Vi beskriver en ikke-invasiv billeddannelse fremgangsmåde til at skelne inflammatoriske stadier. Systemisk levering af luminol afbilder områder med akut betændelse afhængige MPO aktivitet i neutrofiler. I modsætning hertil muliggør injektion af lucigenin til visualisering af kronisk inflammation afhængig PHOX aktivitet i makrofager.
Inflammation er et grundlæggende aspekt af mange menneskelige sygdomme. I denne video rapporter, viser vi non-invasive bioluminescens imaging teknikker, der skelner akut og kronisk inflammation i musemodeller. Med vævsskader eller patogen invasion, er neutrofile den første linje i forsvaret, spiller en stor rolle i formidlingen af den akutte inflammatoriske respons. Som den inflammatoriske reaktion skrider frem, cirkulerende monocytter gradvist migrerer ind i læsionsstedet og differentiere til modne makrofager, som medierer kronisk inflammation og fremme vævsreparation ved at fjerne vævsrester og producere anti-inflammatoriske cytokiner. Intraperitoneal injektion af luminol (5-amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-phthalazinedione, natriumsalt) muliggør påvisning af akut betændelse i vid udstrækning medieres af væv-infiltrerende neutrofiler. Luminol reagerer specifikt med superoxid dannes inden for de phagosomes af neutrofiler siden bioluminescens resultater fra en myeloperoxidase (MPO) medieret reaktion. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrat) også reagerer med superoxid for at generere bioluminescens. Men lucigenin bioluminescens er uafhængig af MPO og det udelukkende er afhængig af fagocyt NADPH oxidase (PHOX) i makrofager under kronisk inflammation. Sammen luminol og lucigenin tillade ikke-invasiv visualisering og langsgående vurdering af forskellige fagocyt populationer på tværs af både akutte og kroniske inflammatoriske faser. Grund af den vigtige rolle af inflammation i en række humane sygdomme, mener vi denne ikke-invasiv billeddannelse metode kan hjælpe undersøge differentielle roller neutrofiler og makrofager i en række patologiske tilstande.
Inflammation er en stærkt reguleret biologisk respons involveret i en række humane sygdomme, herunder mikrobiel infektion 1, sårheling 2, diabetes 3, kræft 4, hjerte 5 neurodegenerativ 6, og autoimmune sygdomme 7. Vævsinflammation kræver ordentlig koordinering af de forskellige immunceller for at opnå patogen clearance, væv reparation, og sygdom opløsning. Neutrofiler og makrofager er vigtige immune mediatorer af vævsinflammation. I den akutte fase af inflammation, er neutrofile de første respondenter til forskellige skadelige stimuli og vævsskader 8.. De neutrofile hurtigt ekstravasere fra cirkulation til stedet for skaden, hvor cellerne inaktivere invaderende mikrober ved at frigive antimikrobielle granulater og fagocytose. Under fagocytose opsluge neutrofiler invaderer mikrober i phagosomes, inden for hvilke celler producerer høje niveauer af Superoxide (O 2 · -). Phagosomal superoxid er den primære kilde til mange downstream reaktive ilt arter (ROS). For eksempel kan superoxid kan dismutated til hydrogenperoxid (H 2 O 2) ved spontan spaltning eller ved superoxiddismutase (SOD) 9, 10. Neutrofiler, yderligere myeloperoxidase (MPO) konverterer hydrogenperoxid til antimikrobiel chlorundersyrling (HOCI) 11. Da de inflammatoriske responser fortsætter, cirkulerende monocytter gradvist migrerer ind i læsionsstedet og differentiere til modne makrofager 2, hvis fagocytotisk funktion hjælpe med at fjerne inaktiverede patogener og cellerester. Hertil kommer, som en central regulator i den senere fase af inflammation makrofag fremmer væv reparation ved at producere anti-inflammatoriske cytokiner 12 og ved at skabe ekstracellulære ROS på et lavere niveau 9.. Den ROS genereret på dette senere tidspunkt regulerer vævsremodellering, nye fartøj dannelse, og reepitheliasering 13..
Fagocyt NADPH oxidase (phOx) er den primære kilde til superoxid produktion i både neutrofile og makrofager 9.. Phox er en multi-subunit kompleks hvis samling er stramt reguleret 9. Holoenzymet indeholder flere cytosoliske regulatoriske underenheder (P67 phox, P47 phox, P40 phox, og RAC) samt en membranbundet heterodimer cytochrom b 558 (bestå af underenhed CYBA og CYBB). Cytochrom bs 558 er reaktionen kerne, inden for hvilken CYBB underenhed (også kendt som P91 phox og NOX2) foretager den primære redox kædereaktion 9.. Interessant, dens montage sites er forskellige mellem neutrofile og makrofager. I hvilende neutrofiler, er cytochrom bs 558 meste til stede i membranen af intracellulære opbevaring granulat 14. Under fagocytose samle neutrofiler holoenzymes på phagosomes 9, hvor høje niveauer af MPO-aktivitet er også til stede. Neutrofil phOx hurtigt forbruger ilt og udøver sin mikrobicid magt ved ROS produktion, et fænomen kaldet respiratorisk burst 11.. I modsætning hertil har makrofager et lavere niveau af MPO udtryk og cytochrom b 558 er for det meste findes i plasmamembranen 15, 16. Således neutrofiler producerer høje niveauer af superoxid for anti-mikrobielle aktivitet, mens makrofager genererer mindre superoxid for regulerende funktioner 15.
Da inflammation er en indviklet in vivo-processen, vil non-invasive billeddiagnostiske metoder er specifikke for de forskellige faser af inflammation tillade kvantitative og langsgående vurdering af sygdomsmodeller. Brug mekanistiske undersøgelser har vi tidligere vist anvendelsen af to kemiluminescerende midler, luminol (5-amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-phthalazinedione) og lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrat)For ikke-invasiv billeddannelse af akutte og sene (kroniske) stadier af inflammation, henholdsvis 17. Luminol muliggør visualisering af neutrofil MPO aktivitet i den akutte fase af inflammation 18-20, hvorimod lucigenin bioluminescens kan anvendes til at vurdere makrofag aktivitet i forbindelse med den sene fase eller kronisk betændelse 17.. I dette manuskript, brugte vi to eksperimentelle betændelse modeller (sc PMA og SC LPS) til at vise disse billeddannende teknikker.
I denne rapport, viser vi en bioluminescence metode til ikke-invasiv billeddannelse af betændelse i levende dyr. At drage fordel af to selvlysende substrater, luminol og lucigenin kan fremgangsmåden skelne mellem forskellige faser af inflammation. Luminol bioluminescens er forbundet med neutrofiler i den akutte fase af inflammation, hvorimod lucigenin bioluminescens medieres af makrofager i den kroniske fase. Relativt lille (MW = 177,16 g / mol) og elektrisk ladet, kan luminol hurtigt ind både plasma og phagosomal me…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Nancy Lurie Marks Foundation. Vi takker Dr. Nancy E. Kohl for kritisk læsning af manuskriptet. Vi takker Kin K. Wong for hans assistance i udarbejdelsen af denne video rapport.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | P8139 | |
Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | L2012 | |
Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | A4685 | |
Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | M8010 | |
IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package | Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA |