Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

بروتوكول لفج العرض وتقارب اختيار طريق الطعوم البروتين المؤتلف

Published: February 16, 2014 doi: 10.3791/50685
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Horticulture, University of Kentucky

Summary

عرض فج هي تقنية قوية لالتقاط البروتينات أو الأنصاف البروتين الذي يتفاعل مع جزيء يجمد الفائدة. مرة واحدة وقد تم اتخاذ قرار من هذا النوع من مكتبة [كدنا] فج لخلق والشاشة، وبروتوكول الموصوفة هنا يسمح اختيار تقارب كفاءة مما يؤدي إلى تحديد interactors.

Abstract

باستخدام فج المؤتلف كما سقالة لتقديم مختلف أجزاء البروتين المشفرة بواسطة مكتبة [كدنا] المستنسخة إتجاهي إلى جزيئات الطعم يجمد هو وسيلة فعالة لاكتشاف التفاعلات. تم إلى حد كبير استخدام هذه التقنية لاكتشاف البروتين البروتين التفاعلات ولكن الطعم جزيء أن يكون الطعن ليس من الضروري أن يقتصر على البروتينات. وقد تم تحسين بروتوكول المعروضة هنا للسماح لعدد متواضع من الطعم ليتم عرضه في مكررات لتعظيم تحديد استنساخ مستقلة تقديم نفس البروتين. هذا يسمح بمزيد من الثقة التي تتفاعل البروتينات التي تم تحديدها هي interactors المشروعة للجزيء الطعم. رصد عيار فج بعد كل اختيار تقارب يوفر جولة المعلومات حول كيفية اختيار تقارب يسير فضلا عن فعالية الضوابط سلبية. إحدى وسائل titering فج، وكيف وماذا لإعداد مقدما للسماح هذه العملية في التقدم بكفاءة كماممكن، ويرد. ويسلط الضوء على سمات amplicons استرجاع التالية العزلة البلاك المستقلة التي يمكن استخدامها للتأكد من مدى تقدمت اختيار تقارب. وأوضح المتاعب تقنيات للحد من ايجابيات كاذبة أو لتجاوز تعافى بإصرار فج اطلاق النار. وتناقش وسائل للحد من التلوث الفيروسي اشتعال.

Introduction

لماذا استخدام عرض فج واختيار تقارب بدلا من غيرها من التقنيات المتاحة لا تعد ولا تحصى لاكتشاف والتحقيق تفاعلات البروتين مع جزيئات أخرى؟ عرض فج يمكن أن يدعي بعض المزايا الفريدة أكثر من غيرها من أساليب الكشف عن البروتين التفاعلات يجند 1-3 بما في ذلك ما يلي:

ذخيرة واسعة جدا من جزيئات الطعم

السبب قبل كل شيء هو في تنوع الجزيئات قادرة على العمل كطعم في اختيار تقارب 4. عرض فج هو وسيلة قوية جدا لعزل شظايا البروتين الذي يتفاعل مع البروتينات الأخرى، النيوكليوتيدات، والكربوهيدرات، الخ 5 أساسا، إذا يمكن تركيبها بوليمر / جزيء إلى دعم استرداده، فإنه يمكن فحص للتقارب مع فج البروتينات عرضها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الوصول إلى جزيء الطعم لتحديد ما إذا كان يحتفظ النشاط البيولوجي عندما يجمد 6، إذا كانت الظروف المستخدمة لصاستخرج / القضاء على نشاطها فعالة أو 6، وإدخال تعديلات ما بعد متعدية إلى الطعم قبل اختيار تقارب.

المقاومة فج لعوامل خارجية

والسبب الثاني لاستخدام العرض فج، غير أنه من الممكن أن بعض الطعوم قد تتطلب الإجهاد البيئي (الحرارة، وتركيزات عالية osmolyte، العوامل المساعدة محددة، الخ.) لالتقاط البروتينات التفاعل، أو قد تحتاج فج البروتينات عرض لتغييرها بطريقة أو بأخرى قبل اختيار تقارب. العامل الأساسي قيد الدرس هو التفاعل بين الطعم والبروتينات، وليس شرط أن يسمح التفاعل أن يحدث أو إذا كان فتاكة بالنسبة لكائن الاختبار. فج T7 بشكل خاص مناسبة تماما لمثل هذه الدراسات لأنها يمكن أن تحمل الظروف القاسية التجريبية على حد سواء سليمة وقابلة للحياة (على سبيل المثال الحد الأقصى للبقاء الحرارية نشرت T7 هو ~ 60 درجة مئوية 7). كمثال على تغيير فج عرض المواليةالبروتينات، عند دراسة بروتيوم بذور نبات الأرابيدوبسيس thaliana لركائز البروتينية للانزيم إصلاح، بروتين Isoaspartyl الميثيل Transferease (PIMT)، وهو الفيروس المستخدمة في هذه الدراسات كانت "العمر" لمدة أسبوع واحد، وقبل كل اختيار تقارب الجولة، لتشجيع إدخال من isoaspartate (isoAsp) مخلفات في البروتينات عرضة 6 وهو أمر غير ممكن في الكائنات الحية التي يمكن التعرف وإصلاح / استقلاب مثل هذه التشوهات.

خاملة أيضي

وعلاوة على ذلك، فإن فج وعادة ما تكون مقاومة للسموم الأيض والتدخل الجزيئات الصغيرة التي من شأنها، على الأقل، يؤدي إلى آثار عديد المظاهر على الكائنات اختبار عملية الأيض نشطة. بعد يغسل صرامة، تتم إزالة السموم قبل أن يتم إدخال كمية كبيرة من البكتيريا لعدوى حتى يتم تخفيف السم لمجموعة حميدة للبكتيريا أو تكرار فج لاحقة. أثناء التحقيق أهداف البروتين في إصلاح PIMTانزيم، وكان يستخدم S-Adenosyl الميثيونين (AdoMet) لتنشيط انزيم يجمد الدقيقة عيار لوحة جيدا للسماح الهدف التقاط البروتين في حين أن الاعتماد على S-Adenosyl الهموسيستين (AdoHcy) لإبطال نشاط انزيم وتوفير السيطرة السلبية مفيدة في تأمين مع العلم بأن الفيروس لن تتأثر سلبا من قبل أي AdoMet أو AdoHcy 6. بالإضافة إلى ذلك، أعضاء معينة في وقت متأخر مرحلة التطور الجنيني الأسر وفرة (LEA) البروتين، والتحقيق في هذا المختبر، ومن المعروف أن تغيير شكلها في وجود مواد مضافة مثل السكروز 8، والتي يمكن الحصول على تركيزات عالية مثل 200 ملم في بذور فول الصويا عند نقطة من النضج الفسيولوجي 9. ولا يتوقع الفيروس أن تتأثر إضافة 200 ملي السكروز في كل جولة اختيار تقارب، وربما ضرورية لبعض تفاعلات البروتين LEA العميل، الذي ليس هو الحال بالنسبة للكائنات قابلة للحياة مستقلة اختبار 10.

وقد ركز هذا المختبر على discoverinز البروتين البروتين التفاعلات في والبذور المجففة أو الإنبات الناضجة التي تكمن وراء آلية الحماية بروتيوم المخزنة خلال 11 الجفاف أو إصلاح مكونات بروتيوم المخزنة التي هي عرضة للتشكيل isoAsp مرة واحدة وقد تشربوا البذور 6. وبالتالي، فإن إنتاج وتنقية البروتينات المؤتلف المطلوبة كطعم في حالة نشطة، والتأكد من أنها تظل كذلك، قبل وبعد ويجمد أنها، على الرغم من صعوبة في كثير من الأحيان، هو حجر الزاوية في عملنا. لكن، وكما لكل سيناريو إنتاج البروتين المؤتلف هو مختلف، لن تكون موجهة الظروف الأمثل لإنتاج البروتين المؤتلف هنا. وحثت المستخدمين على محاولة، حيثما أمكن، لتحديد ما إذا كان البروتين يجمد لا يزال وظيفية (على سبيل المثال إذا كان هو انزيم، القيام فحص انزيم في الآبار وحة microtiter). هذا وسوف توفر بعض الثقة بأن الطعم هو النشطة بيولوجيا، وبالتالي، أن أي تفاعلات اكتشفت هيإلى حد ما أكثر عرضة لأهميتها البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تصوير الرسم من الإجراء الموضح أدناه (الشكل 1) يسلط الضوء على اثنين من المكونات الأساسية لاختيار تقارب باستخدام مكتبة عرض فج: A) مكتبة [كدنا] فج العرض المحتمل لترميز البروتينات مع تقارب لوالطعم؛ B) الطعم المؤتلف المنقى البروتين. إنتاج الطعم (البروتين المؤتلف) وقد درست على نطاق واسع والأدب يحدد أفضل الممارسات لتأمين القابلة للذوبان، والبروتين المؤتلف نشطة من E. القولونية 12-13، الخميرة حقيقية النواة 14، 15-16 الحشرات، النباتات 17-18، 19-20 أو خلايا الثدييات كثيرة.

في بروتوكول التالية، الموسومة hexahistidyl وقد استخدم البروتين المؤتلف كطعم. وهذا يسمح التحقق من أن البروتينات الطعم البقاء في الآبار بعد الحضانة وغسل الخطوات بين عشية وضحاها.

1. ELISA لاستبقاء البروتين المؤتلف في ويلز لوحة عيار مكروي

  1. علامة لوحة microtiter مع الحبر الدائم، والمكلف الآبار والتي سوف تحتوي على تركيزات البروتين الذي. تنفيذ هذا في 3 مكررات من الآبار. وتشمل 3 مكررات من سلسلة تركيز السيطرة السلبية (البروتين الموسومة غير hexahistidyl؛ BSA يعمل بشكل جيد لأن هذا الاختيار الخلفية).
  2. غسل لوحة على نطاق واسع بالماء وإزالة المياه عن طريق صفع لوحة رأسا على عقب على 4 طبقات منشفة ورقية بين يغسل.
  3. شل، في الآبار 3 الأولى، في 100 ميكرولتر من تريس، ودرجة الحموضة 7.5، (أو عازلة للاختيار) أعلى تركيز من البروتين المؤتلف (10 ميكروغرام / مل). إضافة إلى الآبار الثلاث المقبلة البروتين المؤتلف في (1.0 ميكروغرام / مل)، الخ، وصولا الى 1.0 نانوغرام / مل. تفعل الشيء نفسه مع سلسلة تركيز BSA.
  4. تغطية الأطباق مع الاغطية البلاستيكية وترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  5. صباح اليوم التالي، وإزالة البروتين صفع لوحة رأسا على عقب 4-5 طبقات منشفة ورقية.
  6. غسل الآبار 5X مع 200 ميكرولتر 1X TBS في كل مرة، وترك المخزن المؤقتفي الآبار ل~ 1 دقيقة في كل مرة وإزالة غسل العازلة صفع لوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية بعد كل غسل.
  7. منع إليسا لوحة على شاكر دوارة باستخدام 200 ميكرولتر 5٪ (ث / ت) BSA أو 200 ميكرولتر 5٪ (ث / ت) في عرقلة كاشف TBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة (أو الجلوس بين عشية وضحاها ثابتة عند 4 درجات مئوية إذا مريحة ) ملفوفة في غلاف بلاستيكي.
  8. إزالة حل حجب الزائد عن طريق صفع لوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية. غسل 4X 1 دقيقة في كل مرة مع 200 ميكرولتر من 1X TBS، وإزالة الحل يغسل صفع لوحة رأسا على عقب.
  9. تمييع خماسي HIS الأجسام المضادة الأولية 1/2، 000 في عرقلة العازلة وتسليم 100 ميكرولتر إلى كل بئر. احتضان 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع لوحة ثابتة.
  10. إزالة الأجسام المضادة الأولية من قبل صفع لوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية. غسل 4X 1 دقيقة في كل مرة مع 200 ميكرولتر من 1X TBST. إزالة كل غسل عن طريق صفع لوحة رأسا على عقب.
  11. تمييع الضد الثانوية(عنزة مكافحة فأر الفوسفاتيز القلوية المكورات)، في عرقلة العازلة واحتضان 100 ميكرولتر في كل بئر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع لوحة ثابتة.
  12. إزالة الأجسام المضادة الثانوية من قبل صفع لوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية. غسل 4X 1 دقيقة في كل مرة مع 200 ميكرولتر من 1X TBST. إزالة كل غسل عن طريق صفع لوحة رأسا على عقب.
  13. وضع 200 ميكرولتر من شبه nitrophenylphosphate (pNPP) حل الركيزة في كل بئر. الركيزة هو الصلبة في -20 درجة مئوية حتى جعل مأخوذة واسترداد العدد المطلوب من مأخوذة اللازمة للكشف من الثلاجة قبل وقت كاف من الوقت حتى يتم إذابة تماما من قبل هذه المرحلة.
  14. في 30 دقيقة وقف رد الفعل من خلال إضافة 50 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم M 3 إلى كل بئر.
  15. قراءة الامتصاصية في 405 نانومتر على الفور على لوحة قارئ ELISA.

ملاحظة: إذا كان البروتين المؤتلف من الفائدة لا تعلق نفسها على الآبار، فمن الممكن لتغيير التكوين ه / الرقم الهيدروجيني للالعازلة كبير (درجة الحموضة عازلة كربونات 10.0) أو إضافة chaotropes (اليوريا) في محاولة لمساعدة البروتين المرفق إلى الآبار وحة microtiter. ومع ذلك، إعادة تأسيس أن البروتين المؤتلف: 1) لا يزال منضمة إلى الآبار وحة microtiter وفقا للشروط لاختيار تقارب و؛ 2) يحتفظ النشاط البيولوجي في أعقاب إزالة الحموضة العالية / chaotrope ينصح.

2. تزايد البكتيرية المضيف (BLT5403) لTitering

  1. الأوتوكلاف (الشكل 2A) عشرة قوارير 250 مل مخروطي و 3 أنابيب الثقافة. جعل LB السائل وLB أجار للصب لوحات وسائل الاعلام الصلبة. بارد LB أجار إلى 50 درجة مئوية وإضافة الأمبيسلين إلى 100 ​​ميكروغرام / مل صب قبل asceptically في أطباق بتري في غطاء تدفق (الشكل 2B).
  2. أيضا في غطاء تدفق (الشكل 2B) متتالية على LB، و 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين (LB AMP100) لوحة أجار للمستعمرات واحد من BLT5403 من الأسهم يحتفظ بها في 15٪ (V / V)الجلسرين في -80 ° C (الشكل 2C). وضع لوحة رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية خلال الليل في حاضنة للنمو (الشكل 2D).
  3. في الصباح، وتطعيم 50 مل LB AMP100 في قارورة 250 مل مخروطي مع مستعمرة واحدة التقطت من لوحة. احتضان عند 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة في شاكر الأفقي (أرقام 2E و2F)، واستخدام مطياف لرصد كثافة الخلية في OD 600 = 0،5-0،6 (الشكل 2H).
  4. صب الخلايا في أنبوب 50 مل الصقر أو ما شابه ذلك، والحفاظ على 4 درجات مئوية حتى استخدامها (الشكل 2G). سوف تبقى قابلة للحياة الخلايا عادة ل~ 1 في الاسبوع.
  5. جعل 500 مل LB، ووضعه في قارورة Fernbach حيرة والأوتوكلاف ذلك. مرة واحدة فمن معقمة، ضع قارورة في 4 درجات مئوية (الشكل 2G) أو درجة حرارة الغرفة حتى ليلة "يوم واحد" أدناه.

ملاحظة: خلايا المضيف البكتيريةBLT5403، معربا عن مصدر المنقولة البلازميد من T7 البروتين قفيصة الأم التي بدونها T7 منتصف، وناقلات، نسخة منخفضة لا يمكن نسخ بنجاح، عرضة لهذا الفيروس للغاية. لا بد من تجنب التلوث. سوف يحدث تلوث في نهاية المطاف وعند هذه النقطة يجب أن تمحى جميع الأسطح في اتصال مع الفيروس / البكتيريا المصابة مع 70٪ (V / V) الايثانول أو نقيت باستخدام المنظفات (الشكل 2I). إذا كان هذا غير فعالة، لا بد من تطهير شامل لجميع الأسطح التي يمكن أن تحمل Envirocide (الشكل 2J). بدء BLT5403 الخلايا من الأسهم الفريزر كل جولة جديدة من اختيار تقارب للمساعدة في تخفيف التلوث من الأسهم في 4 درجات مئوية، وضمان وتستخدم خلايا نشطة في البروتوكول. مرشح حاجز نصائح ماصة ضرورية.

3. اختيار تقارب

DAY ONE

  1. علامة لوحة microtiter مع الحبر الدائم، والمكلف الآبار والتي سوف تحتوي على البروتوكول الاضافي الذيEINS / التعديلات. (ونظرا لقضايا التلوث، يتم استخدامها أبدا لوحات). تنفيذ هذا في 3 مكررات لكل من الآبار البروتين والعلاج.
  2. غسل لوحة على نطاق واسع بالماء وإزالة المياه عن طريق صفع لوحة رأسا على عقب على 4 طبقات منشفة ورقية بين يغسل. شل، في 100 ميكرولتر من تريس، ودرجة الحموضة 7.5، (أو عازلة للاختيار) البروتين المؤتلف (10 ميكروغرام / مل) في ست آبار، أو BSA (10 ميكروغرام / مل) في ثلاثة آبار، ليصبح المجموع 9 آبار لأول جولة من اختيار تقارب. تغطية صحن مع غلاف بلاستيكي وترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (الشكل 2G).
  3. تأكد من أن هناك 9 × 250 مل قوارير مخروطي (انظر 2.1 أعلاه) وتنظيفها، تعقيمها، وصفت بشكل مناسب (الترميز مع الشريط الملون يعمل بشكل جيد، الشكل 2F).
  4. حساب حجم فج المحللة لاستخدامه في كل تستند بشكل جيد على عيار المكتبة المستخدمة وعدد فج ليتم عرضه.
  5. تأكد من أن الخلايا BLT5403 جديدة تكون جاهزة للاستخداملtitering هذا الاختيار تقارب الجولة غدا (الشكل 3A).
  6. ضمان ما يكفي من 1X TBS (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي تريس قاعدة، ودرجة الحموضة 7.6) و 1X TTBS (TBS 1X + 0.05٪ (V / V) توين 20) متاحة لتنفيذ 10 × 200 ميكرولتر يغسل لعدد من الآبار المستخدمة . بالإضافة إلى ذلك، يحضن مسبقا على TTBS في درجة حرارة تقارب الاختيار. تأكد من أن نسخة احتياطية، مختومة، 50 مل من 1X أنبوب فالكون TTBS موجود في درجة حرارة تقارب مع اختيار كافية 1X TTBS.
  7. 3 إعداد علاجات × 3 × 3 مكررات يثلث من 1.5 مل أنابيب إيبندورف (27 مجموع) مع 990 ميكرولتر من LB 100 AMP كل وتسمية بشكل مناسب (على سبيل المثال 10 -2). هذه هي لاسترجاع البكتيريا المصابة من الآبار وحة microtiter غدا. بمناسبة التخفيف على جانب واحد من أنبوب (10 -2) وعدد تصاعدي على الجانب الآخر ("1"). لكل أنبوب إيبندورف، أيضا تسمية أنبوب واحد واحد البورسليكات LB 100 AMP لوحة. في هذا ثالمنعم يوسف، يتم ترقيم لوحات وأنابيب الاختبار البورسليكات 1، 2، 3، 4، 5، الخ. لجعل titering أسرع. بعد ذلك عدد بسيط يمكن أن تكون مطابقة لتخفيف وعلاج على أنبوب إيبندورف (كان مثل أنبوب للرقم 12 على ثلاث نسخ الثالثة من النسخ المتماثل الأول من السيطرة BSA للتخفيف 10 -5). مخزن أنابيب إيبندورف وLB 100 لوحات AMP بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (أرقام 2G و 3B).

على سبيل المثال: بدء وضع العلامات 1.5 مل أنابيب إيبندورف لمدة ثلاثة 10 -2 التخفيفات من فج من تكرار BSA احدة كذلك 1، 2، و 3 (ثلاث قراءات ثلاث نسخ من عيار فج للنسخ المتماثل واحد)، ثم وضع علامة البورسليكات أنابيب الاختبار 1، 2 و 3 التي سوف تكون مختلطة البكتيريا المصابة ببكتيريا المعافين وكبار الاغاروز قبل صب على لوحات LB 100 AMP أجار (الشكل 3C).

  1. لد المسلسلilutions، والتسمية أنابيب إيبندورف، وإلى كل منهما، إضافة 900 ميكرولتر من LB 100 AMP. مرة واحدة يتم إجراء التخفيفات الأولي (10 -2) من البكتيريا المصابة لكل بروتين / العلاج، والنسخ، وثلاث نسخ، وغدا، وسوف تكون مختلطة جيدا و 100 ميكرولتر اتخذت منها وإضافتها إلى أنبوب إيبندورف المناسبة التي تحتوي على 900 ميكرولتر LB 100 AMP لتخفيف 10 -3 (أنابيب 4، 5، و 6 للسيطرة BSA تكرار واحد). وسوف تكون مختلطة جيدا هذه بدورها وسيتم استخدام 10 -3 التخفيفات لجعل 10 -4 التخفيفات (7، 8، 9). استخدام 10 -4 التخفيفات ل10 -5 التخفيفات (10، 11، 12)، وغيرها. للحصول على عيار لأول من مكررات BSA الثلاثة (الآبار).
  2. نفس وسيتم ذلك من أجل النسخ المتماثل BSA اثنين (حسنا 2)، BSA تكرارها ثلاث (3 جيدا)، ومكررات ثلاثة من الطعم المسموم، وأخيرا مكررات ثلاثة من الآبار الطعم. في النهاية، يجب أن يكون هناك أنابيب صفت ومدمج 1-135 (135 هو ثلاث نسخ الأخيرة من تكرار الماضي من الطعم في تخفيف الحد الأقصى من 10 -6). تخزين هذه الأنابيب إيبندورف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (الشكل 3C يظهر إيبندورف وأنابيب البورسليكات لجميع التخفيفات من يثلث من ثلاثة مكررات (الآبار الثلاثة) من جيش صرب البوسنة.
  3. بدء 2 أو 3 أنابيب ثقافة الخلايا BLT5403 (التقطت من المستعمرات واحد من يشوبه طازجة بين عشية وضحاها لوحة LB AMP100؛ من الخطوة 2.2 أعلاه) نموا في احتضان شاكر (أرقام 2E و2F) باعتبارها الثقافة بين عشية وضحاها. إلى 500 مل LB (نقطة 2.5 أعلاه)، إضافة إلى 100 ​​الأمبيسلين ميكروغرام / مل ووضع قارورة Fernbach في المشبك في حاضنة تهتز لذلك سوف تكون عند 37 درجة مئوية والغازي في صباح اليوم التالي (الشكل 2F).

ملاحظة: الجولة الثالثة والرابعة قد تتطلب التخفيفات التقريبية لتصل إلى 10 -10 حجم صالحاج إلى حجم لLB AMP100.

اليوم الثاني

  1. صباح اليوم التالي، ضع تعقيمها، فارغة 9 × 250 مل قوارير مخروطي (واحد لكل وحة microtiter جيدا) في المشابك في احتضان شاكر. تطعيم 500 مل LB 100 امبير مع 500 ميكرولتر من واحدة من الثقافات بين عشية وضحاها من الخلايا التي BLT5403 الليلة الماضية (انظر الخطوة 3.8 أعلاه)، وختم تشغيله النمو (37 درجة مئوية، 220 دورة في الدقيقة). بدوره على معمل (الشكل 2H) وتعيينها إلى قراءة الامتصاصية في 600 نانومتر.
  2. إزالة لوحة microtiter من 4 درجات مئوية، وإزالة فيلم من البلاستيك، وإزالة أي البروتين غير منضم من لوحة عن طريق غسل 10X مع 200 ميكرولتر من 1X كل مرة TBS 7.5 درجة الحموضة وصفع لوحة رأسا على عقب على منشفة ورقية بين يغسل. منع مع 200 ميكرولتر 5٪ (ث / ت) BSA أو 200 ميكرولتر 5٪ (ث / ت) في عرقلة كاشف TBS لمدة 1 ساعة (أو بين عشية وضحاها في حالة مريحة) مع لوحة ملفوفة في غلاف بلاستيكي.
  3. يغسل ليالي الحجبolution 10X مع 200 ميكرولتر من 1X كل مرة TBST، صفع لوحة رأسا على عقب على 4 طبقات من منشفة ورقية بين يغسل. فمن الممكن لإعادة ملء الآبار مع 200 ميكرولتر المياه في هذه المرحلة، تغطيتها مع غلاف بلاستيكي ووضعها في 4 درجات مئوية لتخزين لأقصى قدر من 1 في الاسبوع.

ملاحظة: بدء ثقافة قريبا بما فيه الكفاية أنه، في الوقت الذي فج المصابة BLT5403 من الانتهاء من اختيار تقارب مستعدون لإضافة الخلايا في 500 مل ما بين 0.6 و 1.0 OD 600. إذا كانت تنمو أبعد بكثير 1.0، قد لا يحدث تحلل بسبب قيود الموارد مع اقتراب خلايا الطور الثابت. إذا كانت الخلايا لا تحقيق لOD 600 من 0.6 قبل على الأقل لإدخال فج، وتعدد العدوى يمكن أن تكون مرتفعة للغاية، مما أسفر عن مقتل بسرعة الخلايا، التي يمكن أن تؤثر على تمثيل المحللة. إذا كانت الخلايا لا تقترب حتى الان الى OD 600 من 0.6 قبل الانتهاء من اختيار تقارب، شركة النفط الوطنية العراقيةulate القارورة مع أكثر BLT5403 من الثانية (أو حتى من الثاني والثالث على حد سواء) أنابيب الاختبار تهتز عند 37 درجة مئوية (الشكل 2F). إذا كان OD 600 من 1.0 يقترب بسرعة أيضا، إيقاف سخان وشاكر وفتح غطاء لتبريد الثقافة وتجويع البكتيريا للأكسجين. تم إضافة يعاود التدفئة / الهز مرة واحدة في فج.

من هنا استخدام حاجز نصائح فلتر لتجنب فج التلوث المتبادل.

  1. مرة واحدة يتم تلقيح القارورة، وضعت المكتبة فج (100 ميكرولتر) في مع البروتينات، وختم لوحة مع الاغطية البلاستيكية ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  2. في 55 دقيقة، تسجيل OD 600 من الخلايا. الوقت هو مضاعفة تقريبا كل 20 دقيقة. العمل وفقا لذلك (انظر "ملاحظة" أعلاه).
  3. في نهاية ساعة واحدة إزالة غلاف بلاستيكي من لوحة ويغسل فورا الرج فج في النفايات تتحول بسرعة ثم إضافة 200 ميكرولتر من 1X السلST. (استخدام multipipettor مع رئيس ميكرولتر 1 = 100 وpipettor تعيين على 2 [أي يسلم 200 ميكرولتر / المكبس الاكتئاب] لهذا ويذهب بسرعة). تحديد توقيت لمدة 1 دقيقة. بعد 1 دقيقة، نفض عازلة في النفايات تحول، لوحة صفعة رأسا على عقب على منشفة ورقية ووضع مرة أخرى على مقاعد البدلاء (25 ° C لوحة). تكرار غسل الخطوات 10X.
  4. بعد غسل ال 10، واتخاذ 200 ميكرولتر من BLT5403 الخلايا من أنبوب فالكون 50 مل في 4 درجات مئوية ووضعها في قاع البئر التي تمت إزالة غسل الماضي من TTBS. التفاف على لوحات في غلاف بلاستيكي وضعت في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للحصول على أي فج لا تزال عالقة إلى الطعم لتصيب البكتيريا (انظر الملاحظة في المناقشة المتعلقة فج استرجاع بإصرار و / أو خلفية عالية من دون تمييز فج ملزمة).
  5. في نهاية 20 دقيقة، بسط لوحات ويستغرق 10 ميكرولتر من البكتيريا BSA في 25 ° C تكرار بئر واحدة ووضعها في 990 ميكرولتر من LB 100 AMP ملحوظ"1". كرر مرتين أكثر لذلك جيدا (أنابيب 2 و 3) مما أدى إلى 3 من يثلث 1/100 التخفيفات من فج من ذلك أيضا. هذا هو BSA نسخ متماثل واحد عينات ثلاث مرات. وسوف تستخدم هذه التخفيفات لتقدير متوسط ​​عيار ± SEM لأن تكرار BSA.
  6. تفعل الشيء نفسه للنسخ المتماثل 2 و 3 من BSA (ثلاث عينات من ثلاث نسخ 10 ميكرولتر لكل منهما)، لآبار منسوخة ثلاثة من البروتين الطعم المسموم، وللبروتين الطعم. تعيين هذه 27 أنابيب إيبندورف جانبا والحصول على 170 ميكرولتر المتبقية من البكتيريا المصابة في الآبار المتزايد نحو تحلل.
  7. إذا كانت البكتيريا في قارورة هو في OD 600 = 0.6-1.0، صب 50 مل من الخلايا Fernbach قارورة في كل من تسع 250 مل قوارير مخروطي. تأخذ 170 ميكرولتر المتبقية من المصابين فج BLT5403 البكتيريا في النسخ المتماثل BSA 1 جيدا وإضافته إلى 50 مل الخلايا وضع علامة "BSA معدل تقييم 1" (الشريط الأصفر). نفعل ذلك لجميع الآبار التسعة ووضعها في حاضنة تهتز (
  8. رصد الخلايا في 37 درجة مئوية شاكر يحتضنها من وقت لوقت للتحلل (حوالي 3 ساعة من وقت التلقيح). جعل التخفيفات من 27 التخفيفات الأولي (10 -2) في المناسبة، وأنابيب إيبندورف المسمى خلال هذا الوقت.
  9. لتنفيذ هذه التخفيفات من 27 التخفيفات الأولي من 3.12 أعلاه، واتخاذ 100 ميكرولتر من LB مع البكتيريا من أنبوب إيبندورف 1 (BSA تكرار واحد، الأول من عينات ثلاث نسخ من هذه 1/100 التخفيف من هذه البئر) وإضافته إلى 900 ميكرولتر من LB في أنبوب إيبندورف 4 (1 × 10 -4 التخفيف من تكرار BSA واحد، الأول من عينات ثلاث نسخ من هذه البئر).
  10. تجاهل الطرف الحاجز مرشح عن واحدة جديدة قبل الحصول على 100 ​​ميكرولتر من LB مع البكتيريا من أنبوب إيبندورف 4 إضافة إلى 900 ميكرولتر من LB في أنبوب إيبندورف 7 (1 × 10 -5 التخفيف من BSA تكرار واحد، الأولى من ثلاث نسخ عينات من هذه البئر). تواصل التخفيفات (دالخاصة إلى 1 × 10 -6) لجميع يثلث جميع مكررات من جميع البروتينات والعلاجات (135 أنابيب في المجموع).
  11. بمجرد هي lysed الخلايا، وجلب الثقافة إلى 0.5 M كلوريد الصوديوم عن طريق إضافة 5 مل من كلوريد الصوديوم M 5 الأسهم ونقلها إلى زجاجة الطرد المركزي المسمى.
  12. أجهزة الطرد المركزي في 8000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. صب طاف (الفيروس) في بيئة نظيفة، معقمة 50 مل أنبوب فالكون.
  13. إضافة بضع قطرات من الكلوروفورم لطاف يصب في أنبوب فالكون.
  14. تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة الجولة المقبلة من اختيار تقارب.

4. اليوم الثالث

  1. الأوتوكلاف أو تبييض جميع معدات المختبرات التي تم استخدامها في توليد هذا الاختيار تقارب جولة للتحضير للجولة القادمة.

5. Titering

  1. عدد ما يصل الصلبة LB 100 لوحات AMP كما أن هناك التخفيفات في ترتيب تصاعدي (يجب أن يكون هناك الآن 1 لوحة لكل أنبوب البورسليكات وإيبندورف أنبوب، ولكل منها نفس العدد). Pحزب التحرير لوحات في الحاضنة 37 درجة مئوية (الشكل 3D).
  2. تذوب أعلى الاغاروز (1.0 غرام Bacto تريبتون، مستخلصات الخميرة ز 0.5، 0.5 غرام كلوريد الصوديوم، 0.6 غرام الاغاروز، وجعل ل100 مل، الأوتوكلاف) من خلال تخفيف أعلى غطاء زجاجة الاغاروز والميكروويف بالتناوب الزجاجة ويحوم عليه لأنها مزيج حتى أعلى الاغاروز قد ذاب تماما. وضع زجاجة في حمام الماء لتبرد إلى 50 درجة مئوية (الشكل 3E).
  3. اتخاذ مل ماصة البورسليكات 10 مع مضخة ماصة المرفقة. إشعال الموقد بنسن. تحويل حامل الستايروفوم أنبوب فالكون أو برودة غطاء رأسا على عقب على مقاعد البدلاء ووضع لوحات LB100 AMP من 1 إلى 6 (الطازجة من الحاضنة 37 درجة مئوية) على ذلك، لوحة 1 العلوي (الشكل 4A). والستايروفوم تحافظ على لوحات دافئة.
  4. وضع 250 ميكرولتر BLT5403 الخلايا من 4 درجات مئوية في كل من أنابيب الاختبار البورسليكات مرقمة أعد في يوم واحد أعلاه (القسم 3.7 وأرقام 4B و 4C). عتتراوح أنابيب البورسليكات مرقمة في نفس سلسلة تصاعدي كما التخفيفات في 1.5 مل أنابيب إيبندورف (الشكل 4A).
  5. وضع 100 ميكرولتر من التخفيف في أنبوب إيبندورف 1 في 250 ميكرولتر من الخلايا في البورسليكات أنبوب اختبار 1 (أرقام 4D و4E). تسخين أول 5 من ماصة على اللهب قليلا (ليس كثيرا! ~ 3 صفعات، 4F الشكل) والغطس في الاغاروز أعلى المنصهر. سحب ما يصل 3 مل وتسليم بسرعة في أنبوب الاختبار على رأس خلية / فج (الشكل 4G).
  6. مزيج من قبل عبها مع اصبع في حين عقد أنبوب مع جهة أخرى (الشكل 4H) وتصب محتويات على لوحة (الشكل 4I). إمالة لوحة واستخدام أنبوب اختبار لمطاردة الفقاعات والبقع الجافة حتى يتم تغطية لوحة كاملة من الاغاروز أعلى. ضعه جانبا، وتستقيم على مقاعد البدلاء لتبرد.
  7. تجاهل أنبوب البورسليكات، إخراج طرف حاجز مرشح، والحصول علىواحدة جديدة وتستمر حتى تم مطلي جميع التخفيفات. استرداد LB 100 AMP لوحات من الحاضنة مع استنزاف أنها ولكن ليس أكثر من 6 في وقت أو أنها تبرد والاغاروز أعلى يتصلب بسرعة كبيرة جدا.
  8. مرة واحدة في أعلى الاغاروز صلبة، وتحويل لوحات رأسا على عقب (ومن المهم القيام بذلك). خلاف ذلك، وأجار / الاغاروز "يبكي"، يتكثف على الغطاء، يسقط باستمرار على الاغاروز أعلى وتدير أكثر من ذلك، مع الأخذ في فج معها مما يجعل من المستحيل عيار بدقة) وإما: 1) وضع لوحات في 37 درجة C حاضنة [أن يعود في وقت لاحق 4 ساعة لحساب عيار كما T7 هو العدوانية] OR: 2) اترك لهم رأسا على عقب على مقاعد البدلاء وأنهم على استعداد في صباح اليوم التالي لحساب عيار.
  9. اتخاذ جميع الاحتياطات اللازمة للحماية ضد تحطيم الزجاج، أو الإصابة إذا كان كذلك، وضع سقف أعلى زجاجة الاغاروز مرة أخرى على فضفاضة والميكروويف الاغاروز أعلى حتى يغلي. القيام بذلك مرتين. ندعه يبرد، وتشديدقبعة وضعها بعيدا. تحويل حمام الماء إلى درجة حرارة المعتادة أو إيقاف تشغيله. وضع التخفيفات في الثلاجة 4 درجات مئوية. وسوف تكون هناك حاجة لتفسير التتر و / أو إعادة بعض titering.

6. تحديد وحساب عيار

  1. دراسة وحة شكلت على لوحات وتجاهل تلك التي تحلل متكدسة (الشكل 5A على سبيل المثال 10 -2 التخفيف). تحديد أي من ما تبقى من التخفيفات المسلسل أنتجت قليلة بما فيه الكفاية لوحة لتمكين حصيلة دقيقة (أرقام 5A 5B والثانية). تسجيل عدد من هذه اللوحات لوحة (الجدول 1؛ الشكل 5B).
  2. ضرب عدد من البلاك بنسبة التخفيف ثم تضاعف هذا العدد ب 100 للحصول على عدد الوحدات التي تشكل لوحة لكل مل من البكتيريا المصابة المأخوذة من الآبار (أي أخذت فقط 10 ميكرولتر من البكتيريا المصابة لكل من يثلث وقس هذا يجب مضروبا في 100 للحصول على التهم لكل مل). متوسط ​​عدد وحدات اللوحة تشكيل (PFU) في الملليمتر الواحد، (PFU / مل من البكتيريا المصابة غير مخفف اتخاذها للخروج من لوحة microtiter جيدا)، في جميع أنحاء يثلث ثلاثة المأخوذة من هذا أيضا.
  3. تشكيل جراند متوسط ​​للاحصاءات لآبار تكرار ثلاثة وحساب الخطأ المعياري للمتوسط ​​هذا (الجدول 1). هذا هو ما سيتم تسجيلها في هذا الرقم من الزيادة في فج عيار كل جولة اختيار تقارب والعلاج (الشكل 5C).

7. عزل لوحة، PCR، وتسلسل

  1. في نهاية الجولة تقارب اختيار 4، حدد 18 فرد، واضحة المعالم، والمستعمرات وحة، وذلك باستخدام العقيمة باستور ماصة، مسواك، الأصفر غيض ماصة أو جهاز مماثل، جوهر هذه اللوحة من لوحات titering. في حالة استخدام الأنابيب أو نصائح، أولا الرطب الداخل مع تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.5 في أنبوب إيبندورف (الشكل 5D).
    2. (الشكل 5E). الافراج عن لمبة مع طرف ماصة تزال في أجار / قمة الاغاروز وتمتص جوهر (الشكل 5F، انظر السهم).
  2. طرد الأساسية إلى 100 ​​ميكرولتر تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.5 في الأنبوب المناسب (الشكل 5G) ودوامة لفترة وجيزة.
  3. حرارة 20 ميكرولتر من هذا الحجم عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  4. أجهزة الطرد المركزي لحجم ساخنة في 13،000 XG في جهاز للطرد المركزي الفوق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. يستغرق 3 ميكرولتر من طاف من هذه قسامة لاستخدامها في تفاعلات PCR مع T7 T7-UP-DOWN والاشعال.
  5. لكل من لوحة معزولة 18، ​​حلول ساخنة، وجعل 50 ميكرولتر رد فعل PCR باستخدام درجة حرارة الصلب من 58 درجة مئوية و 35 دورات.
  6. تشغيل 20 ميكرولتر من مجموعة شرق افريقياح رد فعل على 1٪ (ث / ت) agarose هلام يحتوي على 0.015٪ (ت / ت) بروميد إيثيديوم. تصور مع transilluminator باستخدام حماية العين المناسبة وقفازات النتريل المختبر. (تنبيه: بروميد إيثيديوم هو المغير قوية.) صورة الجل والتخلص من المواد الملوثة بشكل صحيح (أرقام 6A و6B).
  7. إذا كان amplicons هي منتجات واحدة، وليس من ناقلات الفارغة (المنتج يعمل بالقرب من 100 سنة مضت على 1٪ (ث / ت) TAE agarose هلام؛ أرقام 6A 6B والسهام)، وتنظيف 30 ميكرولتر المتبقية للاستخدام كقالب التسلسل. إن لم يكن منتج واحد على هلام (الشكل 6B، لوحة 15)، وقطع الفرقة أبرز (ق) من الجل واستخراج الحمض النووي من الجل باستخدام عدة.
  8. تسلسل amplicons التي ليست ناقلات الفارغة باستخدام التمهيدي T7-UP.
  9. فحص كل تسلسل للأسلحة رابط و، من هذه المعلومات، وتحديد أين يقع بدء إدراج. استخدام باكذا المحلي محاذاة أداة البحث (الانفجار؛ المكتبة الوطنية للطب) لتحديد هوية [كدنا المشفرة، سواء إدراج في الإطار، وإذا كان الأمر كذلك، تم عرض ما جزء من البروتين الترميز تسلسل (CDS) والتي استولت عليها الطعم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أن تكون قادرة على إضعاف قدرة الطعم للتفاعل مع البروتينات عرض فج (أيضي تسمم الطعم) يوفر سيطرة سلبية قوية لهذه التقنية. كما أنه من المستحسن لتحديد ما إذا كان الطعم، عندما منضما إلى لوحة microtiter جيدا، يحتفظ ظيفتها. كل من هذه الشيكات سيزيد من الثقة بأن التفاعل، البروتينات عرض فج يستردها الطعم nonpoisoned مشروعة.

أخذ العينات الثلاث يثلث من كل بئر يضيف إلى حد كبير في الوقت والعمل تشارك في اختيار تقارب ولكنها توفر تقديرات أكثر دقة من عيار داخل كل بئر من أخذ العينات مرة واحدة فقط. في حين أن معظم من التتر ليثلث في اتفاق جيد، لاحظ أن يثلث للنسخ المتماثل 2 من جيش صرب البوسنة في الجولة الرابعة تختلف على نطاق واسع (الجدول 1). عن طريق أخذ عينات عدة مرات، وصلت الأرقام التقديرية النهائية ليست عرضة للأخطاء pipetting لوتقدير أكثر دقة للرانه عيار الفعلي والاختلاف حول هذا التقدير، ويتم الحصول على جيد إلى جيد (الجدول 1، الشكل 5C).

زيادة فج عيار، تفضيلي لnonpoisoned الطعم، حيث بلغ عدد الجولات زيادة تقارب الاختيار، ويوفر أيضا الثقة في أن هذه التقنية تعمل (الشكل 5C). الإبقاء على نسبة متزايدة من فج تحتوي على إدراج الآبار في الطعم nonpoisoned حيث وصل عدد من التحديدات زيادات تقارب هو أيضا الميمون (أرقام 6A و6B).

بعد جولات متقدمة من اختيار تقارب، وزيادة في عدد تعافى بشكل مستقل فج التي إدراج (PCR ملحوظ كما amplicons أكبر في الحجم من ~ 100 سنة مضت؛ الشكل 6B)، نسبة إلى الدور الأول (الشكل 6A)، وتصفية هذه amplicons على بعض العصابات بحجم مماثل (الممرات علما 5-9، 11-18 في الشكل 6B </ STRONG>)، هو مؤشر جيد على أن الحيوانات المستنسخة خاصة يتم اختيارها في اختيار تقارب (أرقام 6A و6B). بعد تسلسل عدد من الترسبات التي تم الحصول عليها في اختيار تقارب النهائي الجولة، استرجاع منطقة مماثلة (استنساخ مختلفة) من نفس البروتين هو التحقق المستقل أن جزء من البروتين عرض لها قابلية حسن النية لالطعم. هذه فج تعافى بشكل مستقل أيضا تقديم معلومات عن أي جزء من البروتين بأكمله قادر على التفاعل مع الطعم. إذا كان عرض فج وقد تم بناؤها باستخدام [كدنا] مكتبة فتيلة عشوائي، والتنوع الكبير في التغطية الجزئية وكامل طول البروتين يمكن توقع (ضمن حدود فج على تحمل حجم كدنا] الإدراج)، مما أدى إلى متعددة، استنساخ مستقلة تغطي نفس الجزء من البروتين. ينبغي فحص حتى متجاورة الفعالية خارج الإطار إلى تحديد ما إذا كانت ترميز عزر مماثلة التي بافإنه يلزم. (وهذا يفترض أن المكتبات لم تكن شيدت باستخدام التكنولوجيا ORF 3).

الجدول 1
الجدول 1. الحسابات لعيار متوسط ​​/ البكتيريا المصابة مل من الآبار من الجولة الرابعة من اختيار يتعاطف مع العلاجات الثلاثة. الأرقام لكل ثلاث نسخ من 10 -3 التخفيف من لوحة مأخوذة من النسخ المتماثل الأول من الطعم جيدا مأخوذة من الشكل 5B. اضغط هنا لمشاهدة الجدول أكبر .

الشكل 1
الشكل 1. تصوير الرسم عموما من عملية العرض فج A) الوصول إلى مكتبة فج عرض، ويفضل شيدت باستخدام تستعد بشكل عشوائي، وبولي-A RNA المحدد، لتوليد cDNAs؛ وباء) الطعم وهذا هو، في قدر الإمكان، كما يمكن التحقق منها نشطة بيولوجيا، حتى عندما يجمد على دعم قوي، إذا كان ذلك ممكنا، وبإبطال بإضافة مثبطات (على سبيل المثال تحول دون منافسة من البروتين الطعم ملزمة). RT: عكس النسخ.

