til anvendelse i amplificering af affiniteten valgte phag tillader en langt mindre hektiske overvågning af bakteriel vækst, der fører op til infektion efter affinitetsselektion end at forsøge at overvåge 9 Erlenmeyerkolber. Dekantering disse bakterier, lige før infektion i forvarmet Erlenmeyerkolber eliminerer også underbibliotek titer uoverensstemmelser på grund af alterationer i multiplicitet af infektion på grund af dårlig bakterievækst i specifikke kolber. Således bør ændringer i fagtiteren fra runde til runde afhænge af antallet af fag tilbageholdt i brøndene, og variationen i titer blandt replikerede brønde bør være minimal.

En enestående fordel ved anvendelse af fag-display er den store effekt har teknikken til at identificere phag-displayed-protein, der har en affinitet for en bestemt agn. På grund af den effektivitet, med hvilken fagen replikere i BLT5403 vært, selv en enkelt phag repræsenterer en sjælden CDS, der er fastholdt i en fordybning i den første affinitetsselektion runde, coat-fusionerede protein har en høj affinitet for agn, vil være repræsenteret i anden runde af langt større antal. Ved den fjerde runde, bør denne phag udgør størstedelen af ​​fagen til stede i den lyserede kultur.

Denne kapacitet fag at replikere til høj titer er også en begrænsning af technique. Hvis en bestemt agn har et interagerende protein partner, for hvilke det har høj affinitet i biblioteket, er det meget svært at fange proteiner, der lovligt kan binde lokkemaden, men til en lavere affinitet, da disse vil have en tendens til at blive udkonkurreret af højaffinitets-bindende protein . Brugen af næste generation sekventering teknikker til at identificere sådanne sjældne fag er en mulig måde at omgå denne begrænsning 1. Desuden modtagelighed BLT5403 til T7 fag resulterer i anfald af "forurening" i hele laboratoriet, der kræver udholdenhed, snarere barske dekontaminanter (f.eks Envirocide) og fremragende steril teknik til at overvinde. Forurening kan resultere i et betydeligt tab af tid i udviklingen af ​​affinitet markering som man forsøger at identificere og eliminere kilden.

Et middel, der har begrænset succes med partitionering fag ind i snævre og løs "bindemidler" er at forsøge at inddrive den løse bindemidler første by indførelse i brøndene en opløsning (1% SDS eller lignende kaotrop) designet til at fjerne fager, der er mindre tæt bundet til agn. Denne opløsning kan derefter fjernes først, før indførelsen af ​​bakterier i brøndene, som forventes at være inficeret med de fager resterende bundet til agn. Denne teknik kan også reducere baggrunden, spuriously bindende fag, betydeligt. Men hvis denne teknik forfølges, er antallet af underbiblioteker, gentagelser og dubletter affinitet valgt i efterfølgende runder fordoblet, som tilføjer væsentligt til den tid og omkostninger.

Efter forløbet af fagtiteren stigning over flere runder af affinitetsselektion kan løbe gennem et stort volumen af LB og et stort antal af LB 100 AMP plader, filter barriere tips Eppendorf-rør, osv.. Det er dyrt, som det er sekventering forpligtet til at undersøge selv et beskedent antal fag. Titrering et stort antal fortyndinger af flere gentagelser af treatments i tre eksemplarer kræver megen tid, så det er vigtigt at sætte op så meget af materialet som muligt dagen før valget affinitet er altafgørende.

En spændende mulighed, der i øjeblikket undersøges, er at bruge placeringen af ​​de uafhængige fag-proteiner til at binde til en lokkemad, til at modellere de fysiske egenskaber og den tredimensionelle struktur af den region af proteinet interagerer med agn. For eksempel undersøger de attributter af protein-targets, der er bundet til et sæt af homolog sen embryogenese Rigelige (LEA) proteiner fra Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) og sojabønne (Glycine max), en vigtig konklusion var, at LEA-proteiner bundet til den region af proteiner, der var de mest (eller blandt de mest) hydrofile af bindingsproteiner 11. Retrospektivt, da LEA proteiner hypotese at beskytte deres klient molekyler fra denaturering under dehydrering, kan det være surmised at regionen af ​​de klient molekyler mest modtagelige for dysfunktion uden LEA beskyttelsen kan være de mest stand til at binde vand (hydrofile).

Det er tilrådeligt at minimere tiden mellem indførelsen af ​​bakterier i brøndene, og deres hentning så titeren ikke er oppustet. Sørg for, at fortyndinger er tilstrækkelige ved udpladning nogle BLT5403 uden virusinfektion at kontrollere, at den bakterielle bestand ikke forurenes, og at de største fortyndinger er tilstrækkelige til at undgå sammenflydende lyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Dette projekt blev delvist finansieret af en NSF IOS (0849230), Hatch, Mclntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA Seed Grant (2011-04.375), og Sir Frederick McMaster Research Fellowship til ABD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone Becton Dickinson Co. 211705
Yeast Extract Becton Dickinson 212750
Agar Becton Dickinson 214010
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Agarose Research Products International A20090
Blocking Reagent EMD Chemicals Inc. 69064
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-212
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher Scientific BP166-500
Tris Base Fisher Scientific BP152-5
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1
Escherichia coli BLT5403 EMD Chemicals Inc. BLT5403 Genotype: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicillin, Sodium Salt Research Products International A40040
Ethidium bromide Fisher Scientific BP102-1
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich Corp. A-9647
Penta-HIS primary antibody Qiagen Inc. 34660
Goat anti-mouse alkaline phosphatise conjugate Sigma-Aldrich Corp. A-5153
para-Nitrophenylphosphate Sigma-Aldrich Corp. N-7653
T7-UP primer EMD Chemicals Inc. 5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'
T7-DOWN primer EMD Chemicals Inc. 5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'
Qiaquick PCR Purification kit Qiagen Inc. 28104
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen Inc. 28706
Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Invitrogen Life Technologies 4336917
Heating Block Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) 18780
96-well Cell Culture Plates Corning Costar 3590
Isotemp Incubator Oven Fisher Scientific 516D
Pasteur Pipettes, 5 ¾ in Fisher Scientific 13-678-20A
ChromaView Transilluminator UVP Inc. TS-15
UV Shield Oberon 071AF
Gloves, Nitrile Fisher Scientific 19-170-010C
Sterile 1.5 ml tubes USA Scientific Inc 1615-5500
10 ml Borosilicate Pipettes Fisher Scientific 13-678-25E
Borosilicate culture tubes Fisher Scientific 14-961-27
Uniskan I, ELISA plate reader Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland Type 362

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
  2. Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
  3. Li, W. ORF phage display to identify cellular proteins with different functions. Methods. 58, 2-9 (2012).
  4. Willats, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).
  5. Konthur, Z., Crameri, R. High-throughput applications of phage display in proteomic analyses. Targets. 2, 261-270 (2003).
  6. Chen, T., et al. Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning. J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).
  7. Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).
  8. Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).
  9. Egli, D. B., Bruening, W. P. Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean. Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).
  10. Badotti, F., et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).
  11. Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display. Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).
  12. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).
  13. Gasser, B., et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).
  14. Daly, R., Hearn, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).
  15. Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).
  16. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
  17. Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).
  18. Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions. Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).
  19. Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production. Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).
  20. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).

Tags

Biochemistry Affinity udvælgelse Phage display interaktion protein-protein-
En protokol for fagvisning og Affinity Selection Brug rekombinant protein Lokkemad
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kushwaha, R., Schäfermeyer, K.… More

Kushwaha, R., Schäfermeyer, K. R., Downie, A. B. A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits. J. Vis. Exp. (84), e50685, doi:10.3791/50685 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter