Summary
ファージディスプレイは、関心対象の固定化分子と相互作用するタンパク質又はタンパク質部分をキャプチャするための強力な技術である。作成するファージcDNAライブラリーの種類や画面の決定がなされると、ここで説明するプロトコルは、相互作用物質の同定をもたらす効率的な親和性選択を可能にする。
Abstract
固定化ベイト分子に方向性クローニングされたcDNAライブラリーによってコードされる種々のタンパク質部分を提示するための足場として組換えファージを使用して、相互作用を発見するための効率的な手段である。技術は、主に、タンパク質 - タンパク質相互作用を発見するために使用されてきたが、チャレンジするベイト分子がタンパク質に限定される必要はない。ここで紹介するプロトコルは、餌の適度な数が同じタンパク質を提示する独立したクローンの同定を最大化するために反復してスクリーニングすることができるように最適化されている。これは、識別された相互作用するタンパク質を餌分子の合法的な相互作用因子であることを大きな自信を可能にします。各親和性選択後にファージ力価のモニタリングは、ラウンドの親和性選択はネガティブコントロールの有効性についてだけでなく、進行している方法に関する情報を提供しています。一つのファージを力価測定する手段と、どのように、どのようなこのプロセスは限り効率として進行させるために、事前に準備する可能では、提示される。独立したプラークを単離した後取り出したアンプリコンの属性は、親和性選択が進行しているどれだけ確認するために使用することができることを強調している。誤検知を最小限に抑えるか、永続的に回収したファージをバイパスするためにトラブルシューティングの技術が説明されています。ウイルス汚染を減少させる手段が議論されて燃え上がる。
Introduction
なぜファージディスプレイおよび親和性選択は、他の分子とタンパク質の相互作用を発見し、調査するための利用可能な無数の他の技術の代わりに使用？ファージディスプレイは、次のようなタンパク質-リガンド相互作用1-3を検出する他の方法に比べていくつかのユニークな利点を請求することができます。
餌分子の非常に広いレパートリー
最も重要な理由は、親和性選択4に餌として作用することができる分子の多様性にある。ファージディスプレイは、ポリマー/分子が回収支持体に付着させることができる場合には本質的に、それは、ファージ表示されたタンパク質との親和性についてスクリーニングすることができる他のタンパク質、ヌクレオチド、炭水化物、 等 5と相互作用するタンパク質フラグメントを単離する非常に強力な手段である。条件をrに加えて使用される場合、ベイト分子は、6を固定化したときに生物学的活性を保持するかどうかを決定するためにアクセスすることができるその活性を除去する/引き出す親和性選択の前に餌の翻訳後修飾を導入するために、6又は有効である。
無関係な要因によるファージ耐性
それはいくつかの餌がその相互作用タンパク質、またはファージ表示されたタンパク質を捕捉するために環境ストレス（熱、高浸透圧調節物質濃度が、特定の補助因子、等 。）を必要とする可能性があるということであるファージディスプレイを使用するための第二の理由は、何らかの方法で改変される必要があり得る親和性選択の前に。研究されている主な要因は、餌とタンパク質、ではないが、試験生物に致死的である場合には相互作用が発生することを可能にするか、条件の間の相互作用である。それは（T7生存率の公表サーマル最大値は〜60℃で7でEG）無傷で、生存の両方過酷な実験条件に耐えることができるので、T7ファージは、そのような研究に特に適しています。プロファージディスプレイを変化させることの一例として修復酵素のタンパク質基質のためのシロイヌナズナ種子プロテオームを調べるときteinsは、タンパク質イソアスパメチルトランスフェラーゼ（PIMT）は、これらの研究で使用されるウイルスは、導入を奨励するために、以前の各親和性選択へのラウンド、1週間、「高齢者」だったイソアスパラギン酸の認識と修復/このような異常を代謝することができる生物では不可能である影響を受けやすいタンパク質6（イソAsp）残基。
代謝的に不活性
さらに、ファージは、通常、代謝毒と、少なくとも、代謝活性のある試験生物に対する多面的な効果をもたらすであろう小分子干渉に対して耐性である。ストリンジェンシー洗浄の後、毒は毒が細菌やその後のファージ複製に無害な範囲に希釈されるので、細菌の大ボリュームが感染のために導入される前に削除されます。 PIMT修復のタンパク質標的を調査しながら、酵素、S-アデノシルメチオニン（AdoMetは）はで固定し、酵素を不活性化し、有用なネガティブコントロールを提供するために、S-アデノシルホモシステイン（AdoHcy）に依拠しながら、標的タンパク質の捕捉を可能にするマイクロタイタープレートウェル固定化酵素を活性化するために使用されたウイルスが悪のAdoMetやAdoHcy 6のどちらかに影響されないであろうという知識。さらに、特定の後期胚形成のメンバーは、この研究室で調査豊富（LEA）タンパク質ファミリーは、このような点で、ダイズ種子中の200mMの高濃度を得ることができるスクロース8、のような添加剤の存在下でその形状を変えることが知られている生理学的成熟度9の。ウイルスは、自律的に実行可能な試験生物10の場合ではない、特定のLEAクライアントタンパク質相互作用のための可能性に必要な各アフィニティー選択ラウンド、200 mMスクロースの添加によって影響されると予想されていません。
このラボでは、discoverinに焦点を当てている脱水11または種子を06吸収された後イソAsp形成を受けやすい記憶されたプロテオームの構成部品の修理中に記憶されたプロテオームの保護機構の根底にある、成熟した脱水もしくは発芽種子におけるgタンパク質-タンパク質相互作用。このため、生産、精製、アクティブ状態の餌として必要な組換えタンパク質の、それらが固定化される前と後しばしば困難、我々の仕事への基礎となるものですが、彼らは、そうしたままであることを確認。それぞれの組換えタンパク質生産のシナリオが異なるしかしながら、組換えタンパク質生産のための最適条件は、ここでは扱われないでしょう。ユーザは、（それが酵素である場合には、例えば 、マイクロタイタープレートウェルに酵素アッセイを行う）固定化されたタンパク質が依然として機能しているかどうかを決定するために、可能な限り試みるように付勢されている。これは、任意の発見の相互作用があることを、餌がありますので、生物学的に活性であり、いくつかの信頼性を提供しますもう少し生物学的関連性を有する可能性が高い。
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Protocol
、B）精製された組換え餌餌に親和性を有するタンパク質をコードする可能性が高いA）ファージディスプレイcDNAライブラリーと：（ 図1）以下の手順を視覚的に表現し、ファージ·ディスプレイ·ライブラリを使用した親和性選択のための2つの主要コンポーネントをハイライトタンパク質。餌（組換えタンパク質）の産生が盛んに検討されていると文学は、 大腸菌から可溶性、活性な組換えタンパク質を保護するためのベストプラクティスをまとめた大腸菌 12月13日 、真核生物の酵母14、昆虫15〜16、植物17〜18、または19〜20の哺乳類細胞がたくさんあります。
以下のプロトコルでは、ヘキサヒスは、組換えタンパク質はベイトとして使用されているタグ付き。これは、ベイトタンパク質は、一晩のインキュベーションおよび洗浄工程の後にウェル内に残っていることの検証を可能にする。
1。マイクロタイタープレートウェルにおける組換えタンパク質保持のためのELISA
- マークAパーマネントインク、井戸がどのタンパク質濃度が含まれています指名したマイクロタイタープレート。井戸の3複製でこれを実行します。 3ネガティブコントロール濃度系列の複製（; BSAはこのような背景のチェックとしてうまく機能非ヘキサヒスタグタンパク質）が含まれています。
- 水で広範囲にプレートを洗浄し、洗浄の間に4層ペーパータオル上で逆さまにプレートをピシャリと打つことで、水を除去。
- トリス（pH7.5）、（お好みのまたはバッファ）組換えタンパク質（10μg/ ml）を最高濃度100μlに、最初の3ウェル中で、固定化。ダウン1.0 ng / mlのになど 、次の3つのウェル（1.0μg/ ml）をで組換えタンパク質に追加。 BSA濃度シリーズと同じ操作を行います。
- ラップでお皿をカバーし、4℃で一晩のまま
- 翌朝、4〜5層ペーパータオル上で逆さまにプレートをピシャリと打つことでタンパク質を除去。
- ウェルはバッファを残して、200μlの1×TBSで毎回5倍洗う〜1分間のウェル中の各時間と各洗浄後、ペーパータオル上で逆さまにプレートをピシャリと打つことでバッファー洗浄を取り除く。
- （w / v）のBSAまたは200μlの5％200μlの5％を使用して、ロータリーシェーカー上でELISAプレートをブロック（w / v）で2時間室温でTBSでブロッキング試薬（または4℃で一晩静置し座って都合がよければ）プラスチックラップに包まれた。
- ペーパータオル上で逆さまにプレートをピシャリと打つことで、過剰なブロッキング溶液を除去します。逆さまにプレートをピシャリと打つことで、洗浄溶液を除去し、1×TBSを200μlで4倍、1分間毎回洗う。
- ブロッキング緩衝液中でペンタ-HIS次抗体1/2、000を希釈し、各ウェルに100μLをお届けします。プレートの固定を用いて室温で1〜2時間インキュベートする。
- ペーパータオル上で逆さまにプレートをピシャリと打つことで、一次抗体を除去する。 1X TBST200μlの4X 1分を毎回洗う。逆さまにプレートをピシャリと打つことで各々の洗浄を削除します。
- 二次抗体を希釈（ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼコンジュゲート）、ブロッキング緩衝液で、プレートを静止させながら室温で1時間各ウェルに100μlのインキュベート。
- ペーパータオル上で逆さまにプレートをピシャリと打つことで、二次抗体を除去する。 1X TBST200μlの4X 1分を毎回洗う。逆さまにプレートをピシャリと打つことで各々の洗浄を削除します。
- 各ウェル中のパラニトロフェニルホスフェート（pNPP）基質溶液200μlを配置します。基板は、その分量を作り、それが完全にこの段階で解凍されるので、よく事前に冷凍庫から検出に必要な分量の必要な数を取得-20℃で固体である。
- 30分で各ウェルに3 M NaOHを50μLを加えて反応を停止します。
- すぐにELISAプレートリーダーで405 nmの吸光度を読んでください。
注：目的の組換えタンパク質をウェルにそれ自体をアタッチしていない場合、それは番目を変更することが可能であるE組成/緩衝液のpHはかなり（炭酸塩緩衝液pH 10.0）またはマイクロタイタープレートウェルへのタンパク質の付着を支援しようとするカオトロープ（尿素）を追加します。 2）高pH /カオトロピック剤を除去した後、その生物学的活性を保持するお勧めします。1）親和性選択の条件の下でマイクロタイタープレートウェルに結合したままであり、ただし、組換えタンパク質があることを再確立する。
2。力価測定のための成長細菌宿主（BLT5403）
- オートクレーブ（ 図2A）10 250ミリリットルの三角フラスコと3培養管。 LB液体と固体培地プレートを注ぐためのLB寒天を作る。クールなLB寒天50℃にし、無菌的に流フード（ 図2B）でペトリ皿に注ぐ前の100μg/ mlにアンピシリンを追加します。
- また、在庫からBLT5403の単一のコロニーのための流フード内（ 図2B）ストリークLB、100μg/ mlのアンピシリン（LB AMP100）寒天プレート（V / V）15％で維持-80°C（ 図2C）でのグリセロール。成長のためのインキュベーター（ 図2D）で一晩37℃で逆さまにプレートを置きます。
- 午前中は、プレートから採取単一コロニーを250ミリリットルの三角フラスコ中で50ミリリットルのLB AMP100に接種。 37℃で、水平振盪（ 図2Eと2F）で200 rpmでインキュベートし、= 0.5〜0.6（ 図2H）OD 600で細胞密度を監視するために、分光光度計を使用しています。
- 50ミリリットルファルコンチューブに細胞を注ぎ、または類似した、使用します（ 図2G）まで4℃で保管してください。細胞は通常約1週間生存したままになります。
- 500ミリリットルのLBを行い、バッフルフェルンバッハフラスコに入れて、それをオートクレーブ。それは、滅菌されたら、下記の「1日目」の夜まで4℃（ 図2G）または室温でフラスコを置く。
注：ホスト細菌細胞BLT5403は、これなしT7半ば、T7ネイティブキャプシドタンパク質のプラスミド由来のソースを表現し、低コピーベクターを正常に複製することができない、ウイルスに非常に敏感である。これは、汚染を避けるために不可欠である。汚染は、最終的には、ウイルス/細菌に感染したと接触する全ての表面が70％（v / v）エタノールで拭い又は洗剤（ 図2I）を用いて洗浄されなければならない点で生じる。これが無効である場合、Envirocideに耐えることができる全ての表面（ 図2J）の完全な除染が必要とされる。 4℃の株式の汚染を軽減するために、冷凍ストックからBLT5403の細胞親和性選択の各新ラウンドを開始し、活発な細胞は、プロトコルで使用されていることを確認してください。フィルタバリアピペットチップが不可欠である。
3。親和性選択
1日目
- マーク·パーマネントインク、ウェルはPROTが含まれます指名したマイクロタイタープレートアインズ/修正。 （汚染による問題のために、プレートを再利用されることはありません）。各タンパク質と治療のためのウェルの3複製でこれを実行します。
- 水で広範囲にプレートを洗浄し、洗浄の間に4層ペーパータオル上で逆さまにプレートをピシャリと打つことで、水を除去。最初の9井戸の合計、3ウェル中にトリス（pH7.5）100μlに、固定化、（または選択したバッファ）組換えタンパク質（10μg/ ml）を6ウェルで、またはBSA（10μg/ ml）を親和性選択のラウンド。ラップでお皿をカバーし、4℃（ 図2G）で一晩のまま。
- 9 X 250ミリリットルの三角フラスコ（上記2.1を参照）、洗浄、オートクレーブ処理し、適切に標識されたが（色付きテープでコーディングは、よく図2Fに機能）があることを確認してください。
- よく使われているライブラリーのタイターとスクリーニングされるファージの数に基づいて、それぞれのために使用するファージ溶解物の体積を計算する。
- 新鮮BLT5403細胞が使用する準備ができていることを確認してください明日（ 図3A）ラウンドこの親和性選択を滴定するため。
- 十分な1倍TBS（150mMのNaCl、50mMのトリス塩基、pH7.6）中および1×TTBS（1倍TBS + 0.05％（v / v）のトゥイーン20）を確保するウェルを使用している数の10×200μlの洗浄を行うために利用可能である。加えて、親和性選択温度でTTBSをプレインキュベート。バックアップは、密封され、1X TTBSの50ミリリットルファルコンチューブが十分1X TTBSで親和性選択の温度で存在することを確認します。
- LB 100 AMPそれぞれ990μlの1.5ミリリットルのエッペンドルフチューブ（27合計）の3トリートメント×3×3の複製三重を準備し、適切に（ 例えば 10 -2）を標識。これらは明日マイクロタイタープレートウェルから取り出された感染した細菌のためのものです。チューブ（10 -2）の一方の側の希釈及び他方の側の上行番号（「1」）をマークします。各エッペンドルフチューブの場合は、さらに1ホウケイ酸チューブと1のLB 100 AMPプレートにラベルを付ける。このW中AY、プレートおよびホウケイ酸試験管など 、1、2、3、4、5と番号付けされている。力価測定を行うためには、より速く行く。その後、単純な数は、エッペンドルフチューブに希釈し、治療に適合させることができる（ 例えば、＃12チューブの希釈10 -5のため、BSAコントロールの最初の複製の三連であった）。店舗エッペンドルフチューブ及びLB AMPプレート100は、4℃で一晩（2Gおよび図3B）。
例えば：BSA複製つのウェル1,2、および3（複製いずれかのファージ力価の三連の読み）等からのファージの三10 -2の希釈のために1.5mlのエッペンドルフチューブを標識し、次いで、ホウケイ酸試験管1をマーク開始感染した細菌はLB 100 AMP寒天プレート（ 図3C）に注ぐ前に感染していない細菌およびトップアガロースと混合される2、および3。
- シリアルDについてilutions、ラベルエッペンドルフチューブと、それぞれに、LB 100 AMPの900μlを加える。感染した細菌の初期希釈液（10 -2）を各タンパク質/治療、複製、三重、明日のために作られていると、それらを十分に混合され、100μlを、それらから採取され、900μlのLB 100を含む適切なエッペンドルフチューブに加え、 （1 BSA複製制御用チューブ4、5、および6）、10 -3希釈のためAMP。これらは、自分の順番でよく混合され、10 -3希釈は、10 -4希釈（7,8,9）を製造するために使用される。 10 -5希釈液（10、11、12）、 等のために、10 -4希釈液を使用する。 3のBSAの複製（井戸）の最初のために力価が得られます。
- 同じことは、BSAの複製2（ウェル2）、BSA複製毒殺餌の3（ウェル3）、3複製、および餌井戸の最後に3複製のために行われます。最後に、FラベルしたチューブがあるはずですROM 1から135（135は10 -6の最大希釈での餌の最後の複製の最終連である）。 4℃で一晩、これらのエッペンドルフチューブを保存します（ 図3（c）は 、BSAの3の複製（3ウェル）の三連のすべての希釈用エッペンドルフとホウケイ酸チューブを示しています。
- 一晩培養としてインキュベートシェーカー（ 図2Eと2F）で成長し、BLT5403細胞（上記のステップ2.2から新しく作製した一晩のLB AMP100プレートから単一のコロニーから採取）の2または3培養管を起動します。 500ミリリットルのLB（点を上回る2.5）に、100μg/ mlのアンピシリンを追加し、37℃になりますので、振盪インキュベーター中でクランプでフェルンバッハフラスコを置き、翌朝（ 図2F）を通気し。
注意：ラウンド3と4は、Pの程度-10 10としてボリュームのおおよその希釈を必要とするかもしれないLB AMP100のボリュームにヘイグ。
2日目
- 翌朝、インキュベートシェーカークランプでオートクレーブ、空の9 X 250ミリリットルの三角フラスコ（各ウェルマイクロタイタープレート用1）を配置します。 BLT5403細胞の一晩培養物の1から500μlの500ミリリットルのLB 100 AMP接種は、（上記のステップ3.8を参照）を再密封し、それは（37℃、220 rpm）を成長開始最後の夜に開始。分光光度計（ 図2H）の電源をオンにして、600 nmの吸光度を読み取るように設定します。
- 4℃からマイクロタイタープレートを取り外し、プラスチックフィルムを除去し、200μlの1×TBSのpHが7.5のたびに10倍を洗浄し、逆さまに洗浄の間ペーパータオルの上のプレートをピシャリと打つことで、プレートから、未結合タンパク質を除去。 200μlの5パーセントプラスチックラップに包まれたプレート付き（w / v）のBSAまたは200μlの5％（w / v）で1時間、TBS中ブロッキング試薬（または一晩便利な場合）を持つブロック。
- ブロッキングSを洗い流すolution 10倍逆さま洗浄の間のペーパータオルの4層の上にプレートを平手1X TBST200μlのたびに、と。なお、この段階で水200μlでウェルを補充ラップでそれらをカバーし、最大1週間保存するために、4℃でそれらを置くことができる。
注：時間によって親和性選択が完了してから、ファージに感染した-BLT5403を追加する準備ができている、ことを十分にすぐに培養を開始、500ミリリットルの細胞は0.6と1.0のOD 600の間である。彼らは多くの1.0を超えて成長した場合、細胞が定常期に近づくと、溶解はリソースの制約があるために発生しないことがあります。細胞は、少なくとも従来のファージの導入の0.6 OD 600を達成しない場合、感染の多重度は急速溶解物の表現に影響を与えることができる細胞を死滅させる、あまりにも高くすることができる。細胞がまだ親和性選択の完了によってOD 600 0.6 に近づいていない場合は、INOCキュレート秒（あるいはから2番目と3番目の両方）、37℃（ 図2F）で振とうした試験管からより多くのBLT5403でフラスコ。 1.0のOD 600があまりにも近づいている場合は、文化を冷却し、酸素が 細菌を餓死するヒーターとシェーカーをオフにし、ふたを開けます。ファージ一度振っ/加熱を再開が追加されました。
ここからファージ交差汚染を避けるために、フィルターのバリアヒントを参考にしてください。
- フラスコに接種されると、タンパク質と、ファージライブラリー（100μl）を置きラップでプレートを再シールし、1時間室温でインキュベートする。
- 55分で、細胞のOD 600を記録します。倍加時間はおよそ20分毎です。 （上記の「注記」を参照）に応じて行動。
- 1時間の終わりに、プレートからプラスチックのラップを取り外し、すぐに変換された廃棄物にファージを振ってから急速に1XのTBを200μlを加えることで洗うST。 （このために[ すなわち 200μL/プランジャーうつ病を提供]と、それはすぐに行く1 = 100μlの頭と2に設定されたピペッターでマルチピペッターを使用してください）。 1分間のタイマーを設定します。 1分後、変換された廃棄物、逆さまにペーパータオルの上ピシャリプレートにバッファーを振るとベンチ（25℃のプレート）に戻って置きます。繰り返し洗浄は10倍を繰り返します。
- 10 回目の洗浄後、4℃で50ミリリットルファルコンチューブからBLT5403細胞を200μlを取り、TTBSの最後の洗浄が除去された井戸の底に入れて。ラップでプレートをラップし、（永続的に検索されたファージおよび/または無差別に結合するファージから高いバックグラウンドに関する議論に注を参照）任意のファージがまだ細菌を感染させるために餌にはまり込むために20分間37℃で置く。
- 20分の終わりに、プレートのラップを解除し、25℃の複製1十分にBSAから10μlの細菌を取ると、マークされたLB 100 AMPの990μLに入れて"1"となる。そのほかのためにさらに2回を繰り返します（チューブ2および3）そのほかからのファージの1/100の希釈の3連で生じた。これを3回サンプリングしたBSAの複製である。これらの希釈液は、BSAの複製のためのSEM±平均力価を推定するために使用されます。
- 毒殺ベイトタンパク質の3レプリケートされたウェルについて、BSA（10μLずつの3連サンプル）の複製2及び3のために同じことを行うと、ベイトタンパク質のため。さておき、これら27エッペンドルフチューブをセットし、溶解に向かって成長してウェル中に感染した細菌の残りの170μLを得る。
- フラスコ内の細菌がOD 600 = 0.6〜1.0であれば、フェルンバッハから50ミリリットルの細胞九250ミリリットル三角フラスコの各々にフラスコにデカントする。よく、BSAの複製1ファージ感染BLT5403細菌の残りの170μLを取り、「BSA担当者1」（黄色テープ）マークされた50ミリリットルのセルに追加します。すべての9ウェルについて、これを行うと、インキュベーター内揺れに置く（
- 溶解のためのタイム·ツー·時間37℃でインキュベートシェーカー（接種時から約3時間）で細胞を監視します。この時間の間に適切な、ラベルされたエッペンドルフチューブ内の27の初期希釈（10 -2）から希釈液を作る。
- 上記の3.12から初期27希釈液からのこれらの希釈を実行するには、エッペンドルフチューブ1（よくこのことから、この1/100希釈からの三連サンプルの第BSAの複製1）からの細菌を含むLB100μlのを取って、それを追加エッペンドルフチューブ4（まあこれからの三連サンプルの第BSAの複製1の1×10 -4希釈）中のLB900μlの。
- エッペンドルフチューブ7内のLB900μlの最初の三連のBSAの複製1の（1×10 -5希釈に追加するエッペンドルフ管4からの細菌を含むLB100μlのを取得する前に、新しい1のフィルタバリアチップを破棄このウェルからのサンプル）。希釈液（Dを継続自身のすべてのタンパク質や治療（計135本）のすべての複製のすべての三連の場合）-6 10×1に。
- 細胞を溶解した後、5M NaClをストックから5ミリリットルを追加することによって、0.5MのNaClに文化を持参し、ラベル遠心分離ボトルに移します。
- 4℃で10分間8000×gで遠心分離清潔な滅菌50ミリリットルファルコンチューブに上清（ウイルス）をデカントします。
- ファルコンチューブ内のデカント上清にクロロホルムを数滴を追加します。
- 親和性選択の次のラウンドの4℃で保存する。
4。一日三
- オートクレーブや漂白剤、次のラウンドに備えて、このアフィニティー選択ラウンドを生成するのに使用されている全ての実験器具。
5。滴定
- 希釈が昇順でありますように数多くの固体のLB 100 AMPプレートとして（現在はすべてのホウケイ酸チューブ、エッペンドルフチューブ、同じ番号のそれぞれについて、1のプレートがあるはずです）。 P37℃のインキュベーター（ 図3D）にプレートをUT。
- トップアガロースボトルキャップを緩めて交互にボトルを電子レンジとトップになるまで混ぜ、それを回転させることによって（1.0グラムバクトトリプトン、0.5グラムの酵母エキス、0.5グラムのNaCl、0.6グラムアガロースは、100ミリリットル、オートクレーブに加えた）トップアガロースを溶かすアガロースを完全に融解している。 50℃（ 図3E）に冷却し、水浴中でボトルを置く。
- 装着されたピペットポンプでホウケイ10ミリリットルピペットを取る。ブンゼンバーナーを点灯。逆さまにベンチに発泡スチロールのファルコンチューブホルダーやクーラーの蓋を回して、その上に1〜6（新鮮な37℃のインキュベーターのうち）LB100 AMPプレートを配置し、プレート1が最上段（ 図4A）。発泡スチロールは暖かいプレートを保持します。
- （セクション3.7および図4Bおよび4C）の上に日1に用意し、番号ホウケイ酸試験管の各々に4℃から250μLBLT5403細胞を入れた。 AR1.5ミリリットルのエッペンドルフチューブ（ 図4A）での希釈液と同じ上昇系列の番号付きホウケイ酸チューブの範囲である。
- ホウケイ酸試験管1（ 図4Dおよび4E）での細胞の250μlのエッペンドルフチューブ1に希釈から100μLを入れてください。ビット（も過言ではない！〜3ス ワイプ、 図4F）の炎の上にピペットの内の最初の5を加熱して溶融したトップアガロースに突入。 3ミリリットルを引き上げ、細胞/ファージ（ 図4G）の上に試験管にすばやく届ける。
- 一方（ 図4H）でチューブを保持しながら、指でフリックで混合し、プレート（ 図4I）上のコンテンツを注ぐ。プレートを傾けて、プレート全体をトップアガロースでカバーされるまで、気泡やドライスポットを追いかけるために試験管を使用しています。直立冷却するベンチに、脇に置きます。
- ホウケイ酸チューブを廃棄、フィルタバリアチップを取り出し、取得新鮮な1およびすべての希釈メッキされるまで継続する。彼らは枯渇していないが、これ以上より6時間に、またはそれらが冷却され、トップアガロースがあまりにも急速に凝固するされるインキュベーターからのLB 100 AMPプレートを取得します。
- トップアガロースが固体であると、（それがこれを行うことが重要です）逆さまにプレートを入れてください。それ以外の場合は、アガロース/寒天は、「泣く」蓋の上に凝縮し、トップアガロースに落下し、それを正確に力価にそれを不可能にしてファージを取って、その上に動作する）のどちらか：1）37℃でプレートを置くインキュベーターは、OR [T7が攻撃的であるとして、力価をカウントするために4時間後に戻って]：2）力価をカウントするために次の日の朝逆さまベンチでそれらを残し、彼らは準備が整いました。
- それが沸騰するまでは、 ゆるく 、電子レンジトップアガロースに戻るトップアガロースボトルキャップを入れていない場合ガラス粉砕、または傷害から保護するために必要なすべての予防措置を取って。二回これを行う。それはクール、締めてみましょうキャップと、それを収納。通常の温度に水浴を下げるか、それを遮断してください。 4℃の冷蔵庫で希釈液を入れた。彼らは、力価を解釈および/または滴定の一部をやり直すことが必要となる。
6。力価を測定し、計算
- プレート上に形成されたプラークを調べ、融合性溶解（ 図5A 例えば 10 -2希釈）とのそれらを捨てる。正確な集計（ 図5AのND 5B）を有効にするのに十分に少数のプラークを生成した残りの系列希釈のかを決定する。これらのプレート（; 図5B表1）からプラークの数を記録する。
- 希釈してプラークの数を掛けた後、 すなわち 、感染した細菌のみを10μlの三重とSのそれぞれのために採取したウェル（から取られ、感染した細菌のミリリットルあたりのプラーク形成単位数を取得するために100でこの数を掛けOこれはミリリットル当たりのカウント数）を取得するために100を掛けている必要があります。この井戸から取ら3三連を越え、（ウェルマイクロプレートから取り出し希釈されていない感染した細菌のPFU / ml）を、ミリリットル当たりのプラーク形成単位の数（PFU）を平均する。
- 3複製ウェルのために集計の総平均を形成し、この平均値（ 表1）の標準誤差を計算する。これは、各親和性選択ラウンドと治療（ 図5C）のためのファージ力価の増加を図に記録されるものです。
7。プラーク単離、PCR、およびシーケンシング
- 親和性選択ラウンド4の終わりには、18の個々の、明確に定義され、プラークコロニーと、無菌パスツールピペット、つまようじを使用して、黄色のピペットチップまたは同様のデバイスは、コア、これらのプラーク滴定プレートから]を選択します。チューブやチップを使用している場合は、最初のトリス-HCl、エッペンドルフチューブ内のpH 8.5（ 図5D）で内部を濡らし。
- 簡単に適切なチューブ（ 図5G）及び渦に100μlのトリス-HCl、pHが8.5にコアを追放。
- 10分間65℃でこのボリュームから20μLを加熱する。
- 10分間、室温でベンチトップ遠心分離機で13,000×gで加熱されたボリュームを遠心分離する。 T7-T7-UPとDOWNのプライマーを用いてPCR反応で使用されるこのアリコートの上清から3μLを取る。
- 18単離されたプラークの各々に対して、加熱された溶液は、アニーリング58℃の温度及び35サイクルを用いて50μlのPCR反応を行う。
- EACの20μLを実行1％での時間の反応（w / v）の0.015％（v / v）の臭化エチジウムを含有するアガロースゲル。適切な目の保護とニトリルラボ用手袋を使用してネーターで可視化する。 （注意：エチジウムブロマイドは強力な変異原である。）は、ゲルを撮影し、適切に汚染された材料を処分する（ 図6Aおよび6B）。
- アンプリコンは、単一の製品である場合ではなく、空のベクターからの（製品は1％（w / v）のTAEアガロースゲル上で100bpの近くで実行されます。 図6Aと6Bの矢印）、シーケンシングテンプレートとして使用するために、残りの30μLを清掃してください。ゲル上でない場合、単一の製品（ 図6B、プラーク15）、ゲルから最も顕著なバンド（複数可）を切り取り、キットを用いてゲルからDNAを抽出する。
- シーケンスT7-UPプライマーを使用して空のベクトルではないアンプリコン。
- リンカーアーム、各配列を調べて、この情報から、挿入の開始がどこにあるかを決定します。 Baのを使用してくださいSiCのローカルアラインメント検索ツール（BLAST;米国国立医学図書館）が、インサートがフレーム内にあるかどうか、符号化されたcDNAの同一性を決定すると、そうであれば、タンパク質のどの部分のコード配列（CDS）はで表示され、捕獲されています餌。
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Representative Results
（代謝的に餌を汚染）は、ファージディスプレイされたタンパク質と相互作用する餌の能力を損なうことができることは、この技術のための強力な負の制御を提供します。それは餌は、マイクロタイタープレートに結合した場合、その機能を保持しているかどうかを判断することをお勧めいたします。これらのチェックの両方がnonpoisoned餌によって回復の相互作用、ファージディスプレイされたタンパク質が正当であるという確信を増加します。
各ウェルから3三重測定をサンプリングすると、親和性選択に要する時間と作業を大幅に追加しますが、一度だけサンプリングするのではなく、各ウェル内の力価のより正確な推定値を提供します。三連のための力価のほとんどはよく一致しているが、ラウンド4中のBSAの複製2のための三連（ 表1）大きく異なることに注意してください。数回サンプリングすることにより、最終的な推定集計は、ピペッティングエラーやTをより正確に推定する感受性ではない彼の実際の力価およびこの推定値の周りの変動、ウェル間、（ 表1、図5C）が得られる。
親和性選択の数が増加を丸めたように、優先的にnonpoisoned餌のため、ファージ力価を増加させると、また技術（ 図5C）に動作していることを確信しています。親和性選択の数が増加するとnonpoisonedベイトウェル中の挿入物を含むファージの増加割合の保持は、（ 図6Aおよび6B）も縁起である。
親和性選択の先進回行った後、独立して挿入しているファージ回復の数の増加（PCRは約100塩基対よりもサイズが大きいアンプリコンとして認識できるが、 図6B）、最初のラウンド（ 図6A）、およびのセトリングに対して図6B <のいくつかの同じサイズのバンド（ノートレーン5-9、11月18日にこれらのアンプリコン）> /強い、特定のクローンを親和性選択に（ 図6Aおよび6B）が選択されていること良い指標である。最終的な親和性選択ラウンドで得られたプラーク数を配列決定した後、同じタンパク質の類似領域（異なるクローン）の検索が表示されたタンパク質の一部が餌用の善意親和性を有することが独立した検証である。これらは、独立して、ファージはまた、ベイトと相互作用することができるタンパク質全体のどの部分に関する情報を提供して回収した。ファージディスプレイcDNAライブラリーは、ランダムプライミングを用いて構築されている場合は、部分および完全長タンパク質カバー率の大きな多様性は、（cDNAの挿入サイズを許容するファージの範囲内で）予想することができ、複数の独立したクローンをもたらすタンパク質の同じ部分をカバーする。でも、連続したフレーム外のヒットは、彼らがどのBAに類似のモチーフをエンコードかどうかを判断するために精査する必要があるそれがバインドされます。 （これはライブラリがORF-3の技術を使用して構築されていないことを前提としています）。
表1。3つの治療のための親和性選択の第4ラウンドのウェルからの平均力価/ mlの感染細菌の計算。よく餌の最初の複製から取ったプラークの10 -3希釈のそれぞれ三連のための番号図5Bから取得されます。 大きなテーブルを表示するには、ここをクリックしてください 。
ファージディスプレイ法の図1。全体のグラフィック描写 、A）は、好ましくはcDNAを生成するためのランダムプライム、ポリA選択されたRNAを用いて構築ファージディスプレイライブラリへのアクセス、及びB）が可能な限りにおいて、ベイト、生物学的に活性のような、検証を固体支持体上に固定化し、可能な場合、阻害剤を添加することによって不活性にあっても（ 例えば、競合的ベイトタンパク質に結合するのを抑制する）。 RT：逆転写。
。図2は、ファージディスプレイを行うために必要な機器や材料のいくつかの滅菌技術は両方へのアクセスを必要とする：A）オートクレーブ; B）層流フード。ファージライブラリとBLT5403細菌ストックを必要と-80＆＃ 176、C長期保管Cの温度）を成長させるファージや細菌、DFが必要）37℃のインキュベーターの1、EFは））（軌道液体培養を成長させることが可能である。カラーコーディング、F）を介して、実験を最適化することはミスを最小限に抑えることができます。力価測定のためのBLT5403細胞を4℃で最大1週間、G）のために保存することができる軌道シェーカーの隣のセル密度を以下の場合、H）、分光光度計の配置を最適化することは、時間を節約することができます。頻繁に表面およびピペットの治療、I）の強力な洗剤とJ）Envirocideは、ウイルス汚染のリスクを最小限に抑えることができます。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
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図3。一つの可能なセットアップスムーズな親和性選択を可能にするために便利。A）BLT5403は、それらがウイルスに汚染されていないことを決定するために、前滴定に一日か二日を成長させ、メッキされ、ウイルスの導入なし。エッペンドルフの前標識）Bと、C）ホウケイ酸チューブはLB 100AMPの希釈溶液を小分けし、4℃で一晩に格納B）を使用するためのD：親和性選択の日に滴定することによって予め調製することによって容易にすることができる。 ））、37℃でペトリ皿。Eを滴定前に約1時間温めにprenumbered、LB 100AMP寒天含有を置き、滅菌トップアガロースを融解（キャップをゆるめて）および冷却するために予熱した50℃の水浴中に置くことこの温度まで滴定前に時間が始まる。ルを使用してくださいトップアガロースが削除されたようにボトルの転覆を回避するために、広告ドーナツ。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図4。親和性選択のラウンドから回収したファージを力価測定 。メッキは力価。A）ウイルスに感染したBLT5403希釈及びラックに組み付けホウケイ酸チューブの第1のセットの人工的な膨張を防止するために、感染後できるだけ早く開始する。フィルタ障壁のヒントを使用した：BC）をストックから4℃から250μLBLT5403細胞はホウケイ酸チューブに移している。フィルタ障壁のヒントを使用した最初のホウケイ酸チューブのDE）BLT5403はFiが感染しているRSTウイルス希釈。F）ホウケイ酸ピペットは、目詰まり防止やトップアガロース暖かく保つために、直火の上に加熱される。過度ピペットを加熱していないか、または細菌がやけどされ、死ぬG）の 3ミリリットル溶融トップアガロースを素早く検索し、ホウケイ酸チューブH）管は内容物を混合するために簡単にはじいており細菌の上に注いている、 私）内容は、プレートの側面に気泡を移動するには、トップアガロースがプレート全体をカバーして確保するためのチューブを使用して、あらかじめ温めておいたLB 100AMP寒天プレート上に注いだ。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図5。典型的な力価の再ことによって流れます。A）低い希釈（10 -2）ほとんど常に最初の親和性選択ラウンドで全ての処理（図中のウイルスが過度に長い撮影を容易にするために、過度のプラークサイズになり成長してきた）のための融合性の溶解につながる。B）プラークの適切な希釈液を前記集計プラークを追跡するためにシャーピーを使用してカウントされます。C）餌井戸の大幅力価が上昇BSAまたは毒殺餌用に多かれ少なかれ安定したまま。後のラウンドでは、餌ウェル台地からの力価、さらに親和性選択は非生産的である。D）だけでなく孤立したプラークは、少なくともそれを余分な液体を除去するために確認してから、エッペンドルフチューブから溶液を用いて牧草ピペットを濡らすによる配列決定のために選択され、収集されています複数のプラーク上で実行して、コアを汚染する。E）にピペットは既に圧縮ピペット電球でプラークを押し通されていますピペットはピペットにプラークまで（矢印）を吸って、トップアガロース中にある間、F）電球がリリースされました。G）芯プラークは、適切なエッペンドルフチューブ内の液体中に送達されようとしている。ファージ希釈液（LB 100AMPの体積当たりの感染細菌の体積）がペトリ皿（ 例えば 、10 -3 = 1/1、000希釈）に示されている。複製ウェル1から3 3つのサンプルは、トリップと略記される。 1、旅。 2、トリップ。 3、複製1（議員1 =ウェル1）のためのすべて。 B中のプレートの下にある数字）をプレート上で集計実際プラーク数です。これらは餌以上の親和性選択（図中、R4）の第4ラウンドからの細菌の10 -3希釈のためのものです。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図6。適切な餌以上の親和性選択のための典型的なPCRの結果。 A）空のベクタープラーク（矢印）の割合は、最初は通常、非常に高いが、餌ウェル中、B）その後のラウンドで減少する。インサートを含むプラークは、この後の親和性選択ラウンドで同じサイズのインサートを含むものに落ち着く傾向にある。 MWM：分子量マーカー。
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Discussion
3レプリケートウェルで実験を実行することにより、ベイトと結合する同じタンパク質の独立して取得されたファージは、それらが同じクローン取得されたCDS領域のヌクレオチド配列（ すなわち、差がないが、これらがされている場合であっても区別することができる独立した井戸から取得した）。それらは独立してヌクレオチド配列の一部が異なる転写領域を逆にしているそれ以外の場合、ベイトに結合する同一のタンパク質をコードするファージを区別するための唯一の方法である。
親和性選択されたファージを増幅する際に使用するための細菌のすべてを成長させる1フェルンバッハフラスコの使用は9三角フラスコを監視しようとするよりも親和性選択後の感染に至るまでの細菌増殖のはるかに少ない多忙なモニタリングを可能にします。あらかじめ温めておいた三角フラスコに、直前に感染、これらの細菌をデカントすることもアルテによるサブライブラリの力価の不一致を解消特定のフラスコに乏しい細菌の増殖による感染多重度における配給。このように、ラウンドのラウンドからのファージ力価の変化は、ウェル中に保持されたファージの数と、複製された井戸の中で力価の変動は最小限であるべきに依存する必要があります。
ファージディスプレイを用いたもの、例外的な利点は、技術は、特定の餌に対する親和性を有するファージディスプレイされたタンパク質の同定に持つ偉大な力である。原因ファージはBLT5403宿主内で複製する効率、第1の親和性選択ラウンドではよく内に保持されている希少なCDSを代表する単一のファージと、コート融合タンパク質は、餌に高い親和性を持っている必要がありますはるかに大きな数字で第2ラウンドで表現すること。第4ラウンドでは、このファージは溶菌培養物中に存在するファージの大部分を構成する必要があります。
高力価に複製するファージのこの容量もハイテクの制限ですNIQUE。特定の餌は、それがライブラリ内の高い親和性を持っている相互作用タンパク質パートナーを有する場合、それは合法的にベイトと結合することができるが、これらのような低い親和性で高親和性結合タンパク質によってoutcompetedする傾向にあるタンパク質を捕捉することは非常に困難で。このような稀なファージを同定するための次世代配列決定技術の使用は、この制限を回避する1つの可能な手段である。さらに、忍耐力、むしろ過酷な除染（ 例えば Envirocide）と克服するための優れた無菌技術を必要とする研究室全体で「汚染」の発作でT7ファージ結果にBLT5403の感受性。 1元を特定し、排除しようとする汚染は親和性選択の進行中のかなりの時間が失われることがあります。
タイトほつれ "バインダー"にパーティショニングファージの成功を制限してきた一つの手段が緩んバインダー最初のBを試してみて、回復することであるyがウェルに少ないしっかりとベイトに結合しているファージを除去するように設計された溶液（1％SDSまたは類似のカオトロープ）を導入する。次いで、この溶液を前のベイトに結合した残ったファージにより感染されると予想されるウェルへの細菌の導入のために、最初に除去することができる。この技術は、大幅に、誤ってファージを結合、バックグラウンドを低減することができる。しかしこの技術を追求している場合、サブライブラリの数は、複製し、その後のラウンドで選択された重複の親和性は、時間と費用を大幅に追加している、倍増している。
親和性選択のいくつかのラウンドでファージ力価の増加の経過の後には、LBの大ボリュームとLB 100 AMPプレート多数のフィルタ障壁のヒント、エッペンドルフチューブなどを介して実行することができます。ファージの偶数適度な数を調べるために必要な配列決定であり、これは高価である。 trは、いくつかの反復の希釈多数の滴定三重でeatmentsので前に親和性選択に毎日できる限り材料の多くを設定することの重要性が最も重要で、かなりの時間を必要とします。
現在検討されている一つの励磁可能性は物理的属性とベイトと相互作用するタンパク質の領域の三次元構造をモデル化するために、ベイトに結合し、独立したファージタンパク質の位置を使用することである。例えば、相同後期胚形成のセットにバインドされたタンパク質標的の属性を調べると、シロイヌナズナ（ シロイヌナズナ ）と大豆（ ダイズ ）からの豊富な（LEA）タンパク質、一つの重要な結論があったことの領域に結合LEAタンパク質ほとんどの（またはほとんどの間で）結合タンパク質11の親水たタンパク質。遡及的に、LEAタンパク質が脱水中に変性から、クライアントの分子を保護するために仮説を立てていることを考えれば、sとすることができますLEA保護なしの機能不全を最も受けやすいクライアント分子の領域（親水性）水と結合することが最も可能なものかもしれないとurmised。
それは、力価が膨張しないようにウェルに菌の導入とその取得の間の時間を最小限にすることをお勧めします。希釈液は、細菌株が汚染され、最大の希釈液がコンフルエント溶解を回避するのに十分であるとされていないことを確認するために、ウイルス感染せず、いくつかのBLT5403をメッキすることにより十分であることを確認してください。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、部分的に、NSF IOS（0849230）によって賄われていた、ハッチ、マッキンタイア·ステニス（AD421 CRIS）、USDAのシード·グラント（2011から04375）、そしてサー·フレデリック·マクマスター研究員ABDに。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Becton Dickinson Co. | 211705 | |
| Yeast Extract | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Blocking Reagent | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotype: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR) |
| Ampicillin, Sodium Salt | Research Products International | A40040 | |
| Ethidium bromide | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| Penta-HIS primary antibody | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Goat anti-mouse alkaline phosphatise conjugate | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| T7-UP primer | EMD Chemicals Inc. | 5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3' | |
| T7-DOWN primer | EMD Chemicals Inc. | 5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3' | |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Heating Block | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| 96-well Cell Culture Plates | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubator Oven | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipettes, 5 ¾ in | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Gloves, Nitrile | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Sterile 1.5 ml tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 10 ml Borosilicate Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-25E | |
| Borosilicate culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, ELISA plate reader | Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland | Type 362 |
References
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