الرقم 2
. الرقم 2 بعض المعدات والمواد اللازمة لأداء عرض فج يتطلب تقنية العقيمة الوصول إلى كلا من: أ) الأوتوكلاف و؛ B) غطاء تدفق الصفحي. تتطلب المكتبات فج وBLT5403 الأسهم البكتيرية -80 & # 176؛ C درجات الحرارة لفترات طويلة التخزين C) تزايد فج والبكتيريا يتطلب، DF) 37 ° C الحاضنات، واحدة منها، EF) هو قادرة على النمو الثقافات السائل (المدارية). الاستفادة المثلى من التجربة من خلال الترميز اللوني، F) يقلل من الأخطاء. BLT5403 الخلايا لtitering يمكن تخزينها لمدة تصل إلى أسبوع واحد، G) في 4 درجات مئوية. يمكن تحقيق الاستفادة المثلى من موضع، H) معمل لمتابعة كثافة الخلية التالية إلى شاكر تدور حول توفير الوقت. علاج متكرر السطوح وماصات مع، I) المنظفات القوية وJ) Envirocide، يمكن أن يساعد على التقليل من خطر التلوث الفيروسي. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

85fig3.jpg "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50685/50685fig3highres.jpg "/>
الرقم 3. تزرع واحد ممكن انشاء مفيدة لاختيار السماح السلس تقارب. أ) BLT5403 يوم أو يومين قبل titering ومطلي، دون إدخال الفيروسية، لتحديد أنها ليست ملوثة بفيروس. Titering يوم اختيار تقارب يمكن أن تيسره تستعد مسبقا من قبل: B) prelabeling في إيبندورف و؛ C) أنابيب البورسليكات لاستخدامها B) Aliquoting الحلول التخفيف من LB 100AMP وتخزينها في 4 درجات مئوية خلال الليل D. ) ضع prenumbered، LB 100AMP المحتوية على أجار، أطباق بتري عند 37 درجة مئوية لتدفئة حوالي 1 ساعة قبل titering. E) ذوبان الاغاروز أعلى عقيمة (ترخي الغطاء) ووضعه في مسخن 50 ° C حمام الماء لتبريد إلى هذه الدرجة قبل ساعة titering تبدأ. استخدام جنيهدونات الإعلان لتجنب انقلاب زجاجة كما تتم إزالة أعلى الاغاروز. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 4
الشكل 4. Titering فج تعافى من جولة الاختيار تقارب. الطلاء تبدأ في أقرب وقت ممكن بعد الاصابة لمنع التضخم الاصطناعي من عيار ألف) أول مجموعة من المصابين بفيروس BLT5403 التخفيفات وأنابيب البورسليكات تجميعها في الرفوف. نصائح باستخدام حاجز التصفية: BC) 250 ميكرولتر BLT5403 الخلايا من الأوراق المالية من 4 ° C يتم نقلها إلى أنابيب البورسليكات. إصابة DE) وBLT5403 في أول أنبوب البورسليكات مع فاي: نصائح باستخدام حاجز التصفيةالتخفيف فيروس RST. F) يسخن ماصة البورسليكات على لهب مكشوف لمنع انسداد وللحفاظ على أعلى دافئة الاغاروز. يتم استردادها لا تسخن ماصة مفرط أو سيتم المبسترة البكتيريا ويموت G) 3 مل المنصهر الاغاروز أعلى بسرعة وسكب على البكتيريا في أنبوب البورسليكات H) وانقض الأنبوب لفترة وجيزة لخلط محتويات و؛ الأول) سكب محتويات prewarmed على لوحات أجار LB 100AMP، وذلك باستخدام أنبوب لنقل فقاعات على جانبي لوحة وضمان أعلى الاغاروز تغطي لوحة كاملة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 5
الرقم 5. نموذجية عيار إعادةsults. A) والتخفيفات أقل (10 -2) تؤدي دائما تقريبا في تحلل متكدسة لجميع العلاجات في أول تقارب اختيار الجولة (قد نمت الفيروس في الرقم الناتج مفرط طويلة في حجم اللوحة المفرط لتسهيل التصوير). B) تحسب التخفيفات المناسبة البلاك باستخدام شربي لتتبع البلاك اذاعتها. ج) زيادة عيار بشكل كبير للآبار الطعم في حين تبقى أكثر أو أقل استقرارا لBSA أو الطعم المسموم. في جولات في وقت لاحق، من عيار الطعم الآبار الهضاب وكذلك اختيار تقارب غير منتجة. D) قد تم اختياره لوحة معزولة جيدا لتسلسل تجمعها وترطيب ماصة المراعي مع الحل من الأنبوب إيبندورف، ويجري التأكد من القضاء على السائل الزائد الأقل دهس لوحة متعددة وتلوث الأساسية. E) وقد دفعت ماصة من خلال اللوحة مع لمبة ماصة مضغوط بالفعل . F) لقد تم الافراج عن لمبة في حين ماصة لا يزال في الاغاروز أعلى، مص اللوحة تصل إلى ماصة (سهم). G) والبلاك محفور على وشك أن يتم تسليمها في السائل في أنبوب إيبندورف المناسبة. وصفت التخفيفات فج (حجم البكتيريا المصابة في حجم LB 100AMP) على أطباق بتري (على سبيل المثال 10 -3 = 1/1، 000 تمييع). ويختصر العينات ثلاث نسخ ثلاثة من النسخ المتماثل بشكل جيد (1)، الرحلة. 1، رحلة. 2، والرحلات. 3، وكلها للنسخ المتماثل 1 (1 = النائب جيدا 1). الأرقام في الجزء السفلي من لوحات في B) هي الأرقام الفعلية لوحة مدون على لوحات. هذه هي ل10 -3 التخفيف من البكتيريا من الجولة الرابعة من اختيار تقارب (R4 في الشكل) على الطعم. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

"دائما"> الرقم 6
الرقم 6. نتائج PCR نموذجي لاختيار تقارب أكثر من الطعم المناسب. أ) النسبة المئوية لوحة فارغة ناقلات (سهام) هو عادة ما تكون مرتفعة جدا في البداية، ولكن في الآبار الطعم؛ B) النقصان في الجولات اللاحقة. وقد مالت إدراج وحة تحتوي على تسوية على تلك التي تحتوي على إدراج الحجم مماثل في وقت لاحق هذا التقارب اختيار الجولة. MWM: الوزن الجزيئي ماركر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عن طريق تشغيل التجربة في ثلاثة آبار منسوخة، فج المكتسبة بشكل مستقل من نفس البروتين ملزمة إلى الطعم يمكن تمييزها حتى لو كانت هي نفسها استنساخ (أي لا فرق في تسلسل النوكليوتيدات المنطقة CDS التي تم الحصول عليها ولكن كانت هذه استردادها من آبار مستقلة). خلاف ذلك، فإن الطريقة الوحيدة للتمييز بين فج ترميز البروتين نفسه ملزما للالطعم هو مستقل إذا كانت عكس المناطق كتب التي تختلف في بعض جزء من تسلسل النوكليوتيدات.

استخدام واحد Fernbach القارورة التي تنمو كل من البكتيريا لاستخدامها في تضخيم فج اختيارها تقارب يسمح للرصد أقل المحمومة بكثير من نمو البكتيريا المؤدية للإصابة بعد اختيار تقارب من محاولة لرصد 9 قوارير مخروطي. الصب هذه البكتيريا، فقط قبل الإصابة، في قوارير مخروطي prewarmed يلغي التناقضات أيضا عيار sublibrary بسبب العبوة البديلةحصص في تعدد العدوى بسبب نمو البكتيريا الفقراء في قوارير محددة. وبالتالي، ينبغي إجراء تعديلات في فج من عيار مستديرة لجولة تعتمد على عدد من فج الاحتفاظ بها في الآبار وينبغي أن يكون الاختلاف في عيار بين الآبار منسوخة الحد الأدنى.

واحدة ميزة استثنائية باستخدام شاشة فج هو قوة عظمى لديها هذه التقنية في تحديد فج-عرض البروتين أن يكون هناك تقارب لالطعم معينة. ويرجع ذلك إلى الكفاءة التي فج تكرار في المضيف BLT5403، حتى فج واحد يمثل CDS النادر أن يتم الاحتفاظ بها في بئر في أول جولة اختيار تقارب، يجب أن يكون البروتين تنصهر معطف قابلية عالية للالطعم، وسوف أن تكون ممثلة في الجولة الثانية من قبل أعداد أكبر من ذلك بكثير. قبل الجولة الرابعة، ينبغي أن تشكل هذه فج غالبية فج موجودة في الثقافة هي lysed.

هذه قدرة لتكرار فج لعيار عالية هي أيضا وجود قيود على التكنولوجيايت ضمن. إذا كان الطعم خاصة لديه شريك التفاعل البروتين التي لديها قابلية عالية في المكتبة، فإنه من الصعب جدا للقبض على البروتينات التي قد ربط الطعم مشروعة ولكن في تقارب أقل وهذه سوف تميل إلى أن تكون outcompeted من البروتين ملزمة تقارب عالية . استخدام تقنيات الجيل القادم التسلسل لتحديد مثل هذه فج نادرة هي إحدى الوسائل الممكنة للتحايل على هذا التحديد 1. وعلاوة على ذلك، فإن القابلية للBLT5403 الى نتائج T7 فج في نوبات من "التلوث" في جميع أنحاء المختبر التي تتطلب المثابرة، decontaminants قاسية إلى حد ما (على سبيل المثال Envirocide) وتقنية معقمة ممتازة للتغلب عليها. تلوث يمكن أن يؤدي إلى خسارة كبيرة من الوقت في التقدم للاختيار واحدة تقارب يحاول تحديد والقضاء على مصدر.

إحدى الوسائل التي يقتصر النجاح في تقسيم فج في "المجلدات" ضيق وفضفاض هو محاولة استرداد المجلدات فضفاضة الأولى بذ إدخال في الآبار حلا (1٪ SDS أو chaotrope مماثلة) مصممة لإزالة الفيروس التي لا بد أقل بإحكام على الطعم. هذا الحل يمكن بعد ذلك إزالة الأولى، قبل إدخال البكتيريا في الآبار التي من المتوقع أن تكون مصابة من قبل أولئك فج المتبقية منضمة إلى الطعم. هذه التقنية يمكن أن تقلل أيضا الخلفية، فج ملزمة بدناءة، إلى حد كبير. ومع ذلك، إذا تم اتباع هذا الأسلوب، وتضاعف عدد sublibraries، مكررات والتكرارات النسب المحددة في الجولات اللاحقة، وهو ما يضيف إلى حد كبير في الوقت والنفقات.

يمكن متابعة مسار فج زيادة عيار مدى عدة جولات من الاختيار تقارب تشغيل من خلال كمية كبيرة من LB وعدد كبير من لوحات LB 100 AMP، نصائح حاجز التصفية، أنابيب إيبندورف، الخ. هذا هو الثمن كما هو التسلسل المطلوب لدراسة حتى عدد متواضع من فج. Titering عدد كبير من التخفيفات من عدة مكررات من آرeatments في ثلاث نسخ يتطلب وقتا طويلا وبالتالي فإن أهمية إقامة أكبر قدر من المواد ممكن اليوم قبل اختيار تقارب هو الهدف الأسمى.

أحد الاحتمالات المثيرة التي يجري حاليا استكشاف هو استخدام الموقع من البروتينات فج مستقلة وملزمة إلى الطعم، لنمذجة الخواص المادية والبنية الثلاثية الأبعاد للمنطقة من البروتين التفاعل مع الطعم. على سبيل المثال، ودراسة سمات أهداف البروتين الذي منضما إلى مجموعة من مثلي مرحلة التطور الجنيني في وقت متأخر وفيرة (LEA) البروتينات من نبات الأرابيدوبسيس (نبات الأرابيدوبسيس thaliana) وفول الصويا (جليكاين ماكس)، وكان استنتاج واحد المهم أن البروتينات LEA منضمة إلى منطقة البروتينات التي كانت معظم (أو من بين الأكثر) ماء من البروتينات ملزمة 11. بأثر رجعي، بالنظر إلى أن يتم الافتراض البروتينات LEA لحماية الجزيئات موكلهم من تمسخ خلال الجفاف، يمكن أن يكون قurmised أن المنطقة من الجزيئات العميل الأكثر عرضة للاختلال وظيفي دون حماية LEA قد تكون تلك الأكثر قدرة على المياه ملزمة (ماء).

فإنه من المستحسن لتقليل الوقت بين إدخال البكتيريا في الآبار واسترجاع بهم حتى لا يتم نفخ عيار. تأكد من أن التخفيفات كافية من قبل بعض الطلاء BLT5403 دون عدوى فيروسية للتحقق من أن المخزون البكتيرية وغير ملوثة وأن أعظم التخفيفات كافية لتجنب تحلل متموجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا المشروع جزئيا من قبل NSF IOS (0849230)؛ هاتش، McIntire-ستينيس (AD421 كريس)، وزارة الزراعة منح البذور (2011-04375)، والسير فريدريك زمالة أبحاث ماكماستر إلى ABD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone Becton Dickinson Co. 211705
Yeast Extract Becton Dickinson 212750
Agar Becton Dickinson 214010
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Agarose Research Products International A20090
Blocking Reagent EMD Chemicals Inc. 69064
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-212
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher Scientific BP166-500
Tris Base Fisher Scientific BP152-5
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1
Escherichia coli BLT5403 EMD Chemicals Inc. BLT5403 Genotype: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicillin, Sodium Salt Research Products International A40040
Ethidium bromide Fisher Scientific BP102-1
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich Corp. A-9647
Penta-HIS primary antibody Qiagen Inc. 34660
Goat anti-mouse alkaline phosphatise conjugate Sigma-Aldrich Corp. A-5153
para-Nitrophenylphosphate Sigma-Aldrich Corp. N-7653
T7-UP primer EMD Chemicals Inc. 5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'
T7-DOWN primer EMD Chemicals Inc. 5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'
Qiaquick PCR Purification kit Qiagen Inc. 28104
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen Inc. 28706
Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Invitrogen Life Technologies 4336917
Heating Block Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) 18780
96-well Cell Culture Plates Corning Costar 3590
Isotemp Incubator Oven Fisher Scientific 516D
Pasteur Pipettes, 5 ¾ in Fisher Scientific 13-678-20A
ChromaView Transilluminator UVP Inc. TS-15
UV Shield Oberon 071AF
Gloves, Nitrile Fisher Scientific 19-170-010C
Sterile 1.5 ml tubes USA Scientific Inc 1615-5500
10 ml Borosilicate Pipettes Fisher Scientific 13-678-25E
Borosilicate culture tubes Fisher Scientific 14-961-27
Uniskan I, ELISA plate reader Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland Type 362

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
  2. Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
  3. Li, W. ORF phage display to identify cellular proteins with different functions. Methods. 58, 2-9 (2012).
  4. Willats, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).
  5. Konthur, Z., Crameri, R. High-throughput applications of phage display in proteomic analyses. Targets. 2, 261-270 (2003).
  6. Chen, T., et al. Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning. J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).
  7. Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).
  8. Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).
  9. Egli, D. B., Bruening, W. P. Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean. Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).
  10. Badotti, F., et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).
  11. Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display. Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).
  12. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).
  13. Gasser, B., et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).
  14. Daly, R., Hearn, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).
  15. Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).
  16. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
  17. Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).
  18. Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions. Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).
  19. Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production. Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).
  20. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 84، تقارب الاختيار، عرض فج، والتفاعل البروتين البروتين
بروتوكول لفج العرض وتقارب اختيار طريق الطعوم البروتين المؤتلف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kushwaha, R., Schäfermeyer, K.… More

Kushwaha, R., Schäfermeyer, K. R., Downie, A. B. A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits. J. Vis. Exp. (84), e50685, doi:10.3791/50685 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